应用RGS双荧光替代性报告载体提高CRISPR/Cas9对猪BMP15基因的打靶效率

我国是家猪养殖和消费大国,提高母猪的繁殖力对于促进我国生猪产业的发展具有重要的作用。排卵率和产仔数是影响家畜繁殖力的关键因素,其中BMP15(bone morphogenetic protein 15)基因已被鉴定是控制绵羊排卵数和多胎性状的一个主效基因,然而目前在家猪BMP15基因中尚未发现类似绵羊多胎品系的天然突变。基于高等哺乳动物基因功能的保守性和CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)等基因组编辑技术对动物基因组定点修饰的高效性,应用CRISPR/Cas9技术对家猪BMP15基因进行精确的遗传修饰,使家猪获得类似多胎绵羊的天然突变,对于研究该基因对家猪繁殖力的影响以及培育高繁殖力家猪新品系具有重要的意义。本研究通过CRISPR/Cas9对长白猪胎儿成纤维(porcine embryonic fibroblasts,PEF)细胞中BMP15基因进行打靶,T7E1分析显示打靶效率仅有5%。随后通过共转染RGS双荧光替代性报告载体(RFP-GFP surrogate reporter),并应用流式细胞术分选出双荧光细胞,富集到基因组被CRISPR/Cas9修饰的细胞,使基因打靶效率提高至18%。本研究结果表明,应用RGS双荧光替代性报告载体可以有效提高CRISPR/Cas9在PEF细胞中对BMP15基因的打靶效率,为今后通过体细胞核移植技术培育BMP15基因编辑猪进行了有效的探索。

CXCR4-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体的构建及与microRNA-494的靶向作用

目的 构建野生型与突变型CXCR4基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证microRNA-494 (miR-494)对CXCR4的靶向调控作用。方法 使用生物信息学相关软件预测miR-494与CXCR4之间的靶向关系;利用PCR法扩增CXCR4的目的基因片段构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体;将miR-494模拟物和阴性对照物分别与野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR或突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR双荧光素酶报告基因载体共同转染NRK-49F细胞,然后进一步检测相对荧光值。结果 成功构建野生型与突变型CXCR4基因3’-UTR的双荧光素酶报告基因载体,荧光结果显示加入miR-494模拟物可使野生型pMIR-CXCR4-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低约52%,但突变型pMIR-CXCR4-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比无显著变化。结论 初步证实miR-494与CXCR4之间存在靶向调控关系。

NOTCH1基因3＇-UTR段双荧光素酶报告载体的构建及其活性鉴定

目的:构建含NOTCH1基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体,并验证其活性。方法:使用PCR方法扩增含NOTCH1基因3'-UTR区序列,插入到双酶切的双荧光素酶报告载体中;使用生物信息学方法预测可能与NOTCH1基因3'-UTR相互作用的miRNA;使用lipofectamine 2000转染试剂将重组质粒或空质粒和miR-34a inhibitor或control真核表达载体共转染HEK293T细胞,双荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。结果:得到含NOTCH1基因3'-UTR(1 648 bp)序列的双荧光素酶报告重组质粒,并用凝胶电泳和基因测序的方法验证。NOTCH1基因3'-UTR上可能有miR-34a的调控作用靶点;用重组质粒和miR-34a inhibitor共转染的HEK293T组的荧光素酶活性比空质粒组高45%。结论:含NOTCH1基因3'-UTR双荧光素酶报告载体构建成功,miR-34a对NOTCH1基因有调控作用。

KLF3基因3′-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

试验旨在构建锌指蛋白3(KLF3)基因3′-UTR区双荧光素酶基因报告载体及其突变载体,初步分析可能调控KLF3基因表达的miRNAs。首先通过PCR方法扩增KLF3基因的3′-UTR序列,将其克隆到经XhoⅠ、NotⅠ双酶切的双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与KLF3基因3′-UTR相互作用的miRNA;使用脂质体2000转染试剂将miRNAs mimics与构建好的KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶报告载体或突变载体共转染于常规培养的293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,KLF3基因3′-UTR可能是miR-21的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-21 mimics组(0.6900±0.0144)比突变组(1.000±0.0688)和空白对照组(1.000±0.0159)KLF3基因3′-UTR双荧光素酶基因报告载体和突变载体的活性降低了31%(P<0.01)。本试验成功构建了含有KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶基因报告载体与突变载体,初步证实miR-21对KLF3基因有调控作用。

