携RGDS超声造影剂的制备及体外靶向血栓研究

目的探讨制备携精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Arg-G ly-Asp-Ser,RGDS)靶向脂膜超声造影剂的制备,并对靶向微泡的特性及靶向作用进行初步鉴定。方法分别采用酰胺键共价键合的方式和表面吸附法将脂膜超声造影剂与RGDS血栓靶向短肽片段进行结合;制备产物通过流式细胞仪进行携带率和稳定性的检测;对内源性凝血途径产生的血栓进行寻靶作用研究。结果流式细胞仪显示共价键合RGDS脂膜超声造影剂其微泡外壳波长发生了明显变化,显示改变率达到82%,而表面吸附法制备的靶向超声造影剂改变率达到23%;激光共聚焦显微镜显示携带RGDS的脂膜超声造影剂在大量的PBS液清洗后,对离体血栓仍具有很强的靶向性和稳定性,而表面吸附法制备的靶向超声造影剂在大量PBS液清洗后,失去了其靶向性。结论采用共价键合的化学修饰方法可以成功制备稳定性好的亲血栓靶向脂膜超声造影剂。

RGDS肽对TGFβ刺激肝星状细胞分泌细胞外基质的影响

探讨RGDS肽体外对TGFβ1刺激肝星状细胞分泌细胞外基质的影响。从正常大鼠肝脏中分离肝星状细胞原代培养 ,分 6组 ,单纯对照组 ,TGFβ1对照组 ,RGDS组 ,RGDS +TGFβ1组、RGES +TGFβ1组及IFNα - 2b+TGFβ1组。应用酶联免疫吸附测定方法检测各组培养上清中的Ⅲ型胶原。RGDS +TGFβ1组和IFN +TGFβ1组Ⅲ型胶原水平明显低于TGFβ1对照组、RGES对照组 (P <0 0 5 )。

血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂RGDS对血小板释放反应的影响

【目的】观察血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)拮抗剂——四肽Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS)对血小板聚集和CD62p表达的作用,探讨RGDS对血小板聚集和释放反应的影响。【方法】检测二磷酸腺苷(ADP;终浓度5μmol/L,下同)诱导血小板聚集的最大聚集率(rPA,max)、静息血小板和ADP诱导的血小板CD62p表达,检测不同浓度RGDS对ADP诱导的rPA,max的抑制率和血小板CD62p表达的抑制率,进行回归分析。【结果】5种浓度(50、100、200、400、800μmol/L)的RGDS对rPA,max均有显著抑制作用。正常人静息血小板CD62p表达率为(3.5±0.6)%;ADP激动的血小板CD62p表达率为(65.6±13.8)%,两组比较有显著性差异(P<0.01);50、100μmol/L的RGDS对血小板CD62p表达无抑制作用;当RGDS浓度≥200μmol/L时(200、400、800μmol/L),其可抑制血小板CD62p的表达;RGDS对rPA,max的抑制作用和其对血小板CD62p表达的抑制作用相关。【结论】RGDS浓度<200μmol/L时,对ADP诱导的血小板释放反应无影响;RGDS浓度≥200μmol/L时,可抑制ADP诱导的血小板释放反应;与RGDS显著的抗聚集效应相比,其对血小板释放反应的影响比较小;RGDS抑制血小板释放反应的作用与其抗血小板聚集有关。

Subtilisin FS33 RGDS-载酶纳米脂质体的制备与效果评价

研究评价了Subtilisin FS33 RGDS-载酶纳米脂质体的制备及其效果。按照正交设计试验确定硫酸铵梯度法制备载酶脂质体的工艺条件为:胆脂比1∶2,硫酸铵浓度为0.15 mol/L,孵化温度为45℃,酶脂比1∶1。制得的载酶脂质体粒径在50～150 nm左右,属于纳米级单室脂质体。在制备RGDS-载酶脂质体的工艺过程中,制备开始时就加入氨基酰化修饰的RGDS衍生物,其成品脂质体中RGDS含量可达到93μg/mL,并有利于分布于脂质体表面。RGDS-纳米脂质体中酶对于高温、极端pH、模拟胃肠道环境等条件的稳定性都有明显提高;酯酶存在时,脂质体中FS33释放速度明显加快,并可使血凝块完全溶解,表现出较好的溶栓效果。

