人乳头状瘤病毒亚型PCR/RDB基因分析方法的建立及初步评价

目的建立一种基于PCR和RDB技术的临床实用、价格低廉、能对目前已知的绝大多数高危型及常见的低危型人乳头状瘤病毒(HPV)进行基因分型的检测方法(PCR/RDB法),并对该方法用于HPV分型检测做出方法学评价。方法根据HPV基因序列设计可扩增包含目前常见的HPV型别的通用引物,并根据14种HPV高危亚型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68)和7种低危亚型(6、11、42、43、44、53、CP8304)的序列特点设计针对这21种HPV型别的型特异性探针。21种HPV亚型标准毒株PCR产物与HPV型特异性探针进行杂交,建立一次性对21种HPV亚型进行分型的PCR/RDB检测方法。将PCR/RDB法用于213例经杂交捕获法(hybird capture,HCⅡ)检测为高危型HPV阳性样本的HPV型别诊断。结果建立的PCR/RDB法均能鉴定出21种HPV亚型,无假阳性和假阴性结果,未出现交叉反应;含有相当于10个以上HPV分子的质粒标准品均能成功获得PCR产物检测的阳性结果;盲法分析结果显示,195例经HCⅡ法检测为高危型HPV阳性的样品被PCR/RDB检测出具体的HPV型别,共检测出13种高危型HPV亚型,检出率分别是32.31%(16型)、23.08%(52型)、17.95%(58型)、11.79%(31型)、10.26%(68型)、9.74%(33型)、8.21%(18型)、6.15%(66型)、3.08%(59型)、2.05%(45型)、2.05%(39型)、1.54%(56型)、1.03%(51型)。单一HPV亚型感染及2种、3种和4种HPV亚型混合感染构成比分别为59.46%、30.81%、8.65%和1.08%。18例未能检测出HPV的具体型别,PCR/RDB法与HCⅡ法的高危型HPV检测结果的符合率为91.5%(195/213)。结论PCR/RDB法与HCⅡ法高危型HPV检测阳性符合率高,并可一次性分析出21种HPV型别,是一种准确、高效、经济的HPV型别检测方法,可用于HPV的常规基因型分型诊断及人群筛查。

PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因结果分析

目的探讨PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因的特异性和敏感性。方法选取在我院体检的50例β-地中海贫血基因携带者,随机分为两组各25例,对照组采用RDB技术检测,观察组利用PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因携带者标本,比较两组患者的检测结果并进行统计学分析其特异性和敏感性。结果观察组患者在β-地中海贫血患者中,有11例患者β41-42(-TCTT)发生突变,约占44%,6例患者IVS-Ⅱ654(C→T),约占24%,还有3例患者β17(A→T)发生改变,约占12%;TATA盒-28(A→T)的有2例,约占8%;β71-72(+A)者1例,占4%;无法检测的有2例,约占8%。对照组检测率分别为32%、16%、12%、4%、8%和28%,两组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 PCR联合RDB技术检测β-地中海贫血基因与单用RDB技术检测相比较具有更高敏感性、特异性;同时联合检查具有高通量和快速的特点,可同时检测5个已知突变或未知突变;此外联合检查还可以进行质量控制,与传统检测方法相比具有成本低的优势。

基于PCR-RDB法对陕西地区HCV基因型别的研究

目的探讨聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)-反向点杂交法(reverse dot blot,RDB)在陕西地区丙型肝炎病毒基因分型中的应用。方法选取陕西地区610例丙型肝炎患者,利用PCR-RDB法进行丙肝病毒基因型检测,并使用SPSS对检测结果进行统计学分析。结果 610例丙肝患者检出1b型273例(44.75%),2a型286例(46.89%),3a型30例(4.92%),3b型11例(1.80%),6a型10例(1.64%);各基因型间的患者性别比例的差异具有统计学意义(P<0.05);与其他基因型别相比,HCV 3a型患者年龄水平最低,差异显著(P<0.05)。结论陕西地区丙肝病毒以2a、1b型为主,患者性别及年龄与所感染HCV型别有关联性;PCR-RDB技术在丙型肝炎病毒基因分型中的应用有利于HCV分型在临床上的推广。

