沉默RelB下调MnSOD减弱非小细胞肺癌的放疗抵抗

目的探讨核转录因子RelB调控非小细胞肺癌放疗抵抗的机制。方法收集苏州大学附属第一医院胸外科手术切除的Ⅰ-Ⅲa期非小细胞肺癌患者的临床资料和组织标本。免疫组化法分析RelB在癌和癌旁组织中的表达,Chi-square分析RelB与临床参数的相关性。建立稳定沉默RelB的细胞株A549-siRelB,辐照细胞株,流式细胞术检测辐照后细胞株的细胞凋亡,Westernblot检测辐照后细胞株中MnSOD表达。结果RelB在癌组织中的表达高于癌旁组织,RelB的高表达与肿瘤侵犯程度、淋巴结转移及TNM分期有关。辐照后A549-siRelB的细胞凋亡数多于A549-sictrl,A549-siRelB中MnSOD水平较A549-sictrl低。结论核转录因子RelB参与非小细胞肺癌的进展,沉默RelB下调MnSOD减弱非小细胞肺癌的放疗抵抗。

小鼠骨髓成熟与不成熟树突状细胞中RelB基因的表达

目的:探讨体外分离培养的小鼠骨髓来源的成熟与未成熟DC中核转录因子RelB(avianreticuloendotheliosisviral(v-rel)oncogenerelatedB)基因的表达。方法:无菌从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中取出骨髓细胞,利用rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导骨髓前体细胞产生未成熟的DC,未成熟的DC在培养结束前18h经LPS刺激获得成熟的DC,用流式细胞术分析它们的表型,用RT-PCR和免疫荧光染色法检测成熟与未成熟DC中,RelBmRNA和其蛋白的表达。结果:流式细胞术分析显示未成熟的DC中MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子(CD86和CD40)呈低水平表达;而成熟的DC则呈高水平表达。RT-PCR和免疫荧光染色法检测结果均显示,RelB基因在未成熟的DC中呈低水平表达;而在成熟的DC中呈高水平表达,两者比较具有统计学意义(P<0.01)。结论:RelB基因的表达与小鼠骨髓来源的DC的成熟状态密切相关。抑制DC中RelB基因的表达,有可能诱导产生具有耐受原性的未成熟的DC。

RNA干扰RelB基因对小鼠RM-1前列腺癌细胞株放射敏感性的影响及其机制

目的:探讨RNA干扰RelB基因对鼠RM-1前列腺癌细胞株放射敏感性的影响及其机制。方法:利用靶向RelB基因的慢病毒载体(pLentilox-sh-RelB),脂质体介导转染RM-1细胞后进行放射(2,4,6,和8Gy剂量)处理培养,分别采用RT-PCR、Western印迹法及流式细胞术等方法检测RelB的mRNA和蛋白表达,锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)活力及细胞放射敏感性的变化。结果:转染后放射处理培养,siRelB-RM-1组RelB的mRNA和蛋白表达水平明显低于siVector-RM-1组和nontrans-RM-1组(P<0.05);放射处理培养后siRelB-RM-1组细胞凋亡百分率明显高于siVector-RM-1组和nontrans-RM-1组(P<0.05);培养后siRelB-RM-1组细胞Mn-SOD活力下降,放射增敏比为5.13。结论:RNA干扰RelB基因可增强鼠RM-1前列腺癌细胞株放射后的放射敏感性,其机制可能与RNA干扰RelB基因,抑制细胞增殖,降低Mn-SOD活力和诱导凋亡有关。

