携带RGD多肽的嵌合型腺病毒载体AD11-RGD-4C-EGFP的构建及其感染效率的研究

目的在嵌合型腺病毒的fiber中插入具有整合素特异性的RGD肽,构建可提高腺病毒感染效率的腺病毒载体,观察其对人肝癌细胞株HepG2、BEL-7404以及成纤维细胞BJ的感染效率。方法将RGD-4C插入到AD5/11嵌合型腺病毒载体fiber的HI区,与腺病毒骨架质粒pPE3共转染大肠杆菌BJ5183,同源重组产生腺病毒重组质粒(pPE3-F11-RGD-4C),该重组质粒与PDC328-EF1-EGFP共转染人胚肾293细胞进行包装,产生重组腺病毒(AD11-RGD-4C-EG-FP)。用该重组腺病毒感染HepG2、BEL-7404以及BJ细胞,通过荧光显微镜观察感染效率。结果所构建的重组腺病毒PCR扩增出1 123 bp包含目的片段的基因片段。同时,制备了高滴度的重组病毒,纯化后病毒滴度为1.3×1010pfu/ml。当MOI=10,48 h时该重组病毒对HepG2、BEL-7404及BJ细胞的感染效率明显高于对照组腺病毒(AD11-EGFP)。结论成功构建了可提高腺病毒感染效率的嵌合型腺病毒(AD11-RGD-4C-EGFP),为进一步的研究奠定了基础。

RGD基序邻近氨基酸突变对口蹄疫病毒O/JC/2010株毒力的影响

为了研究RGD基序邻近氨基酸位点对口蹄疫病毒毒力的影响,利用O/JC/2010株病毒的基因组全长cDNA分子克隆,置换O/HN/93株病毒的VP1基因,拯救获得了1株嵌合病毒(pBlue-HJ);除此之外,在O/JC/2010VP1的3个氨基酸位点进行突变P142T、A152D、Q153P,分为4组,拯救出4株突变病毒:pBlue-HJ(142)、pBlue-HJ(142+152)、pBlue-HJ(152+153)、pBlue-HJ(142+152+153)。比较这5株病毒的LD50和TCID50特性,发现P142T、A152D可以增强口蹄疫病毒对BHK-21细胞和乳鼠的致病力,而Q153P则相反。该试验证明RGD基序附近的非保守氨基酸位点对口蹄疫病毒的毒力存在影响,为进一步阐明口蹄疫病毒的分子致病机制奠定了基础。

几种靶向抑制整合素αvβ3多肽的设计及活性比较

目的设计6种靶向抑制整合素αvβ3的多肽,并对其活性进行初步评估。方法根据锯鳞血抑肽空间结构及相关技术方法,设计6种含RGD环(即精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸序列)的多肽,分别编码为cEchi-L-1、cEchi-L-2、Ω-Echi、Echi-L、cEchi-M、c Echi。经高效液相法(HPLC)进行纯化;Western blot法检测不同结直肠癌细胞中整合素αvβ3的表达,选择出表达量较高的细胞;MTT法对多肽活性进行初步评估。结果纯化后6种多肽纯度均> 95%。HCT 116细胞中整合素αvβ3的表达较高。多肽c Echi-L-1及c Echi-L-2对HCT 116细胞具有一定的抑制效果,IC50分别为59. 92和18. 33μmol/L。结论筛选获得了两条具有一定抗肿瘤活性的多肽,且锯鳞血抑肽C-末端序列的活性及RGD环之间的氨基酸数量可能影响多肽的抗肿瘤活性。