lncRNA ZNF674-AS1通过miR-510-5p/REPS2轴调控宫颈癌细胞HCC94的增殖和迁移

目的:探讨lncRNA ZNF674-AS1在宫颈癌中的作用及其分子机制。方法:用qPCR法检测ZNF674-AS1在31例2019年1月至2020年7月在武汉儿童医院接受手术治疗患者的宫颈癌组织和对应的癌旁组织、宫颈癌细胞系(SiHa、HeLa、C33A和HCC94)和永生化子宫颈上皮细胞系中的表达。转染过表达ZNF674-AS1质粒及其阴性对照质粒至ZNF674-AS1表达最少的HCC94细胞,CCK-8法和Transwell实验检测过表达ZNF674-AS1对HCC94细胞增殖活性和迁移能力的影响。生物信息学方法预测和双荧光素酶报告基因实验验证ZNF674-AS1和miR-510-5p、REPS2三者间的互补结合关系。qPCR检测过表达ZNF674-AS1对miR-510-5p与REPS2表达的影响,WB法检测过表达ZNF674-AS对细胞增殖和迁移相关因子表达的影响。结果:与癌旁组织相比,ZNF674-AS1在宫颈癌组织中呈明显低表达(P<0.01);与永生化子宫上皮细胞相比,ZNF674-AS1在宫颈癌细胞系中也呈明显低表达(P<0.05或P<0.01),以HCC94细胞中表达最低(P<0.01)。过表达ZNF674-AS1能明显抑制HCC94细胞的增殖(P<0.05)和迁移(P<0.01)。与ZNF674-AS1相互作用的miRNA是miR-510-5p,与miR-510-5p相互作用的基因是REPS2。过表达ZNF674-AS1导致HCC94细胞中miR-510-5p的表达水平降低(P<0.01)而REPS2基因的表达水平升高(P<0.01),同时引起细胞增殖和迁移相关的多种因子(CDK2、cyclin D3、vimentin和twist)上调或下调。结论:lncRNA ZNF674-AS1在宫颈癌组织和细胞中呈低表达,可能通过竞争性结合miR-510-5p而上调REPS2的表达,从而抑制宫颈癌HCC94细胞的增殖和迁移。

miR-675调控低氧诱导肺动脉平滑肌细胞的增殖

目的探讨miR-675对低氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的调控作用及相关机制。方法低氧(1%O2)处理PASMCs 48 h,利用Real time-PCR检测0、6、12、24和48 h时各个时相点miR-675的表达水平,应用Western blot检测低氧处理PASMCs 48 h后靶基因REPS2蛋白的表达情况。先合成miR-675抑制剂(inhibitor)再将其和阴性对照(NC)转染PASMCs细胞,24 h后再进行低氧处理从0h至48 h,应用MTT法检测0、12、24、48 h时细胞的活力,并检测REPS2蛋白的表达状况。构建野生型和突变型REPS2 3'UTR插入p MIR-REPORTTMluciferase vector载体,并将其与pRL-TK质粒共转染PASMCs细胞,之后将miR-675 inhibitor和NC分别转染PASMCs细胞,利用双荧光素酶报告基因检测活性。在常氧下先分别转染miR-675 inhibitor或模拟物(minic)48 h,再检测PASMCs中REPS2的表达水平。结果随着低氧处理时间的延长,miR-675在PASMCs细胞中的表达水平逐渐增高(P<0.05)。而与对照组比较,REPS2蛋白在低氧处理的PASMCs细胞中表达显著下调(P<0.05)。miR-675 inhibitor组在24 h和48 h的细胞活力显著低于对照组和miR-NC组(P<0.01)。荧光素酶报告基因结果说明REPS2是miR-675的靶基因。在常氧环境上调miR-675可显著下调REPS2蛋白表达,而在常氧和低氧环境下抑制miR-675的水平可明显升高REPS2蛋白表达。结论 miR-675通过下游靶基因REPS2调控低氧诱导的PASMCs的异常增殖,可能是低氧肺动脉高压、肺源性心脏病等疾病治疗的潜在靶点。

猪源转录因子AP-2δ通过增强rep基因启动子活性促进猪圆环病毒2型的复制

本研究旨在探究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2, PCV2)能否借助rep基因启动子区的转录因子结合位点调控自身基因转录,并寻找参与这一调控过程的宿主因子。凝胶迁移实验证实rep基因启动子具有核蛋白结合活性。DNA-pull down联合液相-串联质谱分析鉴定到了可与rep基因启动子结合的猪源转录因子AP-2δ(Porcine transcription factor AP-2δ, poTFAP2δ)。双荧光素酶报告基因试验、实时荧光定量PCR、免疫印迹及间接免疫荧光等试验证明poTFAP2δ不仅可以特异性地增强rep基因启动子活性,而且可以在PCV2感染过程中促进rep和cap基因的转录、翻译及PCV2病毒滴度。文中揭示了PCV2利用宿主蛋白促进自身增殖的分子机制,为进一步从病毒与宿主互作角度阐明PCV2的致病机制提供新的研究思路,亦为PCV2高效疫苗的研制提供理论基础。