PCR—RDB判断HPV分型在宫颈癌的早期诊断价值

目的：通过对人乳头瘤病毒（HPV）分型采用PCR-反向点杂交法（PCR—RDB）进行检测，探析该法在宫颈癌（SCC）的早期诊断中的临床价值。方法：分析2013年6月至2015年6月在我院门诊部就诊的166例SCC患者的临床资料。根据检测方式的不同将入选者分成观察组（HPV分型联合TCT检测，166例）和对照组（TCT检测，166例）两组。比较不同检测方案的检测结果以及两组患者的检测结果。结果：HPV阳性检出率为33．1％（55／166）：TCT的阳性检出率为30．1％（50／166），116例TCT阴性患者中HPV阴性者97例，阳性者19例，HPV阳性率是16．4％；50例TCT阳性病例中HPV阴性者18例，阳性者36例，HPV阳性率是72．0％。病理检测的阳性率为21．7％（36／166），其中HPV阳性患者31例，阴性患者5例，即HPV阳性率是86．1％。观察组的特异度为97．0％（128／132），灵敏度为88．6％（31／35），Youden指数是0．856；对照组特异度92．2％（107／116），灵敏度为49．0％（25／51）。Youden指数是0．412。观察组的真阴性和真阳性结果均比对照组优秀，差异显著（P〈0．05）。结论：HPV分型采用PCR-反向点杂交法检测可以使TCT检测的特异度和灵敏度显著提升，对早期诊断SCC有重要意义。

利用PCR结合膜芯片技术检测结核分支杆菌的实验研究

目的:探讨聚合酶链反应(PCR)结合膜芯片技术用于检测结核分支杆菌的方法。方法:标记生物素的特异性引物,扩增17株菌标本IS6110插入序列的245bp目的基因,结合膜芯片杂交检测结核分支杆菌基因。结果:15株结核分支杆菌标本中有12株扩增出245bp目的基因,2株大肠杆菌及阴性对照标本PCR扩增结果为阴性。经膜芯片杂交,12株结核分支杆菌标本中有11株显色结果为阳性,其余显色结果为阴性。PCR结合膜芯片检测结核分支杆菌的灵敏度为73.3%,特异度为100%。结论:PCR结合膜芯片技术是一种具有发展潜力的检测结核分支杆菌的方法。

不同原理的PCR方法用于地中海贫血产前诊断的验证应用

目的:评估两种不同技术原理的PCR方法用于地中海贫血(下称"地贫")产前诊断的必要性和可行性。方法 :采用双盲法,对509份产前诊断标本分别采用单管多重PCR法(single-tube multiplex PCR,STMP)+反向点杂交法(reverse dot blot,RDB)、探针熔解曲线法(probe melting curve assay,PMCA)检测常见α-地贫和β-地贫基因突变。两种方法所得结果不一致或少见类型地贫突变时,采用DNA测序分析法确诊。所有产前诊断结果均进行验证或随访。结果 :经STMP+RDB、PMCA检测突变谱不同,α-地贫和β-地贫各有1例结果不同。另STMP+RDB检测灵敏度高于PMCA,其差异性在标本受母血污染时有提示作用。结论:两种不同技术原理的PCR方法进行地贫产前诊断,是必要和可行的,两者具有互补性,可确保结果的可靠性和减少单一技术的缺陷。

用PCR-反向点杂交法检测九江地区乙型肝炎病毒基因型

目的调查九江地区乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)基因型的分布情况。方法采用PCR-反向点杂交法,对203例HBV DNA阳性患者HBV进行基因型分析。结果共检测了203例患者,成功分型199例,占98.03%。其中B型160例,占78.82%;C型24例,占11.82%;B、C混合型14例,占6.90%;D型1例,占0.49%。结论利用PCR-反向点杂交法技术可以较简便地对HBV进行基因型分析,分型成功率高,适用于临床检测;在九江地区人群中感染的HBV以B型为主,C型次之,其它型别极少见。

