猪圆环病毒4型Rep蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】应用原核表达系统表达猪圆环病毒4型(Porcine circovirus type 4,PCV4)复制酶蛋白(Rep),纯化后免疫小鼠制备Rep蛋白多克隆抗体。【方法】以PCV4福建株(FJ2020001)为模板,采用PCR法扩增获得Rep基因片段,构建原核表达质粒pET-30a-Rep;将pET-30a-Rep转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用0.5 mmol/L IPTG诱导表达重组Rep蛋白,利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白。表达产物经镍柱纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,利用Western blotting和间接ELISA鉴定鼠源多克隆抗体的免疫原性和抗体效价。【结果】成功克隆PCV4 Re p基因,构建了可表达重组Rep蛋白的原核表达质粒;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能被PCV4阳性血清和鼠源多克隆抗体特异性识别,制备的鼠源多克隆抗体效价可达1∶16000。【结论】本研究成功表达并纯化了具备抗原性的PCV4重组Rep蛋白,为开发PCV4血清学诊断试剂盒和开展猪场PCV4流行病学调查奠定基础。

新型番鸭细小病毒Rep蛋白羧基端亚片段的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】获得特异性识别新型番鸭细小病毒(New-genotype muscovy duck Parvovirus,N-MDPV)Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【方法】通过蛋白序列分析,选取N-MDPV Rep羧基端亚片段区域487~627 aa,后全基因合成序列,并在其C末端添加His-tag标签,利用无缝克隆的方法,将该段基因克隆至pET-28a(+)载体,随后转化Rosetta(DE3)大肠杆菌,诱导表达得到重组蛋白。利用镍柱亲和层析技术纯化表达重组蛋白,将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备针对Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。【结果】构建了pET-28a-Rep-487-627原核表达质粒,纯化表达了该重组蛋白。SDS-PAGE结果表明该重组蛋白分子大小约24 kDa,主要以可溶性形式表达。间接免疫荧光和免疫印迹试验表明制备的多克隆抗体能与细胞内过表达的N-MDPV Rep蛋白特异性反应。【结论】制备的Rep多克隆抗体具有良好反应特异性,可识别Rep蛋白的构象表位和线性表位,满足进一步研究的需要。

猪圆环病毒2型Rep蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达和纯化

为了在Sf9昆虫细胞中表达猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白,试验以PCV-2毒株(PCV-2b)的DNA为模板扩增ORF1基因,将ORF1基因插入到转移载体质粒pQB3s上,构建重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep,将重组质粒与杆状病毒表达载体qBac-ⅢG共同转染Sf9昆虫细胞,获得P0代重组杆状病毒,经连续传代获得P1、P2、P3代重组杆状病毒,将P3代重组杆状病毒接种到Sf9昆虫细胞中进行悬浮培养,收集细胞并利用镍柱纯化重组表达的蛋白,通过荧光显微镜观察感染重组杆状病毒的Sf9昆虫细胞中的荧光量,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定重组蛋白的表达情况。结果表明:经PCR鉴定在945 bp处出现特异性条带;通过荧光显微镜观察,在转染后第1天就出现绿色荧光,第4~5天出现大量绿色荧光,P2、P3代重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞及P3代重组杆状病毒感染悬浮培养的Sf9昆虫细胞后在第4~5天出现大量绿色荧光;P2、P3代重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞的细胞裂解液及纯化的重组Rep蛋白,通过SDS-PAGE分析和Western-blot鉴定在约38 ku处出现目的条带。说明试验成功构建出重组质粒pQB3s-PCV-2b-Rep及重组杆状病毒,构建的重组杆状病毒可以在悬浮培养的Sf9昆虫细胞中表达重组蛋白Rep。

