木薯NAC转录因子Rd26基因克隆及表达

【目的】克隆木薯NAC转录因子Rd26基因(MeRd26)并检测其在干旱胁迫下的表达量,为Rd26基因抗旱调控机制研究打下基础。【方法】利用反RT-PCR克隆木薯叶片中的MeRd26基因,对其进行序列比对及系统发育进化树构建,研究其在栽培种Ku50和野生种W14间的变异情况,并用实时荧光定量PCR(q PCR)检测PEG-6000干旱胁迫下的MeRd26基因表达量。【结果】从木薯叶片中克隆获得的MeRd26基因,长度为1288 bp,包含1041 bp的开放阅读框,编码346个氨基酸,且含NAC保守结构域。系统发育进化树分析结果表明,MeRd26蛋白与杨树(Potri.011G123300.1)和杞柳(Sapur V1A.0127s0020.1)的Rd26蛋白亲缘关系较近。基因结构变异分析结果显示,MeRd26基因有33个SNP位点和7个In Del位点,且大部分变异分布在非编码区及最后一个外显子的后半区域。基因表达检测结果显示,在正常大田种植条件下,栽培种Ku50叶片的MeRd26基因表达量是野生种W14的130倍,但在根中表达量差异较小;在干旱胁迫下,栽培种Ku50未展开叶、老叶和根中MeRd26基因表达被快速诱导,表达量随胁迫时间的延长而增加,在根中表达量最高,但在第1片完全展开叶中,MeRd26基因的表达被抑制,其表达量明显降低。【结论】MeRd26基因在转录水平上参与了木薯抗干旱胁迫反应,可作为候选基因用于木薯抗旱机制研究。

柽柳rd22基因的序列分析及耐盐性研究

【目的】验证从抗逆植物柽柳中克隆得到的rd22基因的耐盐能力。【方法】采用根癌农杆菌介导法,对烟草进行rd22基因的遗传转化,将分子检测为阳性的6个转基因烟草株系和非转基因对照烟草的组培苗进行盐胁迫（NaCl浓度分别设为0（CK）,110,220和330 mmol/L）试验,通过观察相对电导率、SOD活性和相对生长量的变化,研究rd22基因的耐盐能力。【结果】生物信息学分析表明,来自柽柳的rd22基因属于BURP蛋白家族。分子检测证明,该rd22基因已整合到烟草基因组中,并在mRNA水平上有不同程度的表达。相对电导率和SOD活性分析表明,随着盐胁迫浓度的增加,各转基因烟草株系的相对电导率均呈上升趋势,且均小于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330mmol/L时,非转基因对照烟草的相对电导率高达16.49%,而各转基因烟草的相对电导率最大为14.91%。各转基因烟草株系的SOD活性也随着盐胁迫浓度的增加均呈上升趋势,且均大于对照烟草,在盐胁迫浓度达到330 mmol/L时,转基因烟草SOD活性是对照烟草的1.10~1.39倍。相对生长量分析表明,盐胁迫浓度达到110,220,330mmol/L时,各转基因烟草株系相对生长量均高于对照株系,非转基因烟草的相对生长量分别为59.92%,36.99%和12.72%,转基因烟草的相对生长量平均为67.00%,44.05%和17.47%。【结论】rd22基因的导入,提高了转基因烟草的耐盐性。

拟南芥rd29A基因启动子克隆及其在马铃薯抗胁迫转基因中的应用

从拟南芥 (Arabidopsisthaliana)基因组中用PCR技术分离了rd2 9A基因上游 82 4bp的调控序列 ,序列分析表明 ,该片段与已报道的rd2 9A启动子有 99 39%的同源性 ,包括缺水诱导表达元件DRE、ABA作用元件ABRE等顺式作用元件。将此片段与GUS基因连接构建了植物表达载体pBIrd ,用农杆菌介导法获得了转基因马铃薯植株。对转基因植株进行GUS基因Northern杂交和GUS活性组织染色的分析结果是一致的 ,未受诱导处理的转基因植株GUS基因有微弱表达 ,而 4℃低温逆境、10 0 μmol LABA、缺水和 2 5 0mmol LNaCl胁迫处理 2 4h均可诱导GUS大量表达 ,且rd2 9A启动子驱动的GUS基因表达无组织特异性。

西伯利亚蓼rd22基因的克隆与序列分析

以3%NaHCO3溶液胁迫处理48h的西伯利亚蓼为试材,利用RACE技术,从其茎部组织克隆了脱水应答蛋白RD22的全长cDNA序列。测序后的结果分析表明,该cDNA序列全长为1302bp,5′非翻译区为59bp,3′非翻译区为25bp,开放读码框为1218bp,编码405个氨基酸。在氨基酸序列的C端含有一个比较保守的BURP结构域,N端含有5个重复序列THV-VGKGGV-V。信号肽检测证明该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸区域为信号肽结构。其推演的氨基酸序列与葡萄的同源性最高,达到60%。该基因已在GenBank上注册,基因序列登录号为DQ836050。

