刚地弓形虫细胞培养的研究Ⅱ．RH株速殖子细胞培养上清对成囊株速殖子侵入细胞的影响

本文以ＲＨ株细胞培养上清（ＳＲＣ）替代ＰＬＡ２加入培养系统，对三株成囊株４次培养及与含ＰＬＡ２对照培养的观察表明，含ＳＲＣ的培养系统较常规培养检出时间提前，阳性率提高，在本文条件下与含ＰＬＡ２４０Ｕ者效果相当，提示ＳＲＣ可作为ｐＬＡ２的廉价实用的替代物用于弓形虫病的病原检测。

ME 49株弓形虫速殖子对昆明小鼠的致病性

【目的】通过ME 49株弓形虫速殖子对小鼠致病性的研究,了解该虫株速殖子的毒力特点,为深入研究弓形虫弱毒株的致病特征提供研究基础。【方法】以ME 49株弓形虫速殖子为研究对象,用血球计数板将速殖子梯度浓度稀释为<10~0,10~0-10~6个/mL,腹腔注射昆明小鼠,死亡小鼠的组织直接涂片检测肺脏及肠系膜淋巴结速殖子或大脑组织中弓形虫包囊数量,肺脏常规石蜡切片进行H.E及IHC染色,统计涂片和MAT方法的结果分析弓形虫的感染情况,并统计小鼠的感染率和生存率。【结果】0-60 DPI,死亡小鼠组织涂片显微镜检查和MAT法检测小鼠血清中弓形虫IgG抗体结果显示,<10~0、10~0、10~1及≥10~2速殖子浓度组小鼠的弓形虫感染率分别为0、20%、60%及100%。10~4速殖子浓度组小鼠有3只分别在12、16、19 DPI死亡;10~5速殖子浓度组小鼠有2只在11 DPI死亡,1只在8 DPI死亡;10~6速殖子浓度组小鼠有2只在9 DPI死亡,在7、8、10 DPI各死亡1只,感染弓形虫的小鼠生存率为62.07%(18/29)。对死亡小鼠的肺脏和肠系膜淋巴结直接涂片,显微镜镜检可见弓形虫速殖子;H.E及IHC染色,肺脏可以观察到弓形虫包囊及弓形虫抗原。对<10~0、10~0、10~1及10~2处死小鼠的大脑组织研磨镜检,结果显示<10~0和10~0感染组阳性小鼠大脑中弓形虫包囊数均为0;10~1感染组阳性小鼠大脑中弓形虫包囊数分别为60、100和0;10~2感染组阳性小鼠大脑中弓形虫包囊数量分别为20、40、40、60和0。60-600 DPI,10~3速殖子浓度组小鼠在184、435和569 DPI各有1只死亡,大脑中未检测到弓形虫包囊;10~5速殖子浓度组小鼠1只在188 DPI死亡,大脑包囊数量为20,其余小鼠存活时间为590 DPI。【结论】本研究探讨了ME 49株弓形虫速殖子对昆明小鼠的致病性,≥10~2速殖子浓度可引起小鼠100%感染,10~6速殖子浓度可引起小鼠100%死亡,小鼠死亡的时间为7-19 DPI,感染小鼠生存率为62.07%(18/29),大脑包囊成囊率为53.85%(7/13),平均包囊量为0-53个包囊/小鼠大脑,最长存活时间590 DPI。ME 49株弓形虫速殖子对小鼠致病性较弱,大脑可见弓形虫包囊,高浓度速殖子可引起小鼠死亡。

刚地弓形虫RH株对小鼠胎盘滋养细胞凋亡的影响

目的通过研究刚地弓形虫强毒株RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞凋亡的影响,初步探讨不同毒力虫株引起病理妊娠的机制。方法将小鼠胎盘滋养层细胞分别接种于不同细胞培养瓶,对照组加入DMEM培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×106/ml、4×106/ml、8×106/ml)弓形虫速殖子培养2、4、8h,Annexin-V-FITC/PI染色细胞后上流式细胞仪检测各个时间点细胞凋亡率变化;荧光显微镜观察细胞形态改变情况;Western blot分析凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达或活性。结果流式细胞仪检测弓形虫感染后的滋养层细胞凋亡率较对照组有下降趋势(P<0.05),呈量效依赖性,弓形虫数量8×106/ml实验组8h凋亡率最低,为(15.81±0.19)%;荧光显微镜观察到8h不同数量实验组滋养细胞凋亡形态改变情况,各组均有典型的早期凋亡细胞:细胞膜着绿色,细胞核拒染。随着弓形虫感染数量增加,凋亡细胞数目有所减少。Western blot检测刚地弓形虫RH株作用于滋养层细胞8h后实验组的Bax、Bcl-2蛋白表达较对照组分别有明显的降低与升高(P<0.05)。结论刚地弓形虫RH株可抵抗体外培养的孕期小鼠滋养细胞正常凋亡,其机制可能与滋养细胞Bax表达下调和Bcl-2表达上调有关。