携RGDS的靶向超声造影剂的制备及鉴定

目的制备血栓靶向脂膜超声造影剂,并对其理化特性及靶向作用进行鉴定。方法将脂膜超声造影剂通过酰胺键共价键键合的方式与血栓靶向短肽片段(RGDS)进行结合。制备产物通过流式细胞仪进行携带率和稳定性的检测;对内源性凝血途径产生的血栓进行寻靶特性研究。结果流式细胞仪显示携带RGDS的脂膜超声造影剂其波长发生了明显变化,携带率达到82%;激光共聚焦显微镜显示携带RGDS的脂膜超声造影剂对离体血栓具有很强的靶向性和稳定性。结论采用共价键键合的化学修饰方法成功制备了亲血栓靶向脂膜超声造影剂。

RGDS和胶原改性聚(DL-乳酸)的合成与表征

利用马来酸酐(MAH)、丁二胺(BDA)I、型胶原和RGDS粘附多肽依次对聚(DL-乳酸)进行了化学改性,制得了仿生细胞外基质材料——胶原改性聚乳酸(CPLA)和RGDS改性聚乳酸(RGDS-PLA)。采用FT-IR、GPC-MALLS、XPS、罗丹明比色法和茚三酮显色法对MAH改性聚乳酸(MPLA)和BDA改性聚乳酸(BDPLA)进行了定性定量表征,分别采用FITC荧光标记技术和氨基酸分析仪对CPLA和RGDS-PLA进行了定性定量测定。结果表明,按文中所述之制备技术,能将胞外基质组分如胶原和RGDS粘附多肽共价引入到PLA中,形成新型的仿生细胞外基质材料。

携RGDS的脂膜氟烷超声造影剂增强血栓显影的实验研究

目的探讨携RGDS的脂膜超声造影剂对体外血栓的显影效果。方法健康人体新鲜血块10块,大小2cm×1cm×1cm,以蠕动泵为循环动力,以4%琥珀酰明胶注射液为循环液,输液器为材料建立一密闭式体外循环系统,模拟人体体循环,血块置于容器内,观察携RGDS的脂膜超声造影剂和非靶向脂膜超声造影剂对血栓的显像效果。结果模拟体循环时间30s,二维超声显示,非靶向超声造影剂组血栓表面线状回声增强,内部无增强;靶向超声造影剂组血栓表面回声增强,内部回声显著增强;超声检测后行冰冻切片显微镜观察,非靶向造影剂组100倍下观察,血栓切片边缘有少量微泡黏附,400倍下,可见血栓纵隔缝隙内少量微泡存在;靶向组100倍下即可见到密集的微泡分布,400倍下血栓纵隔缝隙内密集线状分布的微泡。结论携RGDS的脂膜超声造影剂可显著增强新鲜血栓超声显像。

肽6A与RGDS肽对大鼠颈总动脉血栓形成的影响

在２０％ＦｅＣｌ３造成大鼠颈总动脉血栓形成的模型上，分别预防（血栓形成前）和治疗（血栓形成后）应用合成的纤维蛋白（原）降解肽片段，肽６Ａ（５０μｍｏｌ／ｋｇ）和ＲＧＤＳ（１０μｍｏｌ／ｋｇ）或联合肽６Ａ（２５μｍｏｌ／ｋｇ）与ＲＧＤＳ（５μｍｏｌ／ｋｇ）静脉滴注，明显抑制动物的血栓形成，使血浆和血管组织ｃＧＭＰ含量明显增加，肽６Ａ还明显降低血浆纤维蛋白原含量。本工作为肽６Ａ和ＲＧＤＳ作为新型血管再通剂提供了实验依据。

RGDS肽对离体大鼠血小板聚集和ERK1/2磷酸化的影响

目的观察外源性精-甘-天-丝冬氨酸(RGDS)肽对离体大鼠血小板聚集及细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)磷酸化的影响,探讨RGDS肽对血小板聚集的作用与ERK1/2磷酸化表达改变的关系。方法用比浊法测定血小板最大聚集率;Western-blot测定血小板ERK1/2磷酸化表达。结果RGDS肽抑制血小板聚集后伴随ERK1/2磷酸化表达减少。结论ERK1/2通路参与血小板聚集;抑制ERK1/2磷酸化表达可能是外源性RGDS肽抗血栓的机制之一。