PCR-反向点杂交法检测凉山州乙型肝炎病毒基因型

目的调查凉山州乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因型的分布情况。方法采用PCR-反向点杂交法(polymerase chain reaction-reverse dot blot,PCR-RDB)对44例HBV DNA阳性患者HBV进行基因型分析,并选取6例健康人作为对照。结果共检测了44例患者,成功分型38例,占86.36%,其中B型23例,占52.27%,C型13例,占29.55%,B、C混合型1例,占2.27%,未知型7例,占15.91%。结论利用PCR-RDB可以简便地对HBV进行基因型分析,分型成功率较高,适用于临床检测。在凉山州乙型肝炎人群中感染的HBV以B型为主,C型次之,其他型别极少见。

佛山地区孕产妇G6PD基因缺陷调查及干预模式研究

目的：调查佛山地区孕产妇葡萄糖‐6‐磷酸脱氢酶（G6PD ）缺陷状况，探讨干预指导模式的效果。方法选择2013年4～12月到该院产检的孕产妇及其丈夫各1646例，以反向膜杂交法检查夫妇双方的G6PD基因、以生化仪法检测G6PD活性，分析两性基因突变率、酶活性缺陷率，给予遗传咨询指导并跟踪随访新生儿G6PD基因突变与酶活性低下情况。结果 G6PD基因突变率男性4．7％，女性2．3％；G6PD酶活性缺陷率男性3．5％，女性1．6％；G6PD 基因突变发生较高的位点是 G1376T （36．2％）、G1388A （21．6％）、A95G （13．7％）和 G1024T （11．2％）。结论佛山地区是G6PD缺陷高发地区，G1376T、G1388A、A95G和G1024T是主要的点突变类型。

乙型肝炎病毒基因分型及其与肝脏疾病的关系

目的调查川南地区乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因型的分布,探讨其临床价值。方法采用PCR-反向点杂交法对172例HBV病毒载量≥1.00×104IU的乙肝患者进行HBV基因分型,了解基因型在不同临床类型肝病中的分布及其与患者肝功能、HBV病毒载量、年龄、性别之间的关系。结果①共检测了172例患者,成功分型166例,占96.51%。其中B型98例,占56.98%;C型60例,占34.88%;B/C混合型8例,占4.65%;未知型6例,占3.49%;②B型多见于无症状乙肝病毒携带者(ASC,占59.18%);在急、慢性肝炎(AHB、CHB)、肝硬化患者(HC)、肝细胞癌(HCC)等疾病中,C基因型比例明显高于ASC(P<0.05),但几者之间差异无显著性(P>0.05);③C基因型患者年龄高于B基因型患者(P<0.05);C基因型患者肝功能指标ALT、TBiL均高于B基因型患者(P<0.05),但GGT、HBV载量、性别比差异无显著性(P>0.05)。结论川南地区乙型肝炎病毒基因型以B型为主,C型次之,B型和C型共占91.86%,其他型别偶见;C基因型可能与乙肝患者肝功能损害和严重肝脏疾病的发生有关而与患者性别、HBV病毒载量高低无关。