刚地弓形虫RH株感染对小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响

目的研究刚地弓形虫RH株对体外培养的孕期小鼠胎盘滋养层细胞周期的影响及相关机制。方法制备小鼠胎盘滋养层细胞并分别接种于不同细胞培养皿,对照组加入DMEM高糖培养基孵育,实验组加入相同体积不同数量(2×104/mL、4×104/mL、8×104/mL)弓形虫速殖子培养6h、12h、24h;以MTT法检测滋养细胞增殖率;流式细胞仪检测细胞周期;Western印迹法检测细胞周期相关蛋白cyclinA、cdk2表达或活性。结果 MTT法检测结果显示刚地弓形虫RH株抑制滋养层细胞增殖,且呈时间剂量依赖性;流式细胞仪检测24h感染组细胞周期在S期产生阻滞,8×104/mL数量组S期细胞比例高达68.73%±1.76%;Western印迹方法分析感染弓形虫组滋养层细胞的cyclinA、cdk2蛋白表达量较对照组明显下降(P<0.05)。结论刚地弓形虫RH株能够抑制小鼠胎盘滋养层细胞增殖并通过调节cyclinA、cdk2等蛋白表达或活性改变引起细胞S期阻滞。

弓形虫RH株速殖子在体外形成包囊的观察

弓形虫ＲＨ株速殖子在ＨｅＬａ细胞内生长第７天出现包囊样结构，透射电子显微镜观察培养１４ｄ的包囊显示高致密度均匀一致的囊壁。

三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR与ELISA检测弓形虫的比较

目的选取弓形虫基因组中高度保守的多拷贝基因529bp重复序列、ITS-1序列和B1基因作为real-timePCR检测的靶基因,建立检测弓形虫的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR的检测方法并且与ELISA检测方法进行比较。方法将529bp重复序列、B1基因、ITS-1序列的选定扩增序列进行克隆、测序构建标准品;将构建的3个标准品放在一个体系中进行扩增,进行三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR。结果 529bp、ITS-1和B1的标准曲线的相关系数(R2)均为0.998,并且扩增效率均为96.724%,扩增片段的Tm值分别为86.5±0.5℃、78.8±0.5℃、83.1±0.5℃;构建的三重SYBRGreenⅠ实时荧光定量PCR特异性试验表明,529bp、ITS-1和B1有特异性的溶解曲线峰值分别是86.2℃、78.9℃和83.3℃,阴性对照无扩增曲线;敏感性试验表明,529bp、ITS-1和B1序列最低检出限分别为173copies/μL、123copies/μL、和135copies/μL;Tm值的批内、批间重复试验的变异系数均小于0.13%;ELISA检测猪弓形虫IgG抗体的阳性率41.72%,ELISA与荧光定量PCR检测核酸阳性符合率为53.44%(P<0.01)。结论建立弓形虫三重SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测技术具有高特异性和敏感性。

桦褐孔菌粗多糖对急性弓形虫感染雄性小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响

[目的]探讨桦褐孔菌粗多糖对弓形虫感染小鼠睾丸生精细胞凋亡的影响。[方法]用3种剂量桦褐孔菌粗多糖治疗弓形虫感染所致的睾丸生精障碍小鼠,使用流式细胞仪检测生精细胞凋亡率,并设立空白对照组、阴性对照组和阳性对照组进行对比。[结果]与阴性对照组比较,桦褐孔菌粗多糖高剂量组的睾丸生精细胞凋亡率极显著降低(P<0.01)中剂量组及阳性对照组的睾丸生精细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。[结论]桦褐孔菌粗多糖具有修复睾丸病理损伤并降低睾丸生精细胞凋亡率的作用。