ERG基因3'端非翻译区荧光素酶报告载体的构建及其活性

目的构建人ERG基因3'端非翻译区(3'UTR)双荧光素酶报告载体,为研究ERG基因的转录后调控提供实验基础。方法以基因组DNA为模板PCR扩增ERG的3'UTR序列,并连接到psi CHECK2双荧光素酶报告载体的多克隆位点,测序鉴定psi CHECK2-ERG载体构建是否成功。通过生物信息学预测ERG 3'UTR具有miR-145-5p的结合靶点。通过共转染miR-145-5p模拟物和psi CHECK2-ERG载体,检测荧光素酶的活性,以共转染miR-145-5p模拟物对照和psi CHECK2-ERG载体作为参照。结果构建了含有ERG 3'UTR序列的双荧光素酶报告系统,酶切电泳和基因测序证实序列与目标一致。miR-145-5p模拟物和报告质粒共转染者荧光素酶活性明显下降(28.39%,P<0.05)。结论含有ERG 3'UTR的双荧光素酶报告载体构建成功。初步鉴定miR-145-5p作用ERG基因3'UTR,对ERG发挥转录后水平调控作用。

基于SSA修复机制和特异性核酸酶活性检测的双荧光报告载体系统的开发及应用

报告载体系统因构建快捷、改造简单、操作容易、经济有效,并且能通过介导筛选核酸酶阳性细胞富集基因组修饰的阳性细胞克隆,而成为特异性核酸酶活性检测的重要手段。基于非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复机制的报告系统在引入DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)后,经过优化最高也只有2/3的概率实现报告基因的修复;而单链退火(Single strand annealing,SSA)修复机制在引入DSBs后,理论上可以实现报告基因100%的修复,具有更高的灵敏度,有利于活性较低的特异性核酸酶活性的检测,为基因组修饰研究中特异性核酸酶活性的检测提供了有效的手段。本研究设计并构建了3套基于SSA修复机制的双荧光报告载体系统,并应用m RFP-e GFP系统检测了3对ZFNs的有效活性,其活性检测结果分别为8.9%、9.3%和5.0%,该研究为核酸酶活性的检测提供了有效的手段。

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763^-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763^-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。

SLC2A9基因rs13137074位点双荧光素酶报告系统的构建及其对基因活性的影响

目的构建该实验室定点突变联合双荧光素酶报告系统,并通过该系统了解rs13137074基因位点突变对葡萄糖易化转运蛋白-9(SLC2A9)基因转录活性的影响。方法采用定点突变法对rs13137074基因位点进行点突变,并通过双酶切的方式连接构建双荧光素酶报告系统质粒。随后通过细胞转染及荧光素酶检测等方法确定突变位点对SLC2A9基因转录活性的影响程度。结果rs13137074基因位点突变成功;质粒转染过程中Lipofectamine 3000终水平为1.5μL/mL,转染时间为48 h时效果最佳;rs13137074位点发生突变时可导致SLC2A9基因转录活性下降23.60%。结论人群血尿酸水平可能受SLC2A9基因调控区rs13137074位点单核苷酸多态性的影响。