云南省西双版纳州傣族G6PD缺陷症发生率及突变谱研究

目的了解云南省西双版纳州傣族人群的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症的发生率及基因型。方法在2012年8月至2013年9月期间,用荧光斑点定性法对812例傣族居民进行G6PD缺乏筛查。用反向斑点杂交芯片和PCR-DNA测序法分析G6PD缺乏症的标本的基因型。结果云南西双版纳州傣族人群的G6PD缺乏症总发生率为9.73%(79/812),其中男性32例(9.07%,32/353),女性47例(10.24%,47/459)。79例初筛G6PD缺乏标本65例检测出有突变,共检出8种基因突变类型,含16例1376 G>T(24.24%)、10例1311C>T(15.15%)、9例1388 G>A(13.63%)、7例392 G>T(10.60%)、6例95 A>G(9.09%)、5例1360C>T(7.57%)、2例871 G>A(3.03%)、1例1024C>T(1.52%),和6种复合突变包括2例G871A/C1311T(3.03%)、2例G392T/G1376T(3.03%)、2例G392T/G1388A(3.03%)、1例C1024T/C1311T(1.52%)、1例C1311T/G1376T(1.52%)、1例C1311T/G1388(1.52%)。结论云南西双版纳州傣族G6PD缺乏症检出率高,最常见的三种基因型是G6PD1376 G>T、1311C>T和G6PD1388 G>A。在西双版纳地区当地开展G6PD缺乏症的新生儿筛查、产前筛查和遗传咨询是非常有必要的。

深圳市宝安区妇女人乳头瘤病毒感染现状及影响因素分析

目的：了解深圳市宝安区女性宫颈人乳头瘤病毒（HPV）感染及基因分型情况，探讨影响HPV感染的相关因素，为本地区更有效地开展宫颈癌防治提供依据。方法：采用聚合酶链式反应一反向斑点杂交法（PCR—RDB）对2015年1～12月自愿参加宫颈癌筛查的1652例女性进行23种HPVDNA检测，同时对筛查对象的一般情况进行问卷调查。结果：1652例筛查对象中，HPV阳性266例，阳性率为16．10％，其中61例为混合型感染。高危型HPV感染最常见的亚型为HPV52、HPV16亚型，低危型HPv感染最常见的亚型为HPV43亚型。单因素分析结果示：年龄、户籍类型、文化程度、家庭经济收入、初次性行为年龄、初产年龄、怀孕次数、性伴侣数、伴侣性伴侣数为HPV感染的影响因素（P〈0．05）。多因素非条件Logistic回归分析结果表明：家庭经济收入、初次性行为年龄、怀孕次数、性伴侣数为影响HPV感染的危险因素（P〈0．05）。结论：HPV感染多见于家庭月平均收入低，初次性行为年龄早，怀孕次数多，性伴侣数多的女性人群，应重视对此类人群的筛查。

桂西地区869例慢性乙型肝炎病毒基因分型与耐药突变分析

目的乙型肝炎病毒(HBV)基因型及耐药突变情况与疾病进展和药物疗效密切相关,有效开展其测定具有重要意义。文中旨在检测桂西地区869例HBV的基因型及耐药突变基因,为临床抗HBV治疗提供依据。方法收集2016年1月至2018年3月右江民族医学院附属医院感染性疾病科门诊及住院的来自桂西地区且HBV DNA>1.0×103IU/mL的869例慢性乙型肝炎病毒携带(CHB)患者。采用PCR和反向点杂交法技术检测其HBV基因分型与耐药突变情况。结果共检出7种基因分型,分别为B基因型304例(34.98%),C基因型268例(30.84%),D基因型147例(16.92%)及B+C基因型、B+D基因型、C+D基因型、B+C+D基因型。63例患者发生耐药突变,耐药突变率为7.25%,其中C基因型31例(49.21%),B基因型19例(30.16%);突变模式有rt204I、rt181V、rt236T、rt180M+rt204V+rt204I等14种,其中rt180M+rt204V突变频率最高(17.46%)。B、C基因型的总体突变率(19%、31%)差异有统计学意义(P<0.05)。结论桂西地区CHB患者HBV基因型多样,主要以B、C基因型为主,且耐药突变率较高,突变模式复杂,这一结果为桂西地区临床抗HBV治疗提供了依据。