弓形虫对小鼠肝脏损害的观察

目的 观察刚地弓形虫感染小鼠肝脏中弓形虫对肝脏损害的病理变化。方法 采用免疫组化 ABC法。结果 可见弓形虫从两方面对小鼠肝脏造成损害 :一方面 ,弓形虫进入血流 ,随血流进入肝脏 ,在肝组织血管及毛细血管周围的肝细胞内寄生、繁殖 ,导致肝细胞发生肿胀变性 ,细胞破裂形成坏死灶、坏死区 ,同时也导致血管壁破坏 ,肝组织内广泛出血 ,致使小鼠死亡 ;另一方面 ,经腹腔进入小鼠体内的弓形虫侵入肝脏边沿的肝细胞内寄生、繁殖形成坏死区 ,然后再向肝脏内侵入形成坏死灶 ,致使肝细胞大量坏死 ,使肝脏组织结构遭到破坏。结论 弓形虫对小鼠肝脏的损害是破坏肝细胞、肝内血管壁及毛细胞血管壁 ,造成肝脏组织结构破坏 ,功能丧失 ,肝内血管破裂 ,肝内出血 。

桦褐孔菌粗多糖对急性感染弓形虫小鼠的存活时间及SOD的影响

为探讨桦褐孔菌粗多糖(IOCP)对急性感染弓形虫小鼠的存活时间及血清、心、肝和肺中超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响。采用昆明系小鼠80只,随机分为IOCP组、阳性对照组(蒿甲醚)、空白对照组和阴性对照组,每组20只。用RH株弓形虫建立小鼠病理模型,观察小鼠治疗后的存活时间,以及血清、心、肝和肺中SOD含量。结果:IOCP及阳性药物均可延长感染弓形虫小鼠的存活时间;可明显提高小鼠脏器SOD活性;与阳性对照组比较差异显著(P<0.05)。结论:IOCP能延长感染弓形虫小鼠的存活时间,并具有抗氧化损伤作用。

桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠生殖器官及其胎鼠发育的影响

为探讨桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠生殖器官及其胎鼠发育的影响,采用弓形虫RH株感染雌性性成熟小鼠,以蒿甲醚为阳性对照组,桦褐孔菌多糖为试验组,并设立阴性组和模型组。观察孕鼠胎儿的死胎数、体重、体长等发育指标,同时记录剖检前各组孕鼠死亡数和受孕数,并对孕鼠的生殖器官进行病理组织观察。经统计分析,桦褐孔菌多糖组与模型组在孕鼠死亡率和受孕率方面差异极显著(P<0.01);在死胎率、活胎鼠平均体重、活胎鼠平均体长方面差异也极显著(P<0.01);而两药物组仅在受孕率方面显著差异(P<0.05),其孕鼠生殖器官的病理组织仅呈轻微的炎症变化。表明桦褐孔菌多糖对弓形虫感染孕鼠的胎鼠发育具有保护作用;并可明显缓解弓形虫感染对孕鼠生殖机能的损害。

基于CRISPR/Cas9技术的弓形虫rop16_(I/III)缺陷虫株的构建及毒力鉴定

目的构建并鉴定弓形虫RH株rop16_(I/III)缺陷虫株。方法利用CRISPR-Cas9技术进行构建基因缺陷虫株。运用E-CRISPR数据库设计gRNA,并使用定点突变试剂盒突变pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒上的gRNA,构建pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒。此外将rop16上游序列、乙胺嘧啶抗性基因、rop16下游序列3个片段连接成donorDNA,克隆于pUC19质粒上,PCR扩增donor DNA片段。pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和donor DNA片段电穿孔转染弓形虫,电转后悬液接种于HFF-1细胞中,3μmol/L乙胺嘧啶筛选电转后的虫株。PCR和Western blotting鉴定克隆化筛选虫株。吉姆萨染色分别比较RH株和RHΔrop16株对HFF-1细胞的增殖与入侵。并比较RH株和RHΔrop16株分别感染昆明小鼠后小鼠的生存和死亡率。结果经测序比对,成功构建了pSAG1::Cas9-U6::sgrop16质粒和pUC19-donorDNA质粒。PCR鉴定结果显示,DHFR编码(编码乙胺嘧啶抗性基因)序列成功插入至靶点位置,Western blotting分析结果未见RHΔrop16株有Rop16_(I/III)蛋白表达。吉姆萨染色后计数结果表明,RH株感染的细胞内每个纳虫泡内速殖子的平均数显著高于RHΔrop16虫株。毒力试验结果显示,RH株感染的小鼠在第7d即出现死亡,而rop16_(I/III)缺陷株在第9d出现死亡,但两种弓形虫株感染动物在第10d均全部死亡,两组间无统计学差异。结论利用CRISPR-Cas9技术成功构建了rop16_(I/III)缺陷的弓形虫RH虫株,rop16_(I/III)基因敲除对弓形虫RH株毒力无明显影响。