小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠RelB基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默骨髓树突细胞(DC)的RelB基因表达,为构建骨髓致耐受DC用于自身免疫病的防治提供研究基础。方法利用Invitrogen公司在线软件设计小鼠RelB基因(NM_009046)shRNA序列,合成、退火形成dsoligo后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序,得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,转化stb13感受态细胞,测序鉴定,在脂质体的介导下将慢病毒的包装混合物和RelB基因重组慢病毒载体导入293FT细胞,包装成病毒后,收集病毒上清,采用系列稀释法测定病毒滴度。结果测序结果显示pENTRTM/U6-RelB-shRNA为阳性克隆,将该阳性重组载体与慢病毒载体重组,转化,氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆,U6前引物测序鉴定,测序结果显示该重组慢病毒载体也为阳性克隆,在293FT细胞中进行病毒包装,收集上清并在-80℃贮存。系列稀释法检测病毒悬液的滴度为6×105TU/ml。结论成功构建出小鼠RelB基因shRNA慢病毒RNAi表达载体,为制备致耐受DC和研究DC在自身免疫病中的应用提供了稳定的转染细胞载体。

慢病毒载体介导的小鼠骨髓树突状细胞RelB基因沉默

目的:利用慢病毒载体沉默小鼠骨髓树突状细胞(DC)的RelB基因,建立RelB基因低表达的骨髓致耐受DC,为自身免疫病的防治提供新方法。方法:设计小鼠RelB基因干扰的靶序列R5,合成并克隆到慢病毒载体上,与慢病毒的包装材料在293FT细胞中包装成病毒颗粒,收集病毒上清,测定病毒滴度,然后包装慢病毒感染DC,RT-PCR和免疫荧光方法检测,灰度扫描并用软件分析RelB基因的表达水平,未成熟DC作对照组,选择T6包装病毒为RNAi的阴性对照。结果:RT-PCR和免疫荧光方法发现R5病毒感染的DCRelB基因表达水平与未成熟DC基因表达水平接近,低于成熟DC的表达水平(P<0.05),而实验对照T6组病毒感染的DC其RelB基因表达水平高于未成熟DC(P<0.05)和R5病毒转染DC组(P<0.05)。结论:小鼠骨髓DC表达的RelB基因被慢病毒载体有效沉默,有望成为DC免疫治疗的新载体。

利用小干扰RNA表达框鉴定小鼠骨髓树突状细胞有效沉默RelB基因的实验研究

目的构建靶向小鼠RelB基因的小干扰RNA(siRNA)表达框,鉴定针对小鼠骨髓树突状细胞(DC)的RelB基因最有效的siRNA序列。方法利用PCR方法构建3个不同位点的表达框,R1/siRNA、R2/siRNA和R3/siRNA分别位于1027、302和1121位点。利用阳离子脂质体AdvantGene转染小鼠骨髓DC,转染24h后,脂多糖(LPS)刺激DC,用RT-PCR和免疫荧光方法检测DC RelB基因表达的变化。结果经LPS刺激后DC成熟,RelB基因表达显著高于未成熟DC;R1/siRNA和R3/siRNA转染DC后,LPS刺激仍然可以增强RelB基因表达,而R2/siRNA转染DC后,LPS刺激不能增加RelB基因表达。结论R2/siRNA可有效抑制RelB基因表达,有望用于构建新的耐受性DC应用于临床免疫耐受的诱导。

DC2.4表面分子与RelB基因表达的关系

目的探讨DC2.4表面分子表达水平与RelB基因表达间的关系。方法用RPMI1640完全培养液培养DC2.4细胞系,光学显微镜观察培养细胞的形态特征;透射电镜观察DC2.4的细胞结构;流式细胞术分析DC2.4的表面标记(MHC-II、CD86和CD40);RT-PCR检测DC2.4的RelB表达水平。结果光镜观察DC2.4细胞表面有明显的树突状突起,形态极不规则;透射电镜显示DC2.4细胞内含许多质地均匀的脂滴,可见吞噬小泡样的结构。流式细胞术显示MHC-II类分子和CD40呈低水平表达,而CD86分子却呈高水平表达;RT-PCR结果显示RelB呈低水平表达,与骨髓源性DC中的未成熟状态DC的RelB表达水平接近。结论DC2.4具有强吞噬功能,其表面CD40分子和细胞内RelB基因均呈低水平表达,提示DC2.4是一种未成熟状态的细胞系。