TGFβR3基因3’UTR双荧光素酶报告载体的构建及其与miR-let-7a靶向关系的验证

目的:构建Ⅲ型转化生长因子β受体(TGFβR3)基因3’非编码区(3’UTR)双荧光素酶报告载体,并分析其与miR-let-7a的靶向关系。方法:根据micro RNA靶基因预测软件targetscan获取miR-let-7a与TGFβR3基因3’UTR潜在的互补结合位点;PCR扩增出TGFβR3基因3’UTR序列并克隆至pGEM-T载体,定点突变潜在互补结合位点后双酶切pGEM-T载体获取目的片段并插入至双荧光素酶报告载体获得野生型和突变型重组双荧光素酶报告载体,测序鉴定;将2种载体分别与miR-let-7a mimics或miR-let-7a NC共同转染HEK293T细胞,收集细胞后通过双荧光素酶报告系统检测各组荧光素酶活性。结果:经测序鉴定成功构建野生型和突变型重组荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告系统检测显示,共转染miR-let-7a mimics和野生型双荧光素酶报告载体的荧光素酶活性比miR-let-7a NC组明显降低(P<0.05),而共转染突变型双荧光素酶报告载体后其荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建TGFβR3基因3’UTR双荧光素酶报告载体,并证实TGFβR3基因是新发现的miR-let-7a直接靶向调控基因。

HMGA23'-UTR双荧光素酶报告载体构建及与miR-33b-5p的靶向验证

目的:构建野生型及突变型HMGA2基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,验证miR-33b-5p与HMGA2之间的靶向关系。方法:生物信息学相关软件预测miR-33b-5p与HMGA2之间的靶向关系;PCR扩增HMGA2的基因片段,构建HMGA2野生型和突变型双荧光素酶报告载体;将miR-33b-5p和阴性对照物分别与野生型GV272-HMGA2-wt-3’-UTR或突变型GV272-HMGA2-mut-3’-UTR双荧光素酶报告载体共转染293T细胞,然后检测荧光素酶的活性。结果:成功构建野生型及突变型HMGA2基因3’-非编码区(3’-UTR)的双荧光素酶报告基因载体,双荧光素酶报告系统的结果显示,加入miR-33b-5p可使野生型GV272-HMGA2-wt-3’-UTR的荧光素酶活性降低,但突变型GV272-HMGA2-mut-3’-UTR的荧光素酶活性与对照组相比则未发生显著变化。结论:野生型及突变型HMGA23’-UTR双荧光素酶报告载体构建成功;miR-33b-5p与HMGA2之间存在靶向关系。

4ARE强化的双荧光蛋白报告基因载体的构建及鉴定

目的:构建4ARE强化的红、绿双荧光蛋白报告基因载体。方法:人工合成3对ARE序列,经退火和磷酸化后插入pARE-TK-GFP载体,构建成p4ARE-TK-GFP载体。以质粒pDsRed2-N1为模板,PCR扩增红色荧光蛋白及其启动子序列与pMD18-T载体连接,构建成pMD-DsRed载体。用Ade Ⅰ酶和BspT Ⅰ酶对载体pMD-DsRed和p4ARE-TK-GFP进行双酶切,连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞后,挑取阳性克隆子进行质粒抽提酶切及测序鉴定。结果:经酶切及DNA测序证实,目的片段ARE及DsRed的序列完全正确,重组双荧光蛋白报告基因载体成功转入DH5α。结论:成功构建4ARE强化的双荧光蛋白报告基因载体并在DH5α内表达,为进一步研究ARE的调控作用奠定了基础。

人DRD1基因启动子区克隆和双荧光素酶报告基因系统的构建

背景:多巴胺受体启动子区多态性位点的改变会影响受体的表达量,进而影响多巴胺能神经递质的作用,导致相关疾病的发生。目的:通过克隆人DRD1基因的启动子区,构建含有该基因启动子序列的双荧光素酶报告基因载体并检测其活性,为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。方法:以人静脉血基因组DNA为模板,通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pG M-T载体,测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告基因质粒pG L3-Basic,构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体,采用阳离子脂质体法与内对照质粒pG L3-TK共转染HEK293细胞同时以不含启动子的pG L3-Basic载体与内对照质粒pG L3-TK共转染作为阴性对照组,化学发光仪检测相对荧光强度。结果与结论:(1)通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确;(2)与阴性对照组相比,该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性;(3)成功构建了含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告基因载体,为研究该基因的转录调控提供了基础工具。

