Red同源重组技术在大肠埃希菌基因敲除中的应用

近年来,大肠埃希菌一直是分子生物学和基因组学的重要研究对象。20世纪80年代以来,生物学家发展了一种新型分子生物学技术-基因敲除。大肠埃希菌基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠埃希菌基因敲除中的应用已经越来越成熟。本文简要综述了利用Red同源重组技术进行大肠埃希菌基因敲除的原理、策略及应用现状。

表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒构建及应用

为构建表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒(herpesvirusofturkey,HVT),以连续覆盖HVT全基因组的Fosmid文库为基础,利用Red/ET同源重组技术和Gateway LR克隆技术,将优化的携带Pec复合启动子的HA基因插入到HVT复制非必需区HVT053与HVT054位点处的95318~95319nt之间,获得了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组HVT(rHVT-H9-HA株),并对构建的毒株进行鉴定。结果显示,成功构建了含有HA基因的入门质粒pEntr-HA,通过Gateway克隆的LR反应将含有HA基因的表达盒转移到黏粒pFosC DEST的第53和54号基因之间形成pFosC HA;提取5个黏粒后,转染次代CEF细胞获得拯救重组病毒rHVT-H9-HA株。连续传代和动物试验结果表明,rHVT-H9-HA株毒价高,遗传稳定,可以克服母源抗体干扰,免疫持续期长,能够提供针对H9亚型禽流感的保护;同时也实现了一针防两病,效果明显优于灭活疫苗。本研究为H9亚型禽流感病毒重组HVT活载体疫苗的研制提供了技术支撑。

λRed技术构建肺炎克雷伯氏菌sRNA-sgrS基因缺失突变株

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)以葡萄糖为底物进行发酵生产2,3-丁二醇(2,3-butanetriol,2,3-BD)的过程中,糖磷酸胁迫非编码小RNA(sugar-phosphate stress sRNA,sRNA-sgrS)通过调控菌体内葡萄糖浓度来解除菌体的应激效应。通过λRed同源重组技术,将构建的同源重组片段sgrS A1-EGFP-sgrS A2,经过酶切、纯化后,通过电转化将重组片段转入到含有pKD46质粒的野生型菌株K.pneumoniae HD79及突变型菌株K.pneumoniae HD79-02(△ldh,△ack)的感受态细胞中。经过荧光显微镜观察筛选阳性转化子,经过PCR验证K.pneumoniae HD79及K.pneumoniae HD79-02 sRNA-sgrS基因缺失重组菌株构建成功。利用λRed技术构建肺炎克雷伯氏菌sRNA-sgrS基因缺失突变株,可为后续探究菌体内外葡萄糖浓度对菌株产量2,3-BD的影响奠定了基础。

Red/ET同源重组技术及其在微生物基因组挖掘中的应用进展

Red/ET同源重组技术(Red/ET recombineering)是由来源于大肠杆菌λ噬菌体的蛋白对Redα/Redβ或来源于Rac原噬菌体的蛋白对Rec E/Rec T所介导的基于短同源臂(40–50 bp)的同源重组技术,能对宿主DNA序列进行快速、高效、精确的修饰和操作。本文主要综述了2010年以来Red/ET同源重组技术在大肠杆菌及其他细菌中的研究进展,同时简要介绍了该技术在微生物基因组挖掘,尤其是在微生物基因簇的异源表达领域的应用进展。

relA基因敲除对多黏菌素抗鲍曼不动杆菌异质性耐药的影响

目的·观察严谨反应相关的(p)ppGpp合成酶基因(relA)对多黏菌素抗鲍曼不动杆菌异质性耐药的影响。方法·采用Red同源重组技术敲除鲍曼不动杆菌ATCC19606中relA基因;用结晶紫染色法观察鲍曼不动杆菌菌膜形成的情况;用群体分析法(population analysis profiles,PAP)检测在多黏菌素作用下鲍曼不动杆菌产生异质性耐药菌落数的变化并计算异质性耐药率;用杀菌曲线检测在多黏菌素作用下鲍曼不动杆菌持留菌形成情况。结果·成功敲除鲍曼不动杆菌中relA基因,获得relA基因敲除株ATCC19606-ΔrelA,鲍曼不动杆菌的菌膜形成量明显下降,多黏菌素作用下异质性耐药菌落数及持留菌形成量均显著性降低。结论·细菌严谨反应中(p)ppGpp合成酶relA基因可能是影响鲍曼不动杆菌对多黏菌素产生异质性耐药的重要因素。