猪圆环病毒2型ORF1部分位点突变对病毒复制能力的影响

猪圆环病毒2型(PCV2)可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征,导致仔猪逐渐消瘦。PCV2 ORF1表达的Rep蛋白及其剪切体Rep′是PCV2复制所需的重要蛋白。为了研究PCV2 ORF1部分位点对PCV2复制能力的影响,本试验通过构建PCV2 ORF1区域点突变双拷贝感染性克隆质粒,在无PCV2污染的PK-15细胞中进行病毒拯救,使用荧光定量PCR检测不同位点突变病毒培养不同代次上清液的Ct值。结果:将PCV2 Rep的17 aa、19 aa、20 aa和21 aa突变为丙氨酸后病毒无法成功拯救,2 aa突变后严重影响病毒的复制能力,3 aa、5 aa和18 aa突变后病毒的复制能力增强且细胞病毒载量高于PCV2原毒株,推测17 aa、19 aa、20 aa和21 aa是影响PCV2复制的关键作用位点。本研究结果为未来PCV2复制相关研究提供了试验依据。

引起典型PDNS的PCV-2病原分子特征分析

为了了解引起贵州省贵定县某猪场育肥猪群出现的典型猪皮炎肾病综合征(PDNS)的PCV-2的分子特征,试验首先对采自该猪场患病猪血清进行PCR扩增和克隆测序,然后采用多种分子生物学软件及网站对PCV-2的基因型、基因结构、推导蛋白等进行研究。结果表明:PCR扩增得到大小为1767 bp的条带,与GenBank中CZ246毒株序列(登录号为MZ995482)的相似性最高,将获得的毒株命名为PCV-2 GZGD2022。PCV-2 GZGD2022株为PCV-2d基因型,与PCV-2d参考株NLControl4(登录号为AY484410)相比,含10个开放阅读框(ORF),缺失ORF8,其ORF5终止密码子提前,大小仅为21 bp。该毒株在基因组第1042位有1个碱基T的缺失,但导致Cap蛋白C末端延伸的是脯氨酸(P)而非赖氨酸(K)。与疫苗株(LG株、DBN-SX07-2株、ZJ株、SH株)相比,在Cap蛋白的抗原表位区有7个特异性突变点(F53I、R59K、A68N、T134N、A190T、A68N、T134N)。上述疫苗株之间磷酸化位点的差异主要集中在Cap蛋白上,在88 aa处多了1个丝氨酸磷酸化位点,在47 aa、134 aa、149 aa处少了1个苏氨酸磷酸化位点,在55 aa和218 aa处少了1个酪氨酸磷酸化位点。Rep蛋白有3个N糖基化位点(23NPS25、256NQT258和286NAT288),Cap蛋白有1个N糖基化位点(143NYS145)。Rep、Cap蛋白为混合型蛋白。此外,Rep、Cap蛋白有一些特殊功能结构域,如前者的PH-LIKE、NACHT等结构域和后者的乙酰化修饰位点(1MTYPR6)与核定位信号(NLS)。说明引起贵州省贵定县某猪场猪群出现典型PDNS的致病株为PCV-2d基因型,该毒株缺失ORF8,编码蛋白的氨基酸、抗原表位和磷酸化位点的改变可能是导致其毒力较强、引起典型PDNS的原因。

猪圆环病毒2型Rep蛋白ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速检测猪圆环病毒2型(PCV2)抗体的方法,本研究通过基因合成PCV2的Rep编码序列,将其克隆至pET-28a(+)并在E.coli中表达,表达的重组Rep蛋白经Ni2+亲和纯化。采用纯化的目的蛋白作为包被抗原,建立检测PCV2 Rep蛋白抗体的间接ELISA方法。结果表明最佳抗原包被浓度为200 ng/孔,血清和二抗最佳反应时间分别为1 h和30 min。该方法具有良好的特异性和敏感性,与韩国金诺公司试剂盒的符合率为81.4%,表明建立的ELISA方法可以用于PCV2的流行病学检测。

表达猪圆环病毒2型Rep蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定

猪圆环病毒2型(PCV2)是近年来新发现的引起断奶仔猪多系统衰弱综合征的主要病原,含有两个主要的阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制相关蛋白(Rep)和核衣壳蛋白(Cap)。为了探究ORF1基因结构及其与功能的关系,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2的ORF1基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBacTMDual中,获得重组转移载体pFBD-ORF1,再将其转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,经蓝白菌落筛选获得含有ORF1基因的重组穿梭载体rBacmid-ORF1,经脂质体介导转染昆虫细胞sf9,获得重组杆状病毒rAc-Rep,SDS-PAGE和Western-blotting分析可见大小约为36ku的特异性条带,表明rAc-Rep在sf9中成功表达了PCV2Rep蛋白。