RGDS肽抑制活化血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa磷酸化

目的：研究ＡｒｇＧｌｙＡｓｐＳｅｒ（ＲＧＤＳ）肽对血小板聚集和血小板膜ＧＰⅡｂ／Ⅲａ反磷酸化的影响。方法：免疫沉淀提取血小板膜ＧＰⅡｂ／Ⅲａ，反磷酸化测定。结果：５０μｍｏｌ·Ｌ－１ＡＤＰ引起血小板聚集时，其ＧＰⅡｂ／Ⅲａ反磷酸化明显降低。而应用１００和２００μｍｏｌ·Ｌ－１ＲＧＤＳ肽与ＡＤＰ共同孵育，呈浓度依赖抑制血小板聚集的同时，可逆转ＡＤＰ引起的蛋白反磷酸化改变（Ｐ＜０．０１），其抑制血小板聚集和ＧＰⅡｂ／Ⅲａ反磷酸化呈明显的负相关（ｒ＝－０．７６，Ｐ＜０．０１）。

壳聚糖膜固定生物活性短肽RGDS的研究

为改善壳聚糖对细胞的特异性吸附,采用水溶性碳二亚胺将生物活性短肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(RGDS)固定到壳聚糖膜的表面,采用X射线光电子能谱检测固定多肽前后的壳聚糖膜表面,发现反应后壳聚糖膜表面氮元素含量增大,Nls和Cls曲线拟合谱中酰胺键增多,表明RGDS短肽已固定到壳聚糖膜的表面;人角膜缘上皮细胞体外培养实验表明,固定RGDS后壳聚糖膜的细胞黏附率有了明显提高,固定RGDS后的壳聚糖膜在角膜组织工程支架等方面有更好的应用潜力。

RGDS肽对胶元活化的大鼠血小板L-Arginine/NO途径的影响

本工作在胶原活化的大鼠血小板上，观察RGDS肽对血小板聚集、L一精氨酸（L－Arg）转运、一氧化氮合酶（NOS）活性和亚硝酸盐（NO2－）含量的影响。结果发现，4μg／mL胶原引起血小板聚集时，L－Arg转运增强、NOS活性增高和NO2-含量增加。血小板L－Arg转运的Vmax与NOS活性和NO2-生成呈明显正相关（r=0.8100和0.8343，p＜0．01）；血小板聚集与NO2-生成亦呈明显正相关（r=0.7660，P＜0.05）。RGDS肽200μmol／L凡与胶原共同孵育，可明显抑制胶原引起的血小板聚集、L－Arg转运增强、NOS活性增高和NO2-含量增加。提示，胶原激活的血小板L－Arg／NO途径增加是通过Ⅱb／Ⅲa复合物所介导，RGDS肽可括抗其增加作用。

RGDS抑制胃癌细胞BGC-823生长的实验研究

RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）三肽序列是多种细胞外基质蛋白和血浆蛋白结构中共有的基本成分，是存在于细胞间识别系统的基本单位，因此含RGD的多肽或化合物有望成为治疗重要疾病的新制剂。该类肽的黏附性也成为药物设计的一个新靶点。合成的RGD在人体内不稳定，

细胞粘附肽(RGDS)抑制人胃癌细胞BGC823生长及诱导其凋亡

目的研究细胞粘附肽(RGDS)对人胃癌细胞系BGC823(Human stomach cancer BGC823)生长增殖的影响,进而探讨RGDS诱导BGC823细胞凋亡的作用。方法用不同浓度的RGDS处理BGC823细胞48h后,MTT法检测RGDS对BGC823细胞生长增殖的抑制作用,通过HE染色、透射电子显微镜、免疫组织化学、流式细胞术和凋亡细胞的DNA片断等方法观察凋亡细胞的形态结构变化以及定性、定量检测细胞凋亡。结果RGDS能抑制BGC823细胞的生长增殖,并呈浓度依赖性;RGDS诱导BGC823细胞凋亡的作用机制可能通过抑制凋亡抑制蛋白Survivin的表达引发这一途径。结论RGDS能够通过诱导BGC823细胞凋亡,从而抑制肿瘤细胞的增殖。

