RDPCR检测DNA损伤定位于核苷酸水平的研究

目的简化RDPCR建立程序,并在核酸序列水平精确定位DNA损伤。方法培养TK6细胞,抽提基因组DNA,制备k-ras基因外显子2的单链探针。扩增k-ras基因外显子2(以下称短片段)。酶切短片段和基因组DNA构建损伤模型,前者经依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)扩增,每一步产物作凝胶电泳,终产物与单链探针杂交显色,并进行测序;后者以短片段建立的实验条件进行RDPCR扩增,产物与单链探针杂交显色,并进行测序。结果凝胶电泳可见酶切短片段在RDPCR中每一步骤的目的产物条带;酶切短片段和酶切基因组DNA的RDPCR产物均在相应位置出现杂交条带,测序证实损伤均位于HinfI在k-ras外显子2上的酶切位点。结论短片段建立RDPCR的实验条件简单易行;并首次利用RDPCR检测DNA损伤精确定位于核酸序列水平的碱基位置。

氯乙酸类饮水氯化消毒副产物对大鼠p53基因的损伤作用研究

目的检测二氯乙酸和三氯乙酸对大鼠p53基因的DNA损伤作用,证实其遗传毒性并探讨其致癌作用的分子机制。方法将二氯乙酸、三氯乙酸腹腔注射染毒SD大鼠,提取肝组织DNA,应用依赖随机化末端连接物PCR技术检测其对大鼠p53基因外显子7的DNA损伤作用。结果在DCA染毒组检测出2条杂交条带,表明DCA可引起大鼠肝组织p53基因外显子7的损伤,有2个位点。未检测到TCA对大鼠p53基因的损伤作用。结论二氯乙酸的致癌作用可能与损伤p53基因有关,RDPCR技术检测靶组织p53基因的损伤作用与大鼠致癌试验的结果有很好的一致性。

应用依赖随机化末端连接物聚合酶链反应技术研究重铬酸钾对大鼠肺p53基因DNA损伤

应用依赖随机化末端连接物PCR(RandomizedTerminalLinker-dependentPCR ,RDPCR)技术于体内试验的研究 ,从而检测特定基因的DNA损伤。腹腔注射重铬酸钾染毒大鼠 ,提取肺组织基因组DNA ,经p5 3基因外显子 7特异性引物P1重复直线延伸后与接头 (Linker)连接 ,用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR扩增 ,电泳、转印 ,再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果显示 ,在 2 0 .0mg kg和 40 .0mg kg剂量下 ,出现了两条清晰的杂交带 ,表明重铬酸钾可引起大鼠肺p5 3基因外显子 7的DNA损伤 ,且有两个损伤位点。此结果有助于进一步探讨六价铬化合物的致突变机制 。

联苯胺对k-ras基因DNA损伤位点研究

目的在核酸序列水平定位检测联苯胺对k-ras基因的DNA损伤。方法联苯胺染毒TK6细胞,提取基因组DNA,制备k-ras基因外显子2的单链探针,应用依赖随机化末端连接物PCR进行Southern blot杂交,对产物进行测序分析。结果联苯胺染毒剂量100μmol/L检测到较k-ras外显子2短的一条清晰的杂交条带,测序结果表明linker与k-ras外显子2的第66位碱基T发生连接。结论首次证实联苯胺可引起k-ras外显子2发生DNA损伤,该损伤位点位于k-ras外显子2的第65位碱基G,可能是联苯胺重要的致癌作用靶点。

重铬酸钾致N-ras基因DNA损伤作用研究

目的 研究重铬酸钾对N -ras基因的DNA损伤作用,探讨其致癌作用分子机制。方法 制备N -ras基因外显子1单链探针;重铬酸钾染毒细胞提取基因组DNA ,再经RDPCR扩增后与探针杂交显色。结果 重铬酸钾染毒剂量10 0 μmol L可检测到DNA损伤片段杂交条带,其损伤片段长于完整的N ras基因外显子1;更高剂量(10 0 0 μmol L)未能检测出DNA损伤作用。结论 重铬酸钾可能造成N- ras基因外显子1上游序列DNA损伤,且该损伤作用可能正是其致癌作用分子机制的关键所在。

联苯胺对大鼠P53基因损伤作用及器官特异性研究

目的探讨联苯胺对大鼠作用的主要靶器官及其遗传毒性作用机制。方法将联苯胺腹腔注射染毒SD大鼠,提取肝、肺、肾及膀胱组织的DNA,运用单链探针依赖随机化末端连接物聚合酶链反应(RDPCR)技术检测其对大鼠P53基因外显子7的DNA损伤作用。结果杂交显色后在大鼠肝、膀胱、肺组织检测到了杂交条带,而肾组织未检测到杂交条带。结论联苯胺对大鼠P53基因外显子7具有DNA损伤作用,其致癌机制可能与P53基因损伤有关,联苯胺对大鼠的主要靶器官为肝、膀胱和肺。

核酸序列水平定位DNA损伤的实验研究

目的研究在核酸序列水平定位DNA损伤的方法。方法培养TK6细胞,抽提基因组DNA,制备k-ras基因外显子2的单链探针。酶切基因组DNA构建损伤模型,应用依赖随机化末端连接物PCR(RDPCR)进行Southern blot,对产物进行测序。结果酶切DNA的RDPCR产物在相应位置出现杂交条带,测序证实损伤位于Hinf在k-ras外显子2的酶切位点。结论将RDPCR和测序技术结合在一起,可在核酸水平上准确定位DNA损伤的碱基位置。

苯并a芘致人k-ras基因DNA损伤位点检测

目的探索苯并a芘对k-ras基因的DNA损伤位点。方法苯并a芘(BaP)染毒细胞提取基因DNA,采用依赖随机化末端连接物PCR(RCPCR)进行核酸杂交及产物测序。结果BaP染毒剂量200μmol/L检测到比k-ras外显子2短的一条清晰的杂交条带;测序结果表明,linker与k-ras外显子2的第67位碱基C发生连接。结论BaP可引起k-ras外显子2发生损伤,损伤位点在第66位碱基T,该损伤位点可能是其致癌作用靶点。