Chinese 1型弓形虫在终宿主家猫肠内发育的研究

目的观察研究TgCatCHn4(Chinese 1)株弓形虫在猫回肠上皮细胞发育过程中的虫体形态特点,对小鼠RH株弓形虫急性感染期的病理变化和虫体分布进行探讨。方法复制弓形虫感染的终末宿主和中间宿主模型,采用石蜡切片H&E染色和IHC染色方法。结果家猫摄入弓形虫包囊后,可成功排泄弓形虫卵囊(3DPI^10DPI)。回肠病理变化主要表现为吸收细胞脱落和固有层淋巴细胞的坏死,可观察到弓形虫在回肠上皮裂殖生殖和配子生殖各阶段虫体的形态。RH株弓形虫感染的小鼠病理损伤主要表现为肝脏、脾脏和淋巴结的局灶性坏死,坏死灶分布多量速殖子,虫体多以花瓣状、簇状分布。结论详细探讨了弓形虫感染猫和小鼠后的虫体形态学和对机体的病理损伤特点,为弓形虫在终末宿主和中间宿主的病理诊断和入侵机制研究提供参考依据。

弓形虫主要表面抗原1核酸疫苗与蛋白疫苗联合免疫保护作用的研究

目的研究刚地弓形虫RH株主要表面抗原1(P30)DNA疫苗诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法根据弓形虫P30基因的DNA序列设计一对引物,,将PCR扩增到的P30基因克隆到真核表达载体pcDNA.3.1中。大量制备pcDNA3.1-P30和pcDNA3.1质粒DNA。将48只BALB/c小鼠随机分成4组,每组12只,空质粒对照组(A组)第0、2、4周经小鼠股四头肌注射100μgpcDNA3.1质粒DNA;重组P30抗原免疫组(B组)第0、2、4周每鼠经背部皮下多点注射50μgrP30+福氏完全佐剂;P30DNA疫苗免疫组(C组)第0、2、4周经小鼠股四头肌注射100μgpcD-NA3.1-P30质粒DNA;P30DNA疫苗和重组P30抗原联合免疫组(D组)第0、2周经小鼠股四头肌注射100μgpcDNA3.1-P30质粒DNA,第4周每鼠经背部皮下多点注射50μgrP30+福氏完全佐剂。末次免疫4周后每鼠用100个弓形虫速殖子经腹腔感染,观察小鼠存活时间。结果成功构建刚地弓形虫RH株P30DNA疫苗,动物保护性实验表明,虽然与对照组相比实验组小鼠的存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论pcDNA3.1-P30DNA疫苗具有弓形虫病候选DNA疫苗分子的潜力。

弓形虫三磷酸核苷水解酶-II的克隆、表达及初步应用

目的探讨弓形虫RH株速殖子NTPase-II重组蛋白的免疫反应性及其在抗体检测中的应用。方法通过PCR获得NTPase-II基因,克隆入pGEM-T Easy载体,经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB,构建原核表达重组质粒,在大肠杆菌中以包涵体形式获得高效表达。SDS-PAGE和Western-blot分析蛋白表达产物。用纯化的表达产物作为诊断抗原,通过对反应条件的优化,初步建立检测抗NTPase-II抗体的间接ELISA方法。结果PCR扩增得到特异的弓形虫NT-Pase-II基因序列,经测序鉴定无基因突变。重组质粒诱导表达产物相对分子量约70kD,与理论值相符。经Western-blot证实,重组蛋白可刺激机体产生相应的抗体。具有良好的抗原性和免疫原性。用表达的重组NTPase-II蛋白初步建立了用于NTPase-II抗体检测的间接ELISA方法。结论重组NTPase-II蛋白具有较强免疫原性,可作为诊断抗原用于急性弓形虫感染诊断试剂的研发。