转RD29A:DREB1A融合基因小麦的获得及其抗旱性研究

为了提高小麦的抗旱能力,通过转基因将拟南芥RD29A:DREB1A转入到小麦品种陇春30中,成功获得三个单拷贝本底DREB1A蛋白低表达水平的纯合转基因家系,并在干旱胁迫下测定了其生理指标及产量相关农艺性状。结果表明,与陇春30相比,转基因小麦的脯氨酸和可溶性糖含量以及SOD、CAT和POD活性都显著提高,H2O2含量、MDA含量和相对导电率均显著降低,株高、穗长、穗粒数、千粒重、地上生物量显著增加,说明RD29A:DREB1A外源基因的导入能够显著增强陇春30的抗旱性。

转rd29A基因国槐试管苗对盐胁迫的生理响应

以转rd29A基因国槐株系及其受体亲本植株为材料,在NaCl胁迫下,分别在处理后不同时间测定了耐盐生理指标。结果表明:在0.6% NaCl胁迫下,国槐植株内可溶性糖含量、脯氨酸含量,丙二醛(MDA)含量以及相对电导率都随NaCl胁迫时间的延长而增加;与受体亲本植株材料相比,转基因株系的可溶性糖和细胞膜稳定提高,丙二醛、脯氨酸含量降低。说明转rd29A基因的国槐植株耐盐性得到提高。

拟南芥rd29A基因启动子DNA片段的克隆、序列测定、分析

从拟南芥中分离到rd2 9A基因启动子DNA片段并克隆到 pMD 18克隆载体中 ,获得pRDP重组载体 ,将克隆测序 ,并对序列进行分析。

拟南芥干旱诱导型启动子RD29A驱动花生AhNCED1基因双元表达载体的构建

从拟南芥基因组中克隆RD29A基因5'-侧翼520bp启动子区域序列,生物信息学分析表明,该启动子片段中存在脱水胁迫响应元件(DRE)、ABA响应元件(ABRE)、TATA-box、CAAT-box等顺式作用元件。构建了干旱诱导型启动子AtRD29Ap驱动花生AhNCED1基因的植物双元表达载体pAtRD29Ap::AhNCED1。

原位双杂交法研究Rb、p16^(ink4)基因在非小细胞肺癌中的转录

目的 :探讨非小细胞肺癌组织中Rb、p1 6INK4 基因的转录。方法 :分别以Bio标记RbcDNA探针、Dig标记p1 6INK4 cDNA探针 ,进行mRNA原位双杂交。结果 :以Bio 辣根过氧化物酶 AEC系统检测Rb基因转录 ,阳性结果为红色 ,阳性率为 83 9% (2 6/3 1 ) ;以Dig 碱性磷酸酸酶 NBT/BCIP系统检测 p1 6INK4 基因转录 ,阳性结果呈蓝色 ,阳性杂交率为 77 4% (2 4/3 1 )。结论 :mRNA原位双杂交法具直观、适合少量细胞、能排除癌组织中混有间质细胞的影响、过程简便等优点 ,Rb、p1 6INK4

控制水稻红米性状相关基因分子标记的开发

红米因其独特的营养价值日益受到人们关注.红米由两对非同源染色体上的Rc、Rd显性基因控制,且Rc、Rd基因同时存在时,水稻才表现为红米表型.本研究分别在Rc和rc等位基因以及Rd和rd等位基因影响性状的关键性位点上建立了分子标记:Rc(+5150)和Rd(+276).检测结果显示:这2个分子标记可以分别用来区别控制红米性状的Rc/rc和Rd/rd基因型.开展本研究,为今后利用分子标记辅助快速有效地选育各类红米水稻新品种研究提供了重要的帮助.