RGDS肽对大鼠主动脉球囊内膜剥脱后血管壁增殖的影响

在大鼠主动脉球囊内膜剥脱术后血管壁细胞过度增殖模型上，用合成的血小板膜纤维蛋白原受体（ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎⅡｂ／Ⅲａｃｏｍｐｌｅｘ，ＧＰⅡｂ／Ⅲａ）拮抗剂ＲＧＤＳ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ，５０μｍｏｌ·ｋｇ－１·ｄ－１）治疗可有效地抑制损伤血管壁的细胞计数增加和内膜增厚以及血管平滑肌细胞增殖，显著降低其血管组织３Ｈ－ＴｄＲ和３Ｈ－Ｌｅｕ的参入增加程度。实验结果提示ＲＧＤＳ肽作为血管成型术的辅佐剂，对于防治血管再狭窄可能具有潜在的临床应用前景。

RGDS-尿激酶原嵌合体的构建与表达

利用定点突变及ＤＮＡ重组技术，构建了在尿激酶原Ｋ区Ｃ端的β发夹区插入了精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸〔ＲＧＤＳ〕片段的尿激酶原嵌合体基因，并利用昆虫杆状病毒表达系统通过感染Ｓｆ９细胞对野生型及嵌合体尿激酶原进行了高效表达，表达量分别为１２００～１８００ＩＵ／（１０６细胞·ｍｌ）和１８００～２４００ＩＵ／（１０６细胞·ｍｌ）．经过ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子交换层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤层析及超滤浓缩对野生型及突变型进行了部分纯化，并对其性质进行了初步研究．表明突变体尿激酶原保留了全部尿激酶原的纤溶酶原激活活性，并具有很强的抗血小板聚集活性．

新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC转染骨髓基质细胞的条件优化

目的 优化新型靶向性非病毒基因载体——含RGD肽K16GRGDSPC介导转化生长因子β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞的转染条件。方法 固相合成法合成K16GRGDSPC寡肽并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。在保持其它因素一致的条件下，通过变化单一因子来筛选某个最佳参数。结果 合成肽与设计肽的分子量一致，纯度为94％～95％，满足实验要求。在寡肽载体介导转染的过程中，溶酶体抑制剂氯喹起着不可或缺的作用，而且在氯喹溶液中的暴露时间至少应维持在8h以上；在载体／DNA复合物中暴露时间过短（〈4h）或过长（〉24h）对转染都有不利影响；血清对载体／DNA复合物与细胞的结合有明显抑制作用；质粒含量在2～4μg时转染效果最佳；质粒／载体质量比为1：2～1：4时有较高的转染效率；加入转铁蛋白也能显著提高基因的转染和表达，且在25μg时转染效率达到最大。结论 通过优化转染条件可提高寡肽载体的转染效率，可为下一步进行骨基质材料表面基因修饰研究提供基础。

短肽RGDSY-CTTHWGFTLC对乳腺癌细胞转移和增殖的影响

目的研究短肽RGDSY-CTTHWGFTLC对乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤能力,为开发更高效的肽类抗肿瘤药物奠定实验理论基础。方法 (1)化学合成目标短肽RGDSY-CTTHWGFTLC(简称RGDSY-CTT),阳性对照肽CTTHWGFTLC(简称CTT),阴性对照肽STTHWGFTLS(简称STT);(2)将MCF-7细胞接种于预涂布纤连蛋白的96孔板,与短肽共孵育2 h,检测RGDSY-CTT对MCF-7细胞粘附能力的影响;(3)将MCF-7细胞接种于预铺基质胶的Transwell小室,与短肽共孵育16 h,检测RGDSY-CTT对MCF-7细胞侵袭能力的影响;(4)与短肽共孵育12 h后,MTT法检测RGDSY-CTT对MCF-7细胞增殖能力的影响;(5)与短肽共孵育24 h后,PI染色流式法检测RGDSY-CTT对MCF-7细胞凋亡和细胞周期的影响。结果(1)短肽对MCF-7细胞粘附能力的影响:RGDSY-CTT在终浓度为50、100、200μg/ml时,MCF-7细胞的粘附率依次为85.1%、74.1%和63.8%,随着浓度升高,粘附率明显降低,且比CTT组下降更显著(P<0.05);(2)短肽对MCF-7细胞侵袭能力的影响:RGDSY-CTT在终浓度为100、200μg/ml时,对MCF-7细胞的侵袭抑制率分别为41.8%和63.9%;两个浓度均有明显抑制(P<0.01);但与CTT组比抑制无显著差异(P>0.05);(3)短肽对MCF-7细胞增殖的影响:RGDSY-CTT在终浓度为50、100、200μg/ml时,MCF-7细胞的增殖率依次为98.8%、82.4%和63.0%,随着肽浓度升高,增殖率下降明显;在100、200μg/ml时增殖抑制能力比CTT更强(P<0.05);(4)短肽对MCF-7细胞凋亡和细胞周期的影响:RGDSY-CTT处理组MCF-7细胞经流式法检测到凋亡峰,细胞周期阻滞发生在G0/G1期,占76.7%,显著高于CTT组、STT组及正常对照组(P<0.01)。结论 RGDSY-CTT能抑制乳腺癌细胞的侵袭能力,同时还具有抑制乳腺癌细胞粘附、增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的能力。