RelB基因沉默的髓源树突状细胞负载Tα_(146～162)对TAChR预致敏T细胞免疫反应的影响

目的:探讨RelB基因沉默的髓源树突状细胞(BMDC)负载电鳗乙酰胆碱受体(TAChR)优势肽段Tα146～162在TAChR预致敏C57BL/6小鼠中能否诱导免疫耐受。方法:制备产生RelBsiRNA分子的重组慢病毒和对照病毒。慢病毒感染BMDC后,给予LPS刺激,相应的DC命名为DC-siRelB和DC-control。应用实时定量PCR和Western印迹分析细胞中RelB表达,流式细胞仪检测细胞表型,ELISA检测上清白细胞介素(IL)-12水平。36只C57BL/6小鼠随机分为A1,A2,A3,K1,K2,K3共6组。实验前1天,A1～A3组用TAChR+完全福氏佐剂(CFA)致敏;K1～K3组用钥孔戚血清蛋白(KLH)+CFA致敏。第7天,A2和K2组注射Tα146～162脉冲的DC-siRelB;A3和K3组注射Tα146～162脉冲的DC-control;A1和K1组给予PBS。第14天,3H-TdR掺入法检测淋巴细胞增殖反应。结果:成功构建了含RelBshRNA基因的重组慢病毒,RelBsiRNA可显著下调DC中RelB的表达。与DC-control相比,DC-siRelB中CD80,CD86,MHCII表达及IL-12水平显著降低。与A1和A3组相比,A2组TAChR刺激下淋巴细胞增殖反应显著降低(P<0.05),ConA和KLH刺激下淋巴细胞增殖反应差异无统计学意义(P>0.05)。K1,K2和K3组在KLH刺激下淋巴细胞增殖反应差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:慢病毒介导的RelB基因沉默的BMDC可抵制成熟诱导反应并能在TAChR预致敏的C57BL/6小鼠中诱导抗原特异性免疫耐受,为研究其用于治疗重症肌无力奠定了基础。

RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓树突细胞的免疫学效应观察

目的探讨RelB shRNA慢病毒感染对小鼠骨髓树突细胞(DC)的生物免疫学功能的影响。方法构建小鼠RelB shR-NA慢病毒载体。取小鼠股骨和胫骨的骨髓,采用重组粒-巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重组白细胞介素4(rmIL-4)联合诱导小鼠骨髓DC。实验共分两组:对照组(小鼠骨髓未成熟DC组)和慢病毒感染组(RelBshRNA慢病毒感染的小鼠骨髓DC组)。两组DC均培养6d,经小鼠CD11c+免疫磁珠纯化,采用流式细胞仪检测DC表面MHC-Ⅱ、CD86和CD40的表达。取小鼠脾脏,收集T细胞。将两组DC与T细胞混合,按不同比例(1∶40、1∶20、1∶10和1∶5)设4个亚组,用MTT法检测T细胞增殖,细胞因子液相芯片联合试剂盒检测Th1类细胞因子(IL-2和IFN-γ)和Th2类细胞因子(IL-4和IL-10)的表达。结果RelB shRNA慢病毒感染DC的表面分子MHC-Ⅱ、CD86和CD40均呈低水平表达,其刺激异基因小鼠T细胞增殖的能力,以及Th1、Th2类细胞因子分泌水平与未成熟DC相当。结论RelB shRNA慢病毒感染的小鼠骨髓DC呈现出未成熟DC的表型和免疫功能。

RelB基因沉默对骨髓树突细胞生物学效应的影响

目的探讨核转录因子NFκ-B/RelB基因沉默对树突细胞(DC)生物学效应的影响。方法采用细胞因子诱导培养法体外扩增小鼠骨髓DC,并经免疫磁珠纯化,获得高纯度骨髓DC后,行RelB基因沉默,获得RNAi RelB-DC,扫描电镜和透射电镜观察细胞形态特点,并利用流式细胞术分析细胞表面分子的表达水平,同种异基因混合淋巴细胞反应(MLR)法分析RNAi RelB-DC刺激异基因T细胞增殖的能力。结果扫描电镜下RNAi RelB-DC细胞表面突起较少而短,细胞表面多皱褶;透射电镜下可见细胞内多吞噬泡样结构;流式细胞术分析显示细胞表面分子MHC-II、CD86和CD40的表达水平相对较低;MLR显示该DC刺激异基因T细胞增殖的能力相对较弱。结论RelB基因沉默DC的生物学效应表现为未成熟DC的特点,这种RNAi RelB-DC作为一种新型的致耐受DC,有望应用于免疫耐受的诱导研究。