敲除DWF4基因提高拟南芥对低温胁迫的抗性

以拟南芥类固醇类C22α-羟化酶基因DWF4的T-DNA插入缺失突变体dwf4为研究材料,通过观察突变体在低温胁迫条件下的表型,检测dwf4突变体和野生型在低温胁迫条件下的相对电导率、叶绿素含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量、抗冷基因表达量和过氧化物酶基因表达量的区别,探讨了该基因在抗低温胁迫反应过程中的功能。结果表明,敲除DWF4基因能够提高拟南芥对低温胁迫的抗性。dwf4突变体的抗低温胁迫能力一方面源于在低温胁迫下,与野生型相比,dwf4突变体中相对较低的电导率和较高的叶绿素含量,以及更多渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸的积累,另一方面源于低温胁迫条件下dwf4突变体中低温胁迫响应的下游基因RD29A及COR47的高表达。结果还表明尽管dwf4突变体中过氧化物含量增加,但是过氧化物酶基因Prx22与Prx698的高表达对过氧化物的毒害起到了很好的抑制作用。说明在拟南芥中DWF4负调控拟南芥对低温胁迫的反应过程。

利用农杆菌介导法获得转codA基因麻竹再生植株的研究

温度是影响植物生存和生长发育的基本环境因子之一。大多数植物对低温等都是高度敏感的,低温伤害现象尤为突出,几乎涉及所有的经济植物。因此,改善植物的抗低温冻害的胁迫能力,可以显著提高植物的生长范围、增加产量。codA基因可以增加植物对低温胁迫的耐受能力,而Rd29A是一种胁迫诱导特异表达启动子,胁迫条件可以快速诱导基因表达,也可以减少由于转基因过量表达带来的不利影响。研究以麻竹花药离体培养的愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法,探讨了影响麻竹愈伤组织遗传转化效率的主要因子。结果表明,潮霉素的最佳筛选浓度是25 mg.L-1,预培养时间为3 d,侵染时间为20 min,共培养时间为3 d,乙酰丁香酮的浓度控制在100 mg.L-1时可以有效的提高遗传转化效率。在此基础上对获得的转基因植株进行分子检测,初步表明外源基因codA已经整合到麻竹基因组中。

视网膜色素变性相关基因的研究进展

视网膜色素变性 (RP)是一组常见遗传性致盲眼底病。本文从分子生物学的角度探讨了目前研究较多的

原发性视网膜色素变性家系的RDS基因Pro216 Leu突变及其表型研究

目的 研究原发性视网膜色素变性 (retinitispigmentosa ,RP)家系中缓慢型视网膜变性(retinaldegenerationslow ,RDS)患者的RDS基因突变与临床表型的关联 ,以探讨RP的发病机制。方法对来自同一家系的 2例RP患者及 2例正常人外周血DNA进行分子遗传学分析 ,采用聚合酶链反应(polymerasechainreaction ,PCR)及限制性片段长度多态性 (restrictionfragmentlengthpolymorphism ,RFLP)技术 ,筛查RDS基因突变 ,对有突变的RDS基因片段进行克隆测序及分析 ,同时进行家系分析及眼部临床检查。结果 来自同一家系的 2例RP患者均查出有RDS基因 2 16密码突变 ,而 2例正常人未查出上述突变。经测序证实RDS基因 2 16密码子的第 2个核苷酸出现了C→T的突变 (Pro2 16Leu)。RDS基因Pro2 16Leu突变的眼部临床表型为视力损害严重的弥漫型RP ,伴有黄斑部病变。结论 中国人RP患者存在RDS基因Pro2 16Leu突变 ;其眼部表型为弥漫型RP伴有黄斑部病变。

RD105基因缺失法鉴定95株结核分枝杆菌北京基因型及其耐药相关性分析

目的鉴定吉林省结核分枝杆菌(MTB)中的北京基因型及其与耐药性的关联。方法 95株结核分枝杆菌分离自2008-2009年吉林省临床肺结核病人的痰液标本,培养方法为改良酸性罗氏(L-J)培养基。分离出的抗酸杆菌经对硝基苯甲酸(PNB)培养基初步鉴定后选出结核分枝杆菌复合群并应用比例法进行药敏试验(DST)。北京基因型的鉴定采用RD105基因缺失法。实验结果应用Epi Info统计软件和卡方检验进行分析。结果 95株结核分枝杆菌中,北京基因型占88.4%(84/95)。北京基因型中,异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素和氧氟沙星的耐药率分别为31.7%、23.2%、15.9%、31.7%、13.4%和18.3%,均位于非北京基因型菌株耐药率的95%置信区间内。北京基因型中的多重耐药(MDR)结核(TB)率占19.5%,通过卡方检验与非北京基因型中的MDRMTB进行比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 RD105基因缺失法是鉴定MTB北京基因型的简便、有效方法;北京基因型为吉林省结核分枝杆菌的优势株;北京基因型与非北京基因型耐药率无统计学意义上的差别。