应用双荧光报告系统检测斑马鱼microRNA的动态表达

microRNA(miRNA)是一类细胞内源表达的小分子非编码RNA,主要通过降解靶基因的mRNA或者抑制靶基因的翻译,在动植物的发育以及其他重要的生理过程中起调控作用。miRNA的功能跟它的表达位置与时间密切相关,但是目前尚缺乏一个能够在活体与个体水平稳定、持续地实时观察miRNA动态表达的方法。文章以斑马鱼为模式,建立了一个双荧光报告系统(我们称之为miRNA Tracer),用于在斑马鱼整体胚胎中追踪特定miRNA的表达谱及动态变化过程。该系统以Tol2转座子为基础,采用来自斑马鱼hsp70基因的热激启动子分别驱动eGFP和mRFP1荧光报告基因,同时在其中一个报告基因的3′-UTR区连接待测miRNA的互补序列,构成Tracer质粒。该互补序列与斑马鱼胚胎中相应的内源miRNA结合后能够使对应报告基因的荧光信号强度减弱,通过比较两个报告基因在表达谱上的差异辨别miRNA的表达区域,检测斑马鱼胚胎中miRNA起作用的位置和时间。文章选择在肌肉系统特异表达的miR-206以及在神经系统特异表达的miR-219,分别在显微注射瞬时表达和转基因稳定整合等两个层次上验证了上述Tracer系统。结果表明,所用的方法能够如实地在单细胞水平和整体水平检测到目标miRNA的时空表达动态变化。miRNA Tracer系统为在斑马鱼发育过程中对miRNA进行活体、实时的时空定位提供了一个独特而有效的方法,也为对miRNA进行功能与作用机制等更深入的研究奠定了基础。

YBX1介导拥挤应力促进肝癌干性的力学生物学机制

目的肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs)是一群具有自我更新和多向分化能力的细胞,在肝癌的发生发展中起着决定性作用。研究显示,力学载荷(基质刚度和压应力等)有利于维持肝癌干细胞的干性,然而其机制仍不完全清楚。Ybox结合蛋白1(YBX1)作为一种DNA/RNA结合蛋白,参与乳腺癌和黑色素瘤等多种类型癌症干细胞干性的调节,但有关其是否介导力学因素调控肝癌干细胞的干性尚不清楚。因此,本文旨在探讨癌细胞快速增殖导致的拥挤应力对肝癌干细胞干性的影响,明确YBX1在此过程中的作用及其调控机制。方法对肝癌细胞进行拥挤应力加载培养,并检测其干性特征的变化。同时,采用生物信息学分析、双荧光素酶报告基因、干细胞成球和小鼠移植瘤实验等检测拥挤应力对肝癌干细胞干性和致瘤性的影响及分子机制。结果拥挤应力通过诱导YBX1基因和蛋白的表达,显著促进了肝癌干细胞干性基因的表达水平,并增强了其克隆球形成能力和致瘤性。同时,拥挤应力可通过激活YAP1途径调控YBX1的基因转录,促进肝癌的干性。结论本研究揭示了拥挤应力调控肝癌干性的力学生物学机制,并为临床治疗提供了潜在靶点。

人参皂苷Rg1对H_2O_2诱导的293T细胞NF-κB转录活性影响

目的:观察人参皂苷Rg1对H2O2诱导HEK293T细胞损伤过程中NF-κB转录活性的影响,探讨人参皂苷Rg1的抗氧化机制。方法:H2O2模拟氧化应激条件,MTT法和台盼蓝染色法检测人参皂苷Rg1对细胞生长的影响;以DCFH-DA为探针流式细胞仪检测细胞内ROS水平;利用双荧光素酶顺式报告系统,检测人参皂苷Rg1对荧光素酶报告基因NF-κB-Luc相对荧光素酶值的影响,以检测人参皂苷Rg1是否具有下调H2O2诱导的NF-κB转录激活的作用。结果:H2O2诱导损伤的293T细胞存活率随H2O2浓度的增高而下降,相同H2O2浓度下,人参皂苷Rg1预保护组细胞存活率较损伤组显著提高(P<0.05);H2O2处理后细胞内自由基明显增加,其荧光强度增加了40%～50%,而给予有效浓度的人参皂苷Rg1后,荧光强度降低35%～40%;与正常对照组比较,H2O2模拟氧化应激条件下,HEK293T细胞中NF-κB荧光素酶报告活性明显升高(P<0.05),而在人参皂苷Rg1预保护组则明显受到抑制(P<0.05)。结论:人参皂苷Rg1对H2O2所致的细胞氧化应激损伤具有明显的保护作用,其可能机制是有效地清除了细胞内过多的自由基,下调了转录因子NF-κB的转录活性,继而抑制了NF-κB通路的激活。