铜陵地区乙型肝炎病毒基因型分布与临床的相关性研究

目的 了解铜陵地区乙型肝炎病毒（HBV）基因型分布,分析该地区HBV不同基因型别与肝功能损害、病毒复制水平及血清标志物的关系,探讨不同基因型的临床意义.方法 采用聚合酶链式反应-反向点杂交法（polymerase chain reaction-reverse dot blot,PCR-RDB）对铜陵地区228例ABV阳性感染者的血清分别进行HBV基因型的分型、HBV-DNA载量以及HBV血清标志物和肝功能等的检测,并结合其指标进行相关性分析.结果 在228份患者的血清样本中,226份样本成功分型,其中B型54.4％（124/228）,C型37.3％（85/228）,B/C混合型7.5％（17/228）,2例未检出占0.88％（2/228）.在各临床分型的慢性HBV感染者中,B基因型在慢性乙型肝炎组（CHB）、肝硬化组（LC）和原发性肝细胞癌组（HCC）中的构成比依次为61.8％,36.4％和60％,C基因型依次为25.7％,63.6％和40％,B型在CHB组占优势（χ^2=19.253,P=0.001）;C型在LC组占优势,差异有统计学显著性意义（χ^2=9.818,P＜0.001）.C基因型HBV-DNA载量明显高于B型及B/C混合型,差异具有统计学非常显著性意义（P＜0.01）.在不同基因型HBV患者中,除了性别,男性高于女性外,患者的生化指标经方差分析各组差异均无统计学显著性意义（P＞0.05）.结论 铜陵地区HBV基因型主要以B型为主,对HBV基因分型有助于了解患者的病情,对HBV感染患者的临床诊治具有重要指导意义.

贵州西江苗族β地中海贫血筛查及基因分析

目的 对贵州省西江苗族进行了一次大样本的 β地中海贫血筛查及基因分析。方法 采用 Hb F和Hb A2 定量测定对人群进行 β地中海贫血初筛 ,然后用常规酚—氯仿抽提法提取 β地中海贫血携带者 DNA,再经PCR—反向点杂交法对β珠蛋白进行突变基因分析。结果 在受检的 890人中 ,共检出β地中海贫血携带者 37例 ,发生率为 4.16 %。经基因分析该地人群的β地中海贫血基因突变类型主要为 CD41 - 4 2 (TCTT)移码突变(5 4.1% )和 CD1 7(A→ T)无义突变 (4 5 .9% )。结论 完成对贵州西江苗族进行的β地中海贫血调查 ,获取其流行病学资料及其基因类型特征 ,对该地人群进行婚姻指导、产前诊断。

少数民族β-地中海贫血基因突变型分布特点

目的 了解 β-地中海贫血在贵州省苗族、水族、瑶族中的基因突变型特点、基因型频率及分布规律。 方法 采用“红细胞休克 -管定量法”测定红细胞脆性 ,HbF和HbA2定量等方法对人群进行 β -地中海贫血初筛 ,用常规酚 -氯仿抽提法提取 β地中海贫血携带者DNA ,经PCR -反向点杂交法对β株蛋白进行突变基因分析。 结果 受检 2 5 6 6人中 ,共检出 134例 β -地中海贫血携带者 ,总检出率为 5 2 2 % ,其中苗族、水族、瑶族检出率分别为 4 72 % ,6 0 6 % ,4 4 5 %。经β珠蛋白突变基因分析 ,在这 3个民族中仅检出两种中国人常见突变型CD41-42 和CD17,检出率分别为 88 1% ,6 0 0 % ,2 3%。结论 在贵州省少数民族中 β -地中海贫血有很高的发病率 ,基因突变类型具有显著的民族特征 。

广西柳州市常住人口β-地中海贫血的基因型及其分布

目的了解柳州市常住人口β-地中海贫血基因类型及分布情况。方法应用聚合酶链反应结合反向点杂交技术(RDB-PCR),对329例经筛查至少符合HbA2增高、HbF增高或Hb电泳分析发现HbE三项之一的样本进行中国人常见的17种β-地中海贫血突变基因检测。结果在受检的329例样本中,共检出杂合子310例、纯合子或双重杂合子19例。检出41-42、654、-28、71-72、17、βE、27-28、IVS1-1、43、-29、CD30(A→G)等11种突变类型及22种基因组合类型,以41-42、17、-28、βE、654、71-72杂合突变类型为主,依次占41.03%、30.70%、7.29%、4.86%、4.26%、2.74%。结论柳州市常住人口β-地中海贫血基因型以中国人发病率高的突变类型为主,发现稀见突变类型病例。突变类型的分布与别的省市小有差异。