RelB shRNA慢病毒感染小鼠骨髓树突状细胞的免疫学效应

背景:沉默树突状细胞发育成熟的关键基因核因子кB/RelB可构建新型致耐受树突状细胞?目的:探讨RelB shRNA转染小鼠骨髓树突细胞的生物免疫学功能的影响。方法:利用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和重组白细胞介素4联合诱导小鼠骨髓树突状细胞;慢病毒载体将RelBshRNA转染致小鼠骨髓树突细胞后,分为未成熟树突状细胞、脂多糖刺激成熟、RelB基因沉默及脂多糖刺激RelB沉默的4组树突状细胞进行观察。结果:体外培养第6天脂多糖刺激组细胞表面可见大量细长的类似树枝的突起,其他3组细胞形态特征相似,呈圆形、皱缩状态,这3组细胞表面MHC-II类分子、CD86和CD40分子表达水平相当,但低于脂多糖刺激组;3组混合淋巴细胞反应中刺激T细胞增殖能力差异无显著性意义(P>0.05),但均较脂多糖刺激组显著降低(P<0.01);RelB基因沉默的树突状细胞分泌Th1细胞因子γ-干扰素和白细胞介素2的能力较低,分泌Th2白细胞介素10和白细胞介素4的能力较高(P<0.01),Th1/Th2细胞因子的比例与未成熟树突状细胞类似。说明RelBshRNA经慢病毒转染骨髓源性树突状细胞后,在细胞形态、表面分子表达、免疫学功能等方面均具有与未成熟树突状细胞相似的特点,且不能被脂多糖刺激成熟。

RelB在蛋白酶体抑制剂诱导的maspin表达中的作用研究

目的:探讨前列腺癌细胞中,核转录因子NF-κB家族成员之一RelB在蛋白酶体抑制剂作用下maspin蛋白表达调控中的作用机制。方法:采用Western blotting法检测前列腺癌细胞中内源性及蛋白酶体抑制剂MG-132作用下RelA、RelB和maspin的蛋白表达;采用免疫组化法检测前列腺癌组织中RelB和maspin的表达情况;通过转染小分子RNA至前列腺癌细胞中沉默RelB的表达;采用Western blotting法检测RelB沉默对MG-132诱导的maspin蛋白表达情况的影响;PI染色法结合流式细胞术检测细胞死亡率。结果:雄激素非依赖型前列腺癌细胞DU145中RelB表达增强而maspin表达明显降低。在检测的10例前列腺癌组织样本中,恶性度高(Gleason评分4-5)的样本普遍同时存在胞核内RelB强染色和maspin表达缺失。MG-132作用DU145细胞24 h后RelB在胞浆和胞核中表达水平下调,伴随着maspin在胞核内的表达上调。MG-132处理RelB表达沉默的DU145细胞8和24 h后,maspin的表达无明显变化,而RelA蛋白的表达水平呈时间依赖性的下调。结论:在雄激素非依赖型前列腺癌细胞和晚期前列腺癌组织中,maspin与RelB的表达呈负相关性。蛋白酶体抑制剂诱导maspin的表达上调过程中,RelB是重要的调控因子。