猪圆环病毒1型和2型Rep蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化

分别以猪圆环病毒1型基因组和重组质粒pCI-PCV2-ORF1为模板,利用PCR扩增了猪圆环病毒1型和2型的ORF1基因,随后克隆到pET-28a(+)和pET-32a(+)两种原核表达载体上。测序正确的重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3),进行目的蛋白的诱导表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,猪圆环病毒1型和2型的ORF1均能在pET-28a和pET-32a中分别以重组蛋白His-Rep(40 Ku)和Trx-His-Rep(54 Ku)的形式表达。进一步纯化后测定重组蛋白的浓度,推算出猪圆环病毒1型和2型的His-Rep蛋白产量分别为34 mg/L菌液和14 mg/L菌液,Trx-His-Rep蛋白产量则为12 mg/L菌液和10 mg/L菌液。这些纯化的蛋白在Western blot中能够与猪抗猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应,显示其具有良好的免疫学活性。本研究建立的猪圆环病毒重组Rep蛋白的原核表达系统及其纯化方法,为下一步开展Rep蛋白功能等相关研究奠定了基础。

香蕉束顶病毒Rep蛋白特性分析及纯化体系的建立

以香蕉束顶病毒海口分离物DNA1(Accession NO.FJ463042)的Rep蛋白为研究对象,利用生物信息学软件对该蛋白的理化性质、结构组成、信号肽、磷酸化、二级结构、三级结构与功能结构域等作了较为详细的分析与预测,并配置了相关纯化试剂。将含重组质粒pET32b-Rep的E.coli BL21(DE3),接种到LB液体培养基,在20℃、0.1 mmol/L IPTG条件诱导4 h,产生大量的可溶性重组蛋白,经AKTA Explorer100系统亲和层析柱后,用不同梯度的Washing buffer洗脱杂蛋白并对各阶段产物进行12%SDS-PAGE分析,确定了100mmol/L咪唑的Washing buffer洗脱浓度,最终获得大量高纯度的重组蛋白。以His*Tag Monoclonal Antibody为一抗,Western blot鉴定结果表明纯化重组蛋白即为His-Rep融合蛋白。该纯化体系的建立为研究BBTVRep蛋白的结晶奠定了基础,也为今后ABTV、FBNYV、MVDV、PNYDV等病毒的相关复制蛋白纯化提供了重要数据。

猪圆环病毒2型Rep/Rep'和Cap蛋白亚单位疫苗免疫保护性试验

猪圆环病毒2型(PCV2)ORF1基因编码的Rep/Rep'蛋白与病毒复制酶相关,ORF2编码的Cap蛋白为病毒核衣壳,是病毒保护性抗原。为比较这3种蛋白作为亚单位疫苗的免疫保护性,本研究以重组杆状病毒表达的PCV2-rRep、-rRep'和-rCap蛋白制备亚单位疫苗及PCV2灭活苗,分组免疫BALB/c鼠进行攻毒,以评价疫苗的免疫保护力。对PCV2-rRep和-rRep'亚单位疫苗免疫鼠血清ELISA抗体检测表明,于免疫后第14 d抗体全部转阳,第35 d抗体效价分别达到1∶42 667和1∶51 200。PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫组于第21 d抗体转阳,第35 d抗体效价分别达1∶2 133和1∶333。攻毒试验表明,PCV2-rCap亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠获得完全保护;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫组无保护作用。血清中和试验表明,PCV2-rCap蛋白亚单位疫苗和PCV2灭活苗免疫鼠血清中和抗体效价达1∶1 600和1∶800;而PCV2-rRep和-rRep'蛋白亚单位疫苗免疫鼠血清无中和病毒能力。该研究表明,PCV2-Cap蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫保护力,可以与PCV2自然感染猪产生的抗Rep蛋白抗体相鉴别,具有良好的开发前景。