P6A和RGDS对离体大鼠缺血／再灌注心肌的保护作用

本工作观察两种新型抗凝剂Ｐ６Ａ和ＲＧＤＳ对缺血／再灌注心肌的保护作用。结果表明：再灌注期给予１０￣（－５）ｍｏｌ／Ｌ的Ｐ６Ａ可显著降低再灌注心律失常的发生率，减轻再灌心肌的脂质过氧化和钙超载；１０￣（－６）ｍｏｌ／Ｌ的ＲＧＤＳ具有相似的作用，但二者对心肌局部血管紧张素Ⅱ的生成无明显影响，提示Ｐ６Ａ和ＲＧＤＳ可能是通过调节心肌细胞内的钙稳态来拮抗钙超载的发生，发挥其心肌保护作用。

双靶点抗肿瘤肽RGDSY-CTTHWGFTLC的设计合成及活性研究

目的设计合成CTTHWGFTLC(简称CTT)的衍生肽RGDSY-CTTHWGFTLC(简称RGDSY-CTT),以期获得更优的水溶性、活性和抗肿瘤能力。方法 (1)自行设计RGDSY-CTT肽,化学合成(公司合成),并合成CTT(阳性对照)、STT(即STTHWGFTLS,阴性对照),质谱分析。(2)将Ⅳ型胶原酶、酶底物酪蛋白分别与RGDSY-CTT、CTT共孵育,酪蛋白水解抑制实验检测短肽的抑酶活性。(3)取RGDSY-CTT、CTT分别溶于蒸馏水,以蛋白定量BCA法对比两者的溶解度。(4)MCF-7细胞接种于预涂布纤连蛋白的96孔板,分别与RGDSY-CTT、CTT、STT共孵育,细胞黏附试验比较短肽对MCF-7细胞黏附能力的影响。(5)MCF-7细胞接种于Transwell小室的上室,分别与RGDSY-CTT、CTT、STT共孵育,细胞迁移试验比较RGDSY-CTT与CTT对MCF-7细胞迁移能力的影响。结果短肽合成,质谱分析符合。在浓度为250μg/ml时RGDSY-CTT、CTT对Ⅳ型胶原酶的水解抑制率为53.6%和77.7%;在500μg/ml时,两者抑制率分别为94.6%和96.9%。BCA法测得CTT的饱和溶解度约为745μg/ml,而RGDSY-CTT最高检测值为4 030μg/ml,溶液并未饱和。RGDSY-CTT在终浓度为50、100、200μg/ml时,MCF-7细胞的黏附率依次降低为:85.1%、74.1%、63.8%,黏附率显著低于CTT处理组(P<0.01)。在100和200μg/ml浓度时,RGDSY-CTT对MCF-7细胞的迁移抑制率为42.9%和60.8%;两个浓度RGDSY-CTT的抑制作用均比CTT强(P<0.05)。结论新合成短肽RGDSY-CTT的水溶性较CTT明显改善。RGDSY-CTT获得了抑制肿瘤细胞黏附的能力,并具有比CTT更强的运动抑制能力。