小鼠骨髓源性树突状细胞和DC2.4中RelB基因表达水平的比较研究

目的比较研究体外分离培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞(bonemarrow-deriveddendriticcells,BM-DC)和DC2.4中核转录因子RelB基因的表达水平。方法无菌从C57BL/6小鼠股骨和胫骨中取出骨髓细胞,利用rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导体系扩增骨髓前体细胞的方法产生未成熟的BM-DC,未成熟的BM-DC在培养结束前18h经LPS刺激获得成熟的BM-DC;DC2.4细胞系用含10%胎牛血清的RPMI1640完全培养液于37℃,5%CO2条件孵箱中培养。用流式细胞术分析它们的表型,用RT-PCR和免疫荧光染色法检测成熟的BM-DC、未成熟的BM-DC和DC2.4,RelBmRNA和其蛋白的表达。结果流式细胞术分析显示MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD40在未成熟的BM-DC和DC2.4中均呈低水平表达,在成熟的BM-DC中则呈高水平表达;共刺激分子CD86在成熟的BM-DC和DC2.4中均呈高水平表达,而在未成熟的BM-DC中呈低水平表达。RT-PCR和免疫荧光染色法检测结果均显示,RelB基因在未成熟的BM-DC和DC2.4中均呈低水平表达;而在成熟的BM-DC中呈高水平表达,成熟的BM-DC与未成熟BM-DC及DC2.4均存在显著差异(P<0.01)。结论RelB基因的表达与小鼠BM-DC的成熟状态密切相关。RelB基因在DC2.4中呈低水平表达,提示DC2.4是一种不成熟的DC细胞系。DC2.4具有的未成熟DC的特点可能与RelB基因的低水平表达有一定关系。抑制骨髓DC中RelB基因的表达,有可能诱导产生具有耐受原性的未成熟的DC。

鱼腥藻PCC 7120染色体上relBE同源基因的克隆及表达

为研究鱼腥藻PCC7120染色体上与relBE同源的基因asl4561和asl4562表达产物的毒素-抗毒素作用,从鱼腥藻细胞中提取总基因组DNA,设计特异引物PCR扩增目的基因asl4561和asl4562,与T载体连接后经XhoI和EcoR I双酶切并与表达载体pET28a(+)连接,由IPTG诱导表达,并在IPTG浓度和诱导时间上对asl4561基因的表达条件进行了优化.琼脂糖凝胶电泳显示扩增出了264bp的asl4561基因和213bp的asl4562基因,SDS-PAGE检测表明成功表达出15.65kD和13.55kD的两蛋白,当诱导温度28℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间6h时,asl4561基因表达蛋白在细菌裂解液上清中表达量最大.

RNAi RelB DC对CD4^+CD25^+双阳性T细胞诱导效应的实验研究

目的:探讨核转录因子NF-κB/RelB基因沉默的树突状细胞(RNAiRelB dendritic cell,RNAiRelBDC)诱导异基因CD4+CD25+双阳性T细胞生成的生物效应。方法:实验分为Control-DC组、LPS-DC组、RNAiRelBDC组和LPS-RNAiRelBDC组,各组DC均与同种异基因T淋巴细胞混合反应后,采用流式细胞术(FCM)分析各组CD4+CD25+双阳性T细胞生成比例。结果:Control-DC组DC较LPS-DC组DC诱导CD4+CD25+双阳性T细胞的增高幅度更显著,两者差异具有统计学意义(P<0.01)。RNAiRelBDC组和LPS-RNAiRelBDC组DC诱导CD4+CD25+双阳性T细胞生成比例与LPS-DC组相比均存在显著差异(P<0.01),RNAiRelBDC组DC诱导CD4+CD25+双阳性T细胞生成能力较Control-DC组强,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:RelB基因被沉默后DC具有较强的诱导CD4+CD25+双阳性T细胞生成的能力,表现出未成熟DC的特点,这种RNAiRelBDC有望成为一种新型的致耐受DC用于免疫耐受的诱导研究。