猪圆环病毒2型Rep'蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

为制备猪圆环病毒2型Rep'蛋白单克隆抗体(MAb),本研究采用淋巴细胞瘤杂交技术制备其MAb,获得了1株能够稳定分泌抗PCV2-Rep'蛋白的杂交瘤细胞株,命名为3D1株。MAb亚类鉴定为IgG1/κ型,腹水效价达1∶819 200。Western blot分析表明,该MAb可与重组杆状病毒表达的PCV2-rRep'和PCV2-rRep蛋白发生特异性反应,具有良好的特异性和反应原性。采用MAb对PCV2感染细胞中Rep'蛋白抗原性进行了鉴定,证明该MAb能够与病毒Rep'蛋白产生特异性反应。采用合成肽扫描法对MAb对应的抗原表位鉴定,其核心序列为61FANFVKKQTFNKV73,位于PCV2-Rep'蛋白的N末端。制备的MAb及其抗原表位鉴定,为该病毒分子生物学及诊断技术的研究奠定了基础。

猪圆环病毒Ⅱ型rep蛋白的亚细胞定位生物信息学析

从GenBank发表的PCV-2全基因组序列,随机选择其中的32个全基因序列,做序列比对和同源性比较,绘制系统进化树,在注释中找到ORF1编码的rep蛋白氨基酸序列,用在线生物信息学工具对其进行亚细胞定位分析。结果基本符合"来自同一地区的基因序列同源性较高"的规律,表明了PCV的高度保守性,亚细胞定位分析发现其rep蛋白定位于核区的指数为0.76,这与病毒在宿主细胞核内复制分不开。结果同时表明其定位于过氧化物酶体的指数显著不同于其他(过氧化物酶体平均0.36,可变,溶酶体、线粒体均为0.1不变)这可能与pcv的组织嗜性以及复制靶细胞(多为单核/巨噬细胞)的原因相关。

PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响

N-糖基化对病毒的感染与增殖均具有重要作用,与PCV2复制相关的Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。为了分析PCV2Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响,本试验构建了三个双拷贝突变体感染性克隆2M23、2M256、2M286,并成功拯救病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果,TCID50测定病毒的感染力,荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示,PCV2Rep蛋白的23~25aa、256~258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力,而286~288aa突变后增强病毒的复制能力,为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考。

猪圆环病毒2型Rep蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白单克隆抗体。PQE30-PCV2Rep蛋白在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE对表达产物进行检测。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,ELASA法鉴定抗体亚型及效价。结果显示重组蛋白PQE30-PCV2Rep得到高效表达,筛选获得了3株稳定分泌抗Rep蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系1G4、2G4和6H12,其分泌的抗体分别为IgG2a、IgG2b、IgG2b亚型。其中,6H12抗体效价为256K,浓度为0.47mg/mL,纯度>90%。本研究制备的单克隆抗体有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速诊断提供了新的方法。

猪圆环病毒2型Rep蛋白在真核细胞中的表达与定位

为了构建Rep蛋白真核表达质粒,研究PCV2复制过程中的亚细胞分布。本研究借助PCR方法扩增PCV2的Rep基因,并将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-C3中,并转染PK15细胞和Vero细胞。结果显示,重组的pEGFP-PCV2-Rep融合蛋白能够在PK15细胞和Vero细胞中表达。结论认为pEGFP-PCV2-Rep质粒转染PK15细胞和Vero细胞后48h,PCV2的Rep蛋白主要定位在PK15细胞和Vero细胞的细胞核。