大肠杆菌CusS的生物信息学分析及对银离子胁迫的响应

【目的】解析大肠杆菌(Escherichia coli)K-12菌株同型二聚体内膜传感器组氨酸激酶(sensor histidine kinase,CusS)蛋白在细菌应答金属银离子胁迫中的调控机制,为该菌的防治提供重要科学依据。【方法】利用ProtParam、ProtScale、Protein-Sol、TMHMM、SignalP、LocTree3、NetNGlyc-1.0、NetPhosBac-3.0、SOPMA、I-TASSERF、STRING和MEGA分别预测CusS的理化性质、亲水性、可溶性、跨膜域、信号肽、亚细胞定位、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构、三级结构、蛋白互作的关系网络和蛋白在革兰阴性杆菌中的同源性。采用Red同源重组技术构建大肠杆菌ΔcusS,在不同培养基中连续监测ΔcusS的生长情况,观察该基因缺失后的细菌生长活性;通过最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)试验评价该缺失株对金属铜、银离子和临床常见抗生素的敏感性变化;运用RT-qPCR检测cusS缺失后其下游基因cusCFBA和cusR转录水平。【结果】CusS蛋白由480个氨基酸组成,相对分子质量为53738.05,原子总数为7624,等电点为6.02,具有稳定性,是一种亲水性、不溶性蛋白;含有跨膜域;不存在信号肽,定位于细胞内膜中;存在2个糖基化位点、24个丝氨酸磷酸化位点、14个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点;二级结构中α-螺旋占比55.42%,β-折叠占比11.67%,β-转角占比3.75%,无规则卷曲占比29.17%;cusS在埃希菌属和志贺菌属中的保守性高;菌落PCR和一代测序验证ΔcusS构建成功;连续检测生长曲线表明cusS缺失并不影响细菌的生长代谢,但CusS蛋白为大肠杆菌抵御金属银胁迫的关键基因。【结论】cusS作为一个关键基因,它的缺失并不影响大肠杆菌的生长活性,但会显著降低细菌抵御银离子胁迫的应答能力。缺失cusS将使下游基因cusCFBA和cusR的mRNA表达水平显著下降。对CusS蛋白进行生物信息学分析及表型初探,为深入了解CusS在大肠杆菌应答银离子胁迫的调控机制奠定了基础。

敲除frdB基因对大肠杆菌厌氧混合酸发酵的影响

以SPUEC101(产琥珀酸)为出发菌,利用RED同源重组技术敲除延胡索酸还原酶基因frdB,得到重组菌株SPUEC103(△frdB),通过减少延胡索酸生成琥珀酸的通量,实现延胡索酸的积累。实验结果表明:敲除frdB基因后,缺陷菌株生长速率降低,利用葡萄糖的能力也有所降低,同时敲除frdB基因较大程度地改变琥珀酸、延胡索酸等的分布,在两阶段发酵中,当发酵培养基中添加30 g/L的葡萄糖时,琥珀酸和延胡索酸得率最高,对比SPUEC101,SPUEC103的琥珀酸产量产率由24.6%下降为15.4%,并有延胡索酸和少量的苹果酸生成,分别为0.182±0.002 g/L和0.023±0.002 g/L,同时丙酮酸和乙酸含量也略有升高,分别由1.87±0.02 g/L、0.012±0.002g/L上升到2.36±0.03 g/L、0.862±0.012 g/L。