预输注RelB shRNA慢病毒修饰树突细胞诱导大鼠肝移植免疫耐受

背景:肝移植后的排斥反应是威胁患者和移植物长期存活的主要原因。诱导受者产生特异性免疫耐受是解决排斥反应的理想措施。目的:探讨RNAi RelB树突状细胞预输注诱导大鼠肝移植特异性免疫耐受的可能性。方法:将近交系雄性清洁级DA(RT1a)大鼠和近交系雄性SPF级Lewis(RT11)大鼠分别作为供、受体,行原位肝移植手术。术前随机配对分为4组:①对照组,受体鼠移植前不做预输注。②治疗组:受体鼠移植前7d静脉输注供体大鼠RNAi RelB树突状细胞(5×106)。③未成熟树突状细胞组:受体鼠移植前7d静脉输注供体大鼠未成熟树突状细胞(5×106)。④成熟树突状细胞组:受体鼠移植前7d静脉输注供体大鼠成熟树突状细胞(5×106)。结果与结论:与对照组、未成熟树突状细胞组以及成熟树突状细胞组相比,治疗组移植肝的平均生存时间显著延长。移植后第7天,治疗组天冬氨酸转氨酶,总胆红素水平低于对照组、成熟树突状细胞组、未成熟树突状细胞组(P<0.01),移植后第14天治疗组、未成熟树突状细胞组天冬氨酸转氨酶,总胆红素均有轻微下降,两组比较差异仍有显著性意义(P<0.01)。移植后第7天,与治疗组比较,对照组、成熟树突状细胞组、未成熟树突状细胞组γ-干扰素、白细胞介素2水平升高(P<0.01),而白细胞介素4、白细胞介素10下降(P<0.01);移植后第14天治疗组、未成熟树突状细胞组γ-干扰素、白细胞介素2水平均有下降,白细胞介素4、白细胞介素10水平均有升高,两组比较差异仍有显著性意义(P<0.01)。对照组、成熟树突状细胞组、未成熟树突状细胞组移植后第7天排斥活动指数为8.0-9.0。未成熟树突状细胞组第14天肝细胞、内皮细胞坏死及汇管区炎性细胞浸润进一步增多。治疗组移植后第7天排斥活动指数为6.0-8.0,第14天时排斥活动指数为4.0-5.0。结果提示RNAi RelB树突状细胞预输注可以减轻移植肝排斥程度,延长移植肝生存时间,这是通过间接途径实现的,其机制可能与T细胞的调节和无能有关。

雷帕霉素对未成熟树突状细胞RelB表达的影响研究

目的:研究雷帕霉素(rapamycin,RAPA)对未成熟树突状细胞(immature dendritic cell,imDC)RelB表达的影响,为回输RAPA处理的imDC(RAPA-imDC)诱导移植耐受的机制研究提供实验依据。方法:分离诱导imDC、RAPA-imDC、成熟树突状细胞(mature dendritic cell,mDC),光镜和电镜观察其形态,流式细胞仪检测其CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达,用免疫荧光法检测其RelB表达。结果:①电镜结果显示imDC与RAPA-imDC形态相似,呈未成熟状态,树突少、粗短;mDC树突较多,细长。②mDC表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达显著高于imDC和RAPA-imDC(P<0.05);而imDC的表达也明显高于RAPA-imDC(P<0.05)。③免疫荧光法检测结果显示imDC、RAPA-imDC RelB表达量无显著变化,而mDC表达量高。结论:雷帕霉素能降低imDC表面的CD80、CD86、MHC-Ⅱ表达,但对其RelB表达没有明显影响。