刚地弓形虫RH株感染对BALB/c小鼠情绪行为的影响

目的研究刚地弓形虫RH株感染对BALB／c小鼠学习记忆行为的影响及可能机制。方法将72只周龄、大小相近的雄性BALB／c小鼠采用随机数字表分为生理盐水对照组与不同数量（3×10^3／ml、3×10^4／ml、3×10^5／m1）弓形虫RH株感染组，每组18只。于感染第5周从每组各随机抽取6只分别进行高架十字迷宫实验、旷场实验及强迫游泳实验，观察各组小鼠在实验中情绪行为变化。并记录各项指标进行统计分析。结果在高架迷宫试验与旷场实验中，3×10^3／ml弓形虫感染组小鼠与生理盐水对照组小鼠比较，各项行为学指标无明显差异。在3×10^4／ml、3×10^5／ml弓形虫感染组小鼠与对照组小鼠比较出现明显降低（P〈0．05）．以3×10^5／ml感染组最为明显，其小鼠运动活力（0E＋cE）、进入开放臂次数比例（OE％）、开放臂停留时间比例（OT％）小鼠爬行总格数、中央格在总格数中比例分别为11．08±2．12、28．73±0．59％、25．62±2．33％、32．30±17．26、2．42±0．65％。在强迫游泳试验中，各弓形虫感染组小鼠游泳的静止时间均高于对照组小鼠（P〈0．05），3×10^5／ml感染组静止时间最长，达226．6±1．9S。结论刚地弓形虫RH株感染可引起小鼠情绪行为改变，具有焦虑抑郁倾向。

经口及皮下注射硝唑尼特对弓形虫急性感染小鼠治疗效果评价

目的探究经口给药及皮下注射硝唑尼特对弓形虫急性感染小鼠的治疗效果。方法用弓形虫RH株建立小鼠急性感染模型,分别采用经口给药及皮下注射两种途径治疗。经口给药治疗组按100 mg/kg体重剂量给药;皮下注射分3组,按100、50、25 mg/kg体重剂量给药。记录两种给药途径下小鼠存活时间,比较肝脏和肺脏荷虫量、细胞因子水平变化及肝脏病理变化。结果两种给药途径硝唑尼特治疗小鼠存活时间均未显著延长(均P>0.05)。经口给药与100、50 mg/kg剂量皮下注射给药小鼠肝脏、肺脏荷虫量显著减少(均P<0.05),与未给药组相比肝脏荷虫量分别减少93.53%、92.59%、40.63%,肺脏荷虫量分别减少97.73%、95.71%、63.53%。硝唑尼特治疗小鼠IFN-γ水平显著升高(P<0.05),与未给药组相比升高169.81%、348.24%、416.44%、472.24%。经口给药与100、50 mg/kg剂量皮下注射给药小鼠IL-12水平显著降低(均P<0.05),与未给药组相比分别降低83.55%、61.62%、56.36%。经口给药和皮下注射100 mg/kg剂量给药均可使小鼠肝脏炎性细胞浸润减轻。结论硝唑尼特皮下注射给药对小鼠急性弓形虫感染有一定治疗效果,为皮下注射硝唑尼特治疗弓形虫感染提供了理论依据。

应用免疫蛋白质组学方法鉴定弓形虫病诊断抗原分子的研究

目的鉴定对弓形虫感染具有潜在诊断价值的弓形虫抗原分子。方法制备刚地弓形虫RH株速殖子全虫可溶性蛋白及弓形虫感染小鼠腹腔蛋白,经SDS-PAGE分离后采用半干电转移方法将其转移到硝酸纤维素膜上,再分别与22份弓形虫感染者血清进行Western blot,以22份健康人血清和其他寄生虫病患者血清作为对照,筛选能被弓形虫感染者血清特异性识别的蛋白组分;两种蛋白样本经二维电泳分离后采用Western blot筛选能被弓形虫感染者混合血清识别,但不能被健康人血清及其他寄生虫病患者血清识别的特异性斑点。切取SDS-PAGE胶上相应的特异性蛋白质斑点进行MALDI-TOF分析,鉴定蛋白斑点的基因。结果一维电泳及Western blot结果显示,弓形虫感染小鼠腹腔蛋白中的90、37、30、28和18ku组分分别可被部分弓形虫感染者血清识别,其中为28ku蛋白能被22份弓形虫感染病人血清中的15份所识别;速殖子全虫可溶性虫体蛋白中的90、70、67、56、48、39、37、30、28和18ku组分可被部分弓形虫感染者血清识别,其中28ku蛋白可被22份弓形虫感染者血清中的21份识别,22份健康人血清中有2份与28ku蛋白呈弱阳性反应,与其他寄生虫病患者血清无交叉反应。二维电泳Western blot阳性斑点的飞行质谱分析显示,弓形虫感染小鼠腹腔蛋白中的28ku组分为磷酸丙糖异构酶,弓形虫速殖子全虫可溶性蛋白中的28ku组分为GRA2和GRA7。结论弓形虫抗原与宿主抗体反应具有高度异质性,GRA2、GRA7及磷酸丙糖异构酶等分子的弓形虫感染者血清识别率高,此三种蛋白可作为建立具有高敏感性的弓形虫病特异性免疫诊断方法的抗原分子。