基于PCR-RDB的地中海贫血基因复合型检测方法的临床应用

目的探讨基于PCR结合反向斑点膜杂交技术(PCR-RDB)的地贫基因复合型检测方法的准确性、稳定性、临床应用优势及前景。方法收集165份已知不同地贫基因型和地贫阴性血液标本,采用基于PCR-RDB的地贫基因复合型检测方法进行检测;另外与现有临床地贫基因分开检测的方法进行对比实验,采用两种方法同时检测300例血液和干血斑标本。结果 165份血液标本的PCR-RDB复合型检测方法的结果和已知基因型完全一致。两种方法对比实验的检测结果也完全一致。300份临床标本中检测结果为:地贫阴性标本235例,占78.3%;地贫阳性标本65例,占21.7%,阳性标本中缺失型α地贫33例,非缺失型α地贫2例,β地贫25例,α地贫复合β地贫标本5例。结论基于PCR-RDB的地贫基因复合型检测方法可以准确、稳定性地进行地贫缺失型突变和点突变的检测,具有实验操作更加简捷和方便等优点,并提高了检测通量,在临床和地贫防控工作中将得到广泛的推广应用。

贵州江口土家族β-地中海贫血筛查及基因分析

目的分析贵州省江口县土家族人群β-地中海贫血(β-thalassemia)的发病状况、基因突变类型及特点。方法随机选取贵州省江口县太平乡土家族居民485名,抽取静脉血,采用血红蛋白电泳分析法、一分钟碱变性法初筛β-地中海贫血阳性参考指标,同时应用全自动血细胞分析仪进行红细胞计数(RBC)等7项血液学指标分析;用常规酚-氯仿抽提法提取筛检阳性者DNA,经PCR/反向斑点杂交(PCR/RDB)技术确定基因突变类型。结果江口县土家族人群中,共检出β-地中海贫血杂合子携带者13例,检出率为2.68%。基因分析显示,该人群β-地中海贫血基因突变类型主要为CD41-42(TCTT)移码突变9例,占69.2%,CD17(A→T)无义突变3例,占23.1%和βE(Codon26)1例,占7.7%。结论贵州省江口土家族β-地中海贫血具有自身特点,检出率较高,可能与当地土家族通婚区域半径小有关,应深入研究该地区β-地中海贫血患病特征,指导当地积极预防该病,提高少数民族人口素质。

侗族人群β地中海贫血的调查

目的 了解贵州从江县侗族人群 β地中海贫血的发病状况、基因突变类型及特点。方法 抽取受检者静脉血 ,应用HbF和HbA2 定量测定对人群进行 β -地中海贫血初筛 ,同时应用全自动血细胞分析仪进行红细胞计数(RBC)、血红蛋白测定 (Hb)、红细胞比容测定 (HCT)、平均红细胞体积 (MCV)、平均红细胞血红蛋白量 (MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度 (MCHC)、红细胞分布宽度 (RDW )等 7项血液学指标分析 ,然后用常规酚 -氯仿抽提法提取受检者DNA ,经PCR -反向点杂交法对β珠蛋白基因进行突变分析。结果 从江县侗族人群中 ,β地中海贫血的检出率为7 85 % ,检出CD41-42 (TCTT)移码突变 (9例 ,2 3% )和CD17(A→t)无义突变 (30例 ,77% ) 2种基因突变类型。结论 该地区侗族人群中β地中海贫血患病率较高 ,β珠蛋白基因变异情况独特 ,可能与族内婚配、家族发病聚集性和通婚地理半径狭小有关。