ROS/TLR_4/RelB、P38通路激活在间歇低氧致树突状细胞表型以及功能改变中的作用

目的探讨ROS/TLR_4/RelB、P38通路激活在间歇低氧对人外周血来源树突状细胞(DCs)表型以及功能改变中的作用,为干预睡眠呼吸暂停综合征系统并发症提供新的策略。方法按照不同干预将DCs分为RelB-Snail转染组、P38-PGenesil-1转染组、Snail转染组、PGenesil-1转染组、ROS清除组(CAT浓度为10、50 mmol/L)、TLR_4阻断组(HTA125质量浓度为10、50μg/ml)。间歇低氧环境为1.5%低氧浓度,21.0%复氧浓度,低氧/复氧时间比1∶5;设置常氧培养(持续21.0%给氧浓度)以作对照。DCs成熟表型采用CD1a、CD83双标流式细胞仪以及免疫荧光法检测,同种异体混合淋巴细胞增殖反应(MLR)检测DCs刺激T淋巴细胞增殖能力;ELISA法检测IL-12以及MDA的质量浓度;Western blot法检测各组TLR_4、RelB以及P38蛋白表达水平。结果 CAT呈剂量依赖性抑制间歇低氧下DCs MDA、TLR_4、RelB以及P38表达水平;同时抑制IH下DCs成熟,MLR以及IL-12表达。HTA125剂量依赖性抑制培养后DCs RelB和P38表达,对MDA表达无影响;同样抑制DCs成熟,MLR以及IL-12表达。干预组中,RelB干扰对间歇低氧下DCs成熟抑制最为显著,亦可抑制MLR以及IL-12分泌,但未影响MDA、TLR_4以及P38表达。P38干扰对间歇低氧下DCs MLR以及IL-12水平抑制更加显著,亦可影响成熟,同样对MDA、TLR_4以及RelB表达无显著影响。结论间歇低氧下DCs主要通过ROS/TLR_4/RelB传递成熟信号,通过ROS/TLR_4/P38刺激MLR以及IL-12分泌。其中,RelB是DCs分化成熟的关键,MLR以及IL-12分泌主要由P38介导。

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)RelB蛋白(TroRelB)多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清(多克隆抗体),ELISA检测结果显示其抗体效价为1∶256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照(免疫前血清)未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的Tro RelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。

胃肠间质瘤中RelA和RelB表达、c-Kit/PDGFRA基因突变及其临床意义

目的探讨胃肠间质瘤(GIST)中核转录因子RelA和Rel B表达、c-Kit/PDGFRA基因突变及与临床病理特征之间的关系。方法回顾性分析132例GIST患者的临床病理资料,采用免疫组化法检测RelA和Rel B表达情况,采用直接测序法检测c-Kit和PDGFRA基因突变情况,分析RelA、Rel B表达和c-Kit/PDGFRA基因突变与GIST临床病理特征之间的关系。结果 RelA、Rel B在132例GIST组织标本中的阳性表达率分别为65.2%(86/132)、54.5%(72/132)。NIH危险度分级为高危患者的RelA阳性表达率为76.0%,高于非高危患者的58.5%(P=0.041);而Rel B表达与NIH危险度分级无关(P>0.05)。RelA和Rel B表达与性别、年龄、肿瘤原发部位、肿瘤大小、肿瘤坏死及肿瘤溃疡均无关(P>0.05)。82例(62.1%)患者检测到c-Kit和PDGFRA热点突变,c-Kit基因突变者74例(56.1%),PDGFRA基因突变者8例(6.1%)。c-Kit/PDGFRA基因突变患者的RelA阳性表达率为70.7%,高于野生型患者的56.0%(P=0.085);而Rel B表达与c-Kit/PDGFRA基因突变状态无关(P>0.05)。肿瘤直径>10 cm的患者c-Kit/PDGFRA基因突变率为78.6%,高于肿瘤直径≤10 cm者的57.7%(P=0.043)。NIH高危者c-Kit/PDGFRA基因突变率为76.0%,高于非高危者的53.7%(P=0.01)。CD34阳性、DOG-1阳性患者的c-Kit/PDGFRA基因突变率分别为70.8%、64.1%,高于相应阴性患者的44.2%(P=0.003)和0(P=0.038)。MBP和Desmin阳性患者的c-Kit/PDGFRA基因突变率分别为52.5%和30.8%,低于相应阴性患者的76.9%(P=0.005)和69.8%(P<0.001)。结论 RelA阳性或c-Kit/PDGFRA基因突变型患者危险度分级较高,预后可能更差。CD34和DOG-1阳性可能作为c-Kit/PDGFRA基因突变型GIST初步诊断的阳性指标,而MBP和Desmin阳性可能作为排除性诊断指标。