极端耐盐植物盐穗木脱水胁迫响应基因Rd22的克隆及表达分析

目的:选择合适的标记基因用于检测胁迫处理盐穗木的有效性。方法:根据NCBI同源序列比对设计简并引物,通过RT-PCR从盐穗木(Halostachys caspica)中克隆获得盐穗木脱水胁迫响应基因Rd22(HcRd22)基因,并采用实时定量PCR技术检测其逆境胁迫下的表达规律。结果:最终扩增获得301bp盐穗木HcRd22核酸序列,NCBI和clustalwz序列比对分析表明HcRd22具有BURP结构域。400 mmol/L盐胁迫和50μmol/L ABA处理分别使HcRd22的基因表达量在处理12h上调2.5倍和3倍。结论:所克隆的HcRd22基因属于盐胁迫和ABA处理的响应基因,可作为今后研究盐穗木胁迫处理的标准基因。

RD105基因缺失法和双重PCR法对125株结核分枝杆菌菌株基因分型检测

目的为明确比较RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力,同时掌握辽宁地区结核杆菌中北京家族菌株的流行情况而进行该项研究。方法选取2011—2013年间辽宁省内各地市临床分离菌株,随机抽取经传统方法菌种鉴定为结核分枝杆菌的菌株,共计125株。选用超声破碎法提取菌株DNA,应用RD105基因缺失法和双重PCR法,同时对收集到的125株结核分枝杆菌进行特异性扩增,最后使用琼脂糖凝胶水平电泳对扩增的结果进行判断。结果两种方法判断标准为:RD105基因缺失法结果中,出现283 bp大小片段的为北京家族菌株,不出现特异性条带的为非北京家族菌株;双重PCR法结果中,只出现393 bp大小片段的为北京家族菌株,而只出现570 bp大小片段为非北京家族菌株。使用上述两种方法鉴定本研究的125株结核分枝杆菌,结果完全相同,其中北京家族菌株有110株(88%),非北京家族菌株有15株(12%)。结论 RD105基因缺失法和双重PCR法对辽宁地区结核分枝杆菌中北京家族菌株的检测能力相当,并且北京家族菌株在辽宁地区流行的结核分枝杆菌中为绝对优势株;两种方法相对于传统的Spoligotyping法更简单、更省时,检测成本也较低,更适合在我国多数实验室推广应用。

四倍体刺槐、国槐和红叶石楠对根癌农杆菌菌株及不同抗生素敏感性研究

以含有RD29A目的基因和NPTⅡ筛选基因的根癌农杆菌菌株LBA4404、GV3101和EHA105侵染饲用型四倍体刺槐(Robinia pseudoacacia)、国槐(Sophora japonica L.)和红叶石楠(Davidson Photinia)的组培苗叶片,研究3个树种对根癌农杆菌菌株和不同抗生素(替门汀和头孢霉素)的敏感性、以及根癌农杆菌菌株对3个树种的侵染能力。结果表明,不同树种、不同根癌农杆菌株和不同抗生素种类均对转化效果产生明显影响,红叶石楠是最佳受体材料,3个菌株侵染后的平均抗性愈伤率为37.0%,其次为国槐,四倍体刺槐最低;根癌农杆菌菌株LBA4404侵染能力最强,3个树种的平均抗性愈伤率达到33.3%、平均分化率达到17.6%;替门汀对农杆菌侵染后的红叶石楠组培叶片抑菌效果最好。

Stargardt病相关致病基因的研究进展

Stargardt病（STGD）是一种黄斑营养不良性遗传性疾病,多见于青少年时期发病,尚无有效治疗法.近年来,对STGD致病基因的研究有了新的进展,现已发现4个染色体区段与本病相关,并将本病的致病基因已被克隆,通过体外表达研究相关蛋白突变体的性质.对于ABCR基因、Rim蛋白（RmP）、RDS基因、ELOVL4基因致病基因的结构、突变功能、蛋白突变体及其发病机制的研究目前已有了新的进展作一综述.

4种基因与视网膜色素变性危险因素交互作用分析

【目的】探讨SAG、TULP1、RDS、PRPF31基因与视网膜色素变性交互作用的关系,为视网膜色素变性的病因学研究、预防与延缓发展提供理论依据。【方法】通过4种易感基因进行筛查确定的5个等位基因,应用单纯病例组Logistic回归设计,分析4种基因与视网膜色素变性危险因素的交互作用。【结果】SAG基因rs1046974和PRPF31基因rs460824与食用鱼类食物存在交互作用(P=0.020,P=0.017),TULP1基因rs2064318和rs9380516及RDS基因rs434102与近亲结婚史、家族遗传史、吸烟饮酒、其它富含维生素A食物、精神状态均不存在统计学意义的交互作用(P>0.05)。【结论】SAG基因rs1046972、PRPF31基因rs460824与食用鱼类食物存在有统计学意义的交互作用(P<0.05)。