孕期弓形虫感染对小鼠胎盘补体调节蛋白表达水平的影响

目的通过检测弓形虫感染对C57BL／6孕鼠胎盘补体调节蛋白的表达水平，探索孕期弓形虫感染致不良妊娠结局的分子免疫机制。方法将C57BL／6孕鼠随机分为感染组和正常对照组，每组12只，感染组每只孕鼠于孕8d腹腔注射200个弓形虫强毒株（RH株）速殖子，对照组于相应时间注射等量生理盐水。所有孕鼠均于孕14d无菌分离胚胎组织，观察胎鼠发育情况。采用实时荧光定量PCR检测胎盘补体调节蛋白Crry、GPI-DAF及CD59a的mRNA的表达水平；采用流式细胞术检测胎盘单细胞悬液中Crry、GPI．DAF阳性细胞率。结果弓形虫感染导致感染组死胎率显著升高（感染组死胎率为80．95％，对照组为4．41％），两组之间差异有统计学意义（P〈0．01）；弓形虫感染组及对照组Crry、GPI-DAF和CD59a的mRNA表达水平分别为0．786±0．199、0．594±0．096、0．880±0．179和0．550±0．077、0．221±0．074、0．591±0．075，3类补体调节蛋白感染组与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）；感染组和对照组Crry、GPI-DAF的阳性细胞百分率分别为（10．03±2．11）％、（2．95±1．04l％和（3．15±1．32）％、（0．66±0．26）％，两类补体调节蛋白感染组与对照组比较差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论弓形虫感染导致孕鼠胎盘3种补体调节蛋白Crry、GPI—DAF及CD59a表达水平均升高，打破了母胎界面维持正常妊娠所需的免疫微环境，这可能是孕期弓形虫感染致不良妊娠结局的分子免疫棚制之一．

刚地弓形虫感染对小鼠外周血和脾淋巴细胞Crry和CD55表达的影响

目的探讨刚地弓形虫急性感染对小鼠外周血细胞和脾淋巴细胞表面补体调节蛋白Crry和CD55表达的影响。方法将30只雄性C57BL／6小鼠按完全随机分组法分为感染组（20只）和对照组（10只）。感染组小鼠每只腹腔注射1．0×10^4个RH株刚地弓形虫速殖子，对照组注射等量生理盐水。感染组依次于感染后2d和5d采集标本，同时对对照组取材。采用流式细胞仪检测小鼠外周血红细胞、白细胞及脾淋巴细胞Crry与CD55的表达情况。结果①感染后2d小鼠外周血红细胞Crry和CD55阳性表达率依次为（96．17±2．86）％和（65．23±4．99）％，对照组依次为（98．24±0．83）％和（68．57±5．31）％，组间差异均无有统计学意义；感染后5d，其红细胞Crry和CD55阳性率依次为（81．77±4．51）％、（51．72±8．29）％，对照组依次为（97．94±0．95）％、（70．57±6．44）％，感染组较对照组降低（t=7．786，t=4．433，P〈0．01）。②感染后2d，白细胞Crry和CD55阳性率依次为（96．74±3．76）％、（71．80±6．74）％，对照组依次为（97．25±1．16）％、（74．84±3．87）％，两组比较均无有统计学意义的差异；感染后5d，其阳性率依次为（93．46±4．38）％、（59．67±6．37）％，对照组依次为（97．47±1．56）ok、（75．10±4．58）％，感染组比对照组降低（t=2．585，t=4．792，P〈0．05，P〈0．01）。③感染后2d，脾淋巴细胞Crry和CD55阳性率依次为（97．74±1．55）％和（66．58±2．67）％，对照组依次为（98．20±1．19）％和（69．98±4．62）％，两组比较均无有统计学意义的差异；感染5d后，其阳性率依次为（94．71±3．59）％、（56．86±6．98）％，对照组依次为（98．24±1．63）％、（71．18±4．09）％，其中，感染组CD55阳性率较对照组降低（t=4．195，P〈0．01），而Crry阳性率较对照组无有统计学意义的差异。结论小鼠感染刚地弓形虫RH株后，不会立刻影响外周血和脾淋巴细胞补体调节蛋白Crry、CD55表达水平；随着病