猪圆环病毒2型Rep抗体间接ELISA检测方法的建立

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)是一种广泛存在于猪体内的DNA病毒。养猪场中猪的PCV2感染率较高,为区分自然感染猪和疫苗免疫猪,以大肠杆菌表达的PCV2 Rep蛋白为包被抗原,通过优化反应条件建立PCV2 Rep抗体检测的间接ELISA方法。原核表达的Rep蛋白大小40ku,经过变性亲和层析纯化后目的蛋白纯度为95.1%,批次内和批次间血清检测变异系数均低于10%,表明Rep-ELISA具备良好的稳定性。血清学交叉试验显示Rep-ELISA具有良好的特异性;猪免疫试验结果表明Rep-ELISA能检测出PCV2全病毒疫苗免疫以及接种PCV2 SD/2017活毒的猪血清中的Rep抗体,而不能与PCV2亚单位疫苗免疫猪血清中的抗体发生免疫结合反应。研究结果表明,所建立的ELISA方法能有效鉴别自然感染或全病毒灭活疫苗免疫猪与亚单位疫苗免疫猪,可用于猪群中PCV2的净化。

对不同表达系统的猪圆环病毒2型Rep蛋白的电泳特性分析

利用特异性引物从圆环病毒2型(PCV2)毒株克隆出Rep基因,并将其插入到原核表达载体pET28 a和杆状病毒转移载体pFastbacHT(B)上,利用大肠杆菌BL21(DE3)株原核系统以及Bac-to-Bac杆状病毒系统表达Rep蛋白.Western-blotting表明,原核和真核表达系统均能表达出圆环病毒2型Rep蛋白,电泳分析表明,不同系统表达得到的Rep蛋白有不同的电泳特性,揭示Rep蛋白存在翻译后修饰.

猪圆环病毒2型REP蛋白的原核表达及免疫原性鉴定

[目的]开发和研制鉴别猪圆环病毒疫苗免疫和野毒感染的ELISA检测试剂盒。[方法]根据NCBI数据库录入的2型猪圆环病毒(porcine circovirus 2,PCV-2) REP蛋白序列(Gen Bank登录号为KX828581)设计引物,利用PCR扩增REP蛋白全长基,构建原核表达载体p ET-28a-rep,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。[结果]经过SDS-PAGE分析,获得了大小约40 ku的目的蛋白,与理论大小相一致。重组蛋白经镍柱纯化后重组蛋白浓度为40μg/m L,纯度约95%。Western Blot及ELISA鉴定结果显示,该重组蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。[结论]鉴于该重组蛋白具有良好的免疫原性及反应原性,该重组蛋白可为开发区分猪圆环病毒2型疫苗免疫和野毒感染的检测试剂盒奠定基础。

猪圆环病毒2型复制酶蛋白的胞内互作蛋白研究进展

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus virus type 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)以及其他猪相关疾病的主要病原体。复制酶(Replicase,Rep)蛋白是由PCV2 ORF1基因编码的功能性复制启动蛋白,通过与ORF1编码的另一复制相关蛋白Rep′共同作用参与PCV2的DNA滚环复制。Rep蛋白作为PCV2的一种必需功能性蛋白,是研究PCV2抗病毒治疗的一个新突破口。然而,目前有关PCV2致病机理及疫苗的研究大多集中在Cap蛋白,对于Rep蛋白的作用机制研究较少。因此,本文结合国内外近年研究进展,对PCV2 Rep蛋白的胞内互作蛋白进行了系统分析,尤其对现今已发现的8种胞内互作蛋白在PCV2复制过程中可能发挥的重要作用及机制进行了阐释,并对其他可能与PCV2 Rep蛋白存在相互作用的胞内蛋白进行预测,以期为进一步阐明Rep蛋白在PCV2致病中的作用提供理论依据。

猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因的克隆与表达

根据GenBank猪圆环病毒2型基因序列,设计合成两对特异性引物,对厦门株-1进行PCR扩增,得到ORF1和ORF2基因。将PCR产物酶切后,插入到pET-22b载体中,构建原核表达载体pET-22b/ORF1、pET-22b/ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE_3),经IPTG诱导表达,收集茵液进行SDS-PAGE分析。确定重组蛋白主要以包涵体的形式表达,包涵体洗涤溶解后,采用Ni^(2+)离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白,逐步透析法进行复性。Western blot和ELISA分析结果表明Rep蛋白和Cap蛋白均能与猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性反应。