雌二醇依赖性的细胞表达载体的研究

根据雌激素类化合物在机体内的作用机理,以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因为报告基因构建了4个启动子不同的表达载体(pERE-SV-EGFP,pERE-TA-EGFP,pERE-CMV-EGFP,pERE-TK-EGFP)。以这些表达载体瞬时转染MCF-7细胞,报告基因的基础表达与启动子的强度相关。以17β-雌二醇(E2,10-9mol·L-1)诱导表达载体瞬时转染的MCF-7细胞,发现在表达载体pERE-TA-EGFP、pERE-TK-EGFP、pERE-SV-EGFP转染的MCF-7细胞中,E2能诱导2倍以上的报告基因的表达。这表明在这些瞬时表达系统中报告基因的表达是雌激素依赖性的,因此这些表达载体可用于稳定转染以建立稳定表达分析系统。

DAX-1真核表达载体的构建及其活性的检测

目的克隆剂量敏感的性别反转-先天性肾上腺发育不良基因1(DAX-1)的cDNA,构建带HA多肽标签的DAX-1真核表达载体,并检测其在小鼠肾上腺皮质瘤细胞(Y-1)中的转录活性.方法应用RT-PCR法从人睾丸中扩增DAX-1,将测序正确的PCR产物克隆至3'端带HA多肽标签pcDNA3.1(+)真核表达载体中,以脂质体方式将该质粒或pcDNA3.1(+)-3'HA空载与类固醇激素灵敏调节蛋白(StAR)启动子荧光素酶报告基因载体共转染至Y-1细胞中,24 h后利用双荧光素酶报告系统检测DAX-1对StAR表达的影响.结果RT-PCR获取编码DAX-1基因的全序列cDNA,大小为1413bp;DNA测序和PCR方法证实DAX-1基因成功克隆到pcDNA3.1(+)-3'HA真核表达载体中;瞬时转染Y-1细胞,经报告基因检测结果显示DAX-1与StAR共转染组(实验组)的荧光素酶活性是空载组(对照组)的1/3.结论成功构建人DAX-1真核表达载体,并在Y-1细胞中初步活性分析得知所克隆的DAX-1存在转录活性,为进一步研究DAX-1功能及调控机制奠定实验基础.

两亲性胶束包覆Eu^(3+)掺杂LDHs纳米载体材料的制备与性能研究

采用两亲性胶束CSA-ss-DOCA(CsD)对Eu^(3+)掺杂层状双氢氧化物Eu-LDH(LE)进行包覆,制备得到纳米载体材料LE@CsD。利用荧光光谱、FT-IR、XRD、TG、粒度以及溶血实验和蛋白吸附等方法对样品结构、尺寸、热力学性质与生物相容性进行表征。结果表明,LE@CsD在613 nm处(λ_(ex)=306 nm)具有Eu^(3+)的特征荧光,CsD对LE的包覆并未影响样品获得荧光特性;模板药物分子五氟尿嘧啶(5Fu)被成功负载到LE@CsD上,且其层状结构未受破坏,验证了样品的载体性质;负电性胶束CsD通过静电作用与LE结合,"屏蔽"了LE层板的正电荷,使LE@CsD的蛋白吸附率仅为0.05%,溶血率低至1.16%,平均粒径控制为(230.3±2.7)nm,具备良好的生物相容性。

