人RGS1基因克隆表达及其功能分析

目的克隆并构建人RGS1表达载体,转染U937细胞和树突细胞,进行功能分析。方法通过RT-PCR方法克隆人RGS1基因,将其连接到pcDNA 3.1/V5表达载体。然后以连接的质粒为基础通过报告基因化学发光及ELISA方法对人RGS1基因的进行初步分析。结果经扩增及序列测定表明pcDNA-RGS1质粒构建成功,在U937细胞和树突细胞中可以表达。RGS1对U937细胞转录因子NFκ-B的活性有明显的抑制作用,同时明显上调树突细胞细胞因子IL-6的表达。结论在pcDNA-RGS1质粒成功构建基础上,证明了人RGS1基因具有免疫调节功能,为进一步研究其免疫应答中的调节作用奠定了基础。

广西巴马小型猪RGS1基因克隆及内脏组织表达谱分析

为了研究广西巴马小型猪RGS1基因的生物信息学特点及其在高脂高糖饲养条件下的组织表达差异,采集其内脏组织样品,利用实时荧光定量PCR进行RGS1基因的表达差异分析,采用DNASTAR、TMHMM等软件进行基因信息学分析。结果表明RGS1基因在肝脏以及背脂中表达量显著高于其他组织,实验组肝脏以及背脂中RGS1基因的表达量显著高于对照组。RGS1基因与GenBank中野猪参考序列(XM_003357617.4)对比发现,在第414位点存在一个碱基突变。广西巴马小型猪RGS1蛋白不存在跨膜结构,存在信号肽,属亲水性蛋白;三级结构预测符合RGS1蛋白,建模成功。说明广西巴马小型猪RGS1基因可能与体内的脂肪代谢存在一定的联系,其RGS1基因编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白。本试验研究了广西巴马小型猪RGS1基因在高脂高糖条件下的变化,后续可进一步与生产数据结合,如若结果一致,可以为糖尿病的建立提供参考依据。

RGS1对RAW264.7细胞共刺激分子和细胞因子表达的调节

目的:研究RGS1基因对细胞表面分子表达以及细胞因子分泌的影响。方法:通过克隆RGS1基因、转染RAW264.7细胞、建立稳定转染的细胞系,利用流式细胞术检测,基因芯片分析初步探讨RGS1基因的功能。结果:RGS1基因能够抑制NF-κB转录因子活性;RGS1基因明显增加RAW264.7细胞表面CD86分子的表达,降低CD80表达;在不同Toll样受体配体刺激后,CD40、CD80和PD1水平低于对照组。同时,RGS1基因使IL-6、IL-15的表达明显升高,IL-10、IL-1的表达明显降低。结论:RGS1基因可调节免疫相关细胞表面分子和细胞因子的分泌,影响Toll样受体信号通路,表明RGS1可能在免疫调节方面起重要作用。

人参皂苷Rb_1,Rg_1和Re调控Raf-CREB,Akt-CREB,CaMKⅡ-CREB信号转导通路的体外研究

目的:研究人参皂苷中的主要有效单体Rb1,Rg1和Re对神经营养因子细胞信号转导通路的影响。方法:建立以0.6 mmol·L-1的皮质酮作用于SH-SY5Y细胞24 h的损伤模型,加入Rb1(120,60,20μmol·L-1),Rg1(120,80,40μmol·L-1)和Re(120,80,40μmol·L-1),CCK试剂盒检测Rb1,Rg1和Re对皮质酮诱导SH-SY5Y细胞损伤的存活率;利用脂质体转染的方法将含有CREB-Luc报告基因的质粒分别和含有hRaf,hAkt,hcAMP,hCaMK基因的质粒转染入人胚肾细胞(HEK293细胞),加入有效浓度人参皂苷Rb1,Rg1和Re后,用双荧光素酶报告基因系统和Western blotting方法检测CREB的表达情况。结果:CCK的测试结果表明人参皂苷Rb1(60μmol·L-1),Rg1(80μmol·L-1)和Re(80μmol·L-1)对SH-SY5Y细胞具有明显的保护作用;报告基因检测方法显示加入Rb1和Rg1调控后Raf-CREB,Akt-CREB通路中CREB报告基因活性明显增强,加入Re调控后Raf-CREB,CaMKⅡ-CREB通路中CREB报告基因活性明显增强。Western blotting结果显示,Rb1和Rg1调控后Raf-CREB,Akt-CREB通路中CREB蛋白表达明显增强,Re调控后Raf-CREB,CaMKⅡ-CREB通路中CREB蛋白表达明显增强。结论:人参皂苷中的主要有效单体Rb1,Rg1和Re对皮质酮所致SY5Y细胞受损具有明显保护作用,其作用机制可能与调节神经营养因子细胞信号转导通路上游的Raf-CREB,Akt-CREB,CaMKⅡ-CREB通路有关。