过表达RFX1对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨过表达调节因子X1基因(regulatory factor X1,RFX1)对神经胶质瘤细胞株F98细胞增殖和侵袭能力的影响及其作用机制。方法:用慢病毒转染法将RFX1转染到F98细胞,构建过表达RFX1的F98细胞株(F98-RFX1组),同时设立空质粒对照组(F98-Vector组)和正常培养组(F98组)。用计数法观察过表达RFX1对各组F98细胞增殖的影响,用AnnexinV/PI染色法流式细胞术检测过表达RFX1对F98细胞凋亡的影响,用Transwell小室法检测过表达RFX1对F98细胞侵袭能力的影响。结果:成功建立过表达RFX1胶质瘤F98细胞株。过表达RFX1组胶质瘤F98细胞的增殖能力显著低于F98组[48 h:(12.08±2.17)×10~4/ml vs(23.67±4.51)×10~4/ml,P<0.05]和F98-Vector组[96 h:(8.17±0.31)×10~4/ml vs(18.58±1.18)×10~4/ml;P<0.05];过表达RFX1组细胞的凋亡水平明显上升[(21.89±2.33)%vs(3.38±1.39)%、(10.42±1.83)%,P<0.05];过表达RFX1组细胞侵袭能力显著下降[(33.3±7.99)vs(56.5±13.9)、(60.6±11.8)个,P<0.01]。结论:RFX1可以调控增殖和侵袭相关基因的表达,进而抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力、促进细胞凋亡。

小鼠NPC细胞RFX1ChIP-Seq数据分析

利用NCBI数据库中小鼠Embryonic Stem Cells(ESC)与Neural ProgenitorCells(NPC)的基因芯片结果及NPC时期的RFX1ChIP-Seq数据,进行有关RFX1的分析,结果表明:RFX1结合位点富集在1,2,4,5,7,9,11染色体上,Y染色体上最少,其他染色体上比较均衡;在基因组中结合位点分布区域主要在基因的promoter区域,约有53.2%,其次是intergentic,占22.5%,body区域,占13.1%,enhancer区域,占11.2%.说明RFX1是以结合在基因的promoter区为主要形式对目的基因进行调控.同时在DAVID数据库中用生物信息学方法探索了RFX1靶基因的生物学功能分类.

NFY和RFX1对人PNRC启动子的调控作用

探讨核因子Y(nuclear factor Y,NFY)和调节因子X1(regulatory factors that bind to the X box,RFX1)对人PNRC(proline-rich nuclear receptor coactivator)基因的调控作用及机制.根据凝胶电泳迁移率变化实验,分析NFY和RFX1与PNRC启动子区域的结合.将含有NFY和RFX1的真核表达质粒(pCMV-NFY,pCMV-RFX1)和含有PNRC启动子的荧光素酶报告基因质粒共转染HepG2细胞,检测转染细胞的荧光素酶活性,并用RT-PCR和Western印迹检测PNRC的表达情况.Quick-Change法对PNRC启动子区NFY和RFX1结合位点进行突变,将包含突变点的重组荧光素酶报告质粒与含有NFY和RFX1的真核表达质粒共同转染HepG2细胞,检测各组荧光素酶活性.结果发现,NFY和RFX1能与PNRC启动子区域特异性结合;转染pCMV-NFY和pCMV-RFX1可抑制PNRC启动子活性并下调PNRC在HepG2细胞中的表达;包含NFY和RFX1结合位点的突变质粒与pCMV-NFY和pCMV-RFX1共转染后,NFY和RFX1对PNRC启动子活性的抑制作用消失.以上结果提示,NFY和RFX1能调控PNRC基因的表达,其机制是与PNRC启动子区域的特异性结合位点相结合,发挥其反式抑制作用.

转录因子RFX1过表达对胰腺星状细胞LTC-14自噬相关蛋白的影响

【目的】探讨转录因子RFX1过表达对胰腺星状细胞LTC-14自噬相关蛋白的影响。【方法】在LTC-14细胞中过表达Flag-RFX1质粒,并加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导,通过Western blotting检测Flag-RFX1对自噬信号通路蛋白磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)-p110、PI3K-p85、自噬相关基因Beclin1、ATG5、ATG12、ATG7、LCⅠ/Ⅱ、p62蛋白以及LTC-14激活标志蛋白α-SMA表达水平的影响。在LTC-14细胞中浓度依赖性地过表达Flag-RFX1质粒,Western blotting检测上述蛋白的变化。【结果】LPS诱导的LTC-14细胞中RFX1蛋白表达水平降低(P<0.05),Beclin1、ATG5、ATG12、ATG7、LCⅡ蛋白表达水平均升高(P<0.05),p62蛋白表达水平降低(P<0.05),且α-SMA蛋白表达水平升高(P<0.05);而过表达Flag-RFX1质粒后,LPS诱导的LTC-14细胞中上述指标表达水平均逆转(P<0.05);并且,Flag-RFX1呈浓度依赖性地下调Beclin1、ATG5、ATG12、ATG7、LCⅡ的蛋白表达,上调p62的蛋白表达水平,浓度依赖性地抑制α-SMA的蛋白表达。【结论】转录因子RFX1过表达通过PI3K通路下调LTC-14细胞的自噬水平,进而抑制LTC-14细胞的激活。

转录因子RFX1抑制胰腺星状细胞LTC-14分泌细胞外基质的机制研究

【目的】研究转录因子RFX1对大鼠胰腺星状细胞LTC-14分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的影响,并探究其分子机制。【方法】在LTC-14细胞中过表达Flag-RFX1质粒,并加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导,通过western blotting检测Flag-RFX1对Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)、髓样分化蛋白88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、核因子κB-p65(nuclear factorκB-p65,NF-κB-p65)、磷酸化NF-κB-p65(phosphorylation of nuclear factorκB-p65,p-NF-κB-p65)、NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of nuclear factor kappa B alpha,IκBα)、磷酸化IκBα(phosphorylation of inhibitor of nuclear factor kappa B alpha,p-IκBα)蛋白表达的影响,ELISA检测ECM中Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(collagenⅢ,COL-Ⅲ)、纤连蛋白(fibronectin,FN)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌水平。在LTC-14细胞中浓度依赖性地过表达Flag-RFX1质粒,western blotting和ELISA实验检测上述因子的变化。【结果】LPS诱导的LTC-14细胞中TLR4、MyD88、p-NF-κB-p65、NF-κB-p65和IκBα蛋白表达水平均升高(P<0.05),p-IκBα蛋白表达水平降低(P<0.05),且Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN和TNF-α的分泌水平升高(P<0.05);而过表达Flag-RFX1质粒后,LPS诱导的LTC-14细胞中上述指标表达水平均逆转(P<0.05);并且,Flag-RFX1呈浓度依赖性地下调TLR4、MyD88、NF-κB-p65和IκBα的蛋白表达,上调p-IκBα的蛋白表达水平,浓度依赖性地抑制Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN和TNF-α的分泌。【结论】转录因子RFX1通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB-p65信号通路下调胰腺星状细胞分泌的ECM中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、FN和TNF-α的表达水平。