MEF2C基因启动子区碱基突变对转录活性的影响

目的研究MEF2C基因启动子突变对其转录活性的影响及其突变可能的致病机制。方法采用聚合酶链式反应,以对照组基因组DNA为模板,获得野生型MEF2C基因启动子区DNA片段(-939^+531bp)(1 470bp);利用分子克隆技术将目的片段连接到含有荧光素酶报告基因的pGL3-Basic载体上,构建野生型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT;利用点突变技术,构建突变型MEF2C启动子报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-M1(M1点突变类型:-293插入G突变)、pGL3-Basic-MEF2C-M2(M2点突变类型:-160插入G,C>T突变);采用琼脂糖凝胶电泳、双酶切、基因测序方法验证上述3种载体是否构建成功;利用脂质体瞬时转染技术将pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2载体分别体外转染HEK-293T细胞,标记为WT组、M1组、M2组,将pGL3-Basic空载体转染HEK-293T细胞标记为对照组、将相同条件下培养未转染载体的细胞标记为空白组,采用双荧光素酶报告基因检测系统检测各组相对荧光素酶活性(relative luciferase activity RLA),比较各组载体的转录活性。数据用SPSS18.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)处理,运用启动子区生物信息预测软件对各组启动子区序列可能的转录因子结合位点及CpG岛进行预测,并分析比较。结果成功构建了含野生型、M1型、M2型的MEF2C基因启动子区的荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic-MEF2C-WT、pGL3-Basic-MEF2C-M1、pGL3-Basic-MEF2C-M2;空白组、对照组、WT组、M1组、M2组的RLA分别为(0.83±0.35)、(2.28±0.36)、(24.17±0.50)、(29.65±2.40);M1组和M2组的RLA水平高于WT组,分别是野生型的10.6倍、13倍,差异具有统计学意义(P<0.05);转录因子结合位点预测发现正常MEF2C基因启动子片段上-356^-108bp存在13个可能的位点,M1突变导致1个新的转录因子结合位点JCV-repeated-sequence生成,M2突变导致1个新的转录因子结合位点Sp1生成;预测发现正常MEF2C基因启动子片段上存在2个CpG岛,2个突变组预测没有发现CpG岛数目的变化,但位置发生变化。结论 MEF2C基因启动子区M1突变、M2突变均能提高转录活性,这2种突变导致启动子区转录因子结合位点数目、CpG岛位置的改变,这些变化可能与新疆维吾尔族单纯性先天性心脏病的发病机制有关。

牛MYOZ1基因启动子活性分析

【目的】鉴定牛MYOZ1基因转录起始位点,确定牛MYOZ1基因核心启动子区域,为进一步研究牛MYOZ1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】以秦川牛肌肉5′RACE准备cDNA为模板,设计5′RACE扩增试验,确定牛MYOZ1基因转录起始位点。以秦川牛外周血基因组DNA为模板,通过PCR克隆获得牛MYOZ1基因转录调控区-1 628/+61目的片段。通过生物信息学分析软件预测可能包含的转录因子结合位点,设计逐段缺失引物,获得7个亚克隆,将其分别与pGL3-Basic载体连接,得到牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,通过脂质体法转染C2C12细胞系,检测7个重组质粒的荧光素酶活性,分析启动子活性。【结果】确定了牛MYOZ1基因的转录起始位点,成功克隆获得7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒:pMYOZ1-1 628/+61、pMYOZ1-1 430/+61、pMYOZ1-1 179/+61、pMYOZ1-932/+61、pMYOZ1-676/+61、pMYOZ1-437/+61和pMYOZ1-116/+61,其中重组质粒pMYOZ1-116/+61启动子活性极显著高于pGL3-Basic,推测牛MYOZ1基因-116/+61区域可能包含核心启动子;重组质粒pMYOZ1-1 628/+61启动子活性极显著高于pMYOZ1-1 430/+61片段活性(P<0.01),表明牛MYOZ1基因启动子区域-1 628/-1 430片段可能包含启动子活性增强元件。生物信息学分析发现,牛MYOZ1基因启动子-116/+61片段可能包含SP1、GC Box、CAAT等多个重要转录因子结合位点;-1 628/-1 430片段可能包含SP1、MyoD等多个重要转录因子结合位点。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛MYOZ1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且初步确定了牛MYOZ1基因的核心启动子区域位于-116/+61。