RGD模体在肿瘤诊断与靶向治疗方面的研究现状

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginyl-glycyl-aspartic acid,RGD)模体是一类含有RGD序列的短肽,有环形和线性两类,可以竞争性结合整合素受体,阻止肿瘤细胞与细胞外基质的黏附,还可以直接诱导肿瘤细胞凋亡,通过阻断整合素-斑点黏附激酶途径,抑制肿瘤细胞黏附、增殖、侵袭、转移。该类肽与整合素结合成为抗肿瘤药物设计的靶点。随着对其分子机制的深入研究,越来越多的含RGD模体的药物被运用于肿瘤的早期诊断和临床抗肿瘤的治疗。

含RGD模体的人白细胞介素18(IL-18)突变体的酵母表达及其抗血小板聚集活性

利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL18)cDNA序列中插入GGC序列,使IL18第39位精氨酸残基和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体.此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichiapastoris酵母GS115,利用表达系统进行了高效表达.用SephadexG100凝胶过滤纯化表达产物,获得初步纯化的蛋白.对该蛋白进行了血小板聚集抑制实验和对GPⅡbⅢa与Fn结合的抑制实验.含RGD模体的重组IL18(IL18RGD)显示了较强的体外抑制血小板聚集活性,IC50=8.8μmolL;并具有与GPⅡbⅢa的竞争结合活性,IC50=8.0μmolL.该含有RGD模体的重组IL18仍保存对PBMC诱导产生IFNγ能力.结果表明,此IL18RGD嵌合体在具有抗炎,抗感染的同时增添了新的抑制血小板聚集功能.

人白介素18(IL-18)RGD模体抗黑色素瘤细胞B16活性研究

利用定点突变及DNA重组技术,在人白细胞介素18(IL-18)的cDNA序列中插入了GGC序列,使IL-18第39精氨酸残基和第40天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体。此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并转化Pichia Pastoris酵母GS115,利用表达系统进行了高效表达。用Sephadex G-100凝胶过滤纯化表达产物,获得初步纯化的蛋白。研究表明,IL-18在体外对黑色素瘤细胞株B16没有作用,而IL-18-RGD抑制作用明显,IC50=8·10μmol/L;应用小鼠动物模型研究结果显示,IL-18及IL-18-RGD均对黑色素瘤细胞B16有抑制作用,且IL-18-RGD比IL-18的作用强;同时,对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoicmembrane,CAM)血管生成的抑制实验发现,IL-18-RGD对CAM血管生成的抑制作用也比IL-18强。但IL-18-RGD仍保存对PBMC诱导产生IFN-γ能力。结果提示,IL-18-RGD在具有抗炎,抗感染作用的同时增添了抑制肿瘤血管新的功能。

表面展示RGD模体重组噬菌体的构建和鉴定

将RGD多肽编码序列克隆至辅助噬菌体M13KO7 PⅢ基因中,获得重组载体M13KO7-RGD,包装噬菌粒pAAV-GFP后获得重组噬菌体颗粒,通过透射电子显微镜观察形态,Western-blot鉴定PⅢ-RGD融合序列的表达。将其转导不同哺乳动物细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达。结果表明:成功获得展示RGD模体的重组噬菌体颗粒,且具有典型丝状噬菌体形态特征,转导不同细胞系后有绿色荧光蛋白表达,提示该重组噬菌体能够导入哺乳动物细胞,为动物基因工程疫苗载体的研发提供新的思路。

人白介素18(IL-18)插入突变体抗血管新生作用的研究

目的构建IL-18的定点突变体,并研究其对血管新生的抑制作用。方法利用基因重叠延伸剪接技术,在人白细胞介素18(IL-18)的cDNA序列中插入一个GGC序列,使IL-18第39位精氨酸和第40位天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基,从而构建了RGD模体。将此cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K,并在酵母PichiaPastorisGS115中得到高效表达。结果IL-18-RGD仍保存对PBMC诱导产生IFN-γ能力外,对ECV304细胞的增殖(IC50=7.80μmol/L)和对ECV304向Fn的黏附均具有明显的抑制作用,且呈剂量依赖关系;而野生型IL-18对ECV304细胞向Fn的黏附则没有作用。结论与野生型IL-18相比,IL-18-RGD增加了抗血管生成作用,从而增强其抗肿瘤能力。

幽门螺杆菌CagL变异体功能研究

目的：CagL作为幽门螺杆菌Cag- T4SS的一个基本组成部分，其通过RGD模体在胃上皮细胞内与整合素α5β1受体结合参与CagA的转运，本研究旨在探讨幽门螺杆菌CagL变异体的功能。方法：在这项研究中,通过组织学分析、体内外IL-8分泌检测、粘附实验和CagA转运实验被采用，发现一种新型的Ass57和Ass58缺失的CagL变异体，该变异体与野生型CagL的功能差别被研究。结果：野生型CagL幽门螺杆菌携带患者，其胃粘膜炎症细胞浸润程度高于CagL变异体携带者（3.20±0.80，1.63±0.32，=0.03）。野生型CagL幽门螺杆菌携带者，其胃粘膜IL-8水平高于CagL变异体携带者（141.57±29.77 pg/mg和104.96±21.50 pg/mg，〈0.01）。野生型CagL组GES-1细胞IL-8分泌含量高于CagL突变组（1544.87±112.61 pg/ml和1277.36±89.19 pg/ml，〈0.01）。CagL突变组的粘附活性低于CagL野生组[（11.38±1.04）×10^6和（16.70±1.47）×10^6，〈0.01）]，CagA的转运实验也出现了相似的结果。结论：我们发现新的CagL变异体可能是通过改变CagL三维结构的稳定性以减弱幽门螺杆菌的致病性。

重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-RGD3表达及对Hela细胞活性的影响

为研究重组七鳃鳗细胞毒素蛋白rLj-RGD3的抗肿瘤活性,确定其生物学地位及意义,本研究提取成体七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺组织总RNA,经RT-PCR获得cDNA序列长度为357bp的目的基因片段,将其克隆于pET23b载体,获得带有组氨酸标签的分子量为15kD的基因重组蛋白rLj-RGD3的高效可溶性表达,通过组氨酸亲和层析纯化蛋白。采用MTT法检测不同浓度rLj-RGD3对bFGF诱导下的Hela细胞增殖的抑制作用,结果表明rLj-RGD3能显著抑制Hela细胞的增殖,IC50为2.6μmol/L。rLj-RGD3作用后的Hela细胞经Hoechst染色及DNAladder检测结果显示,细胞均发生凋亡。rLj-RGD3对Hela细胞黏附玻连蛋白(VN)作用的实验结果为有效抑制。采用Transwell细胞培养板对bFGF诱导下的Hela细胞迁移实验表明,rLj-RGD3能够抑制Hela细胞的迁移,且抑制率达60%。采用人工基质膜基质Matrigel及Transwell模仿体内环境研究rLj-RGD3对Hela细胞浸润行为实验显示,以bFGF为趋化剂的Hela细胞穿透Matrigel的浸润行为明显受到抑制。以上研究表明,rLj-RGD3具有典型的RGD毒素蛋白的功能,有望应用于抗肿瘤基因工程药物开发,具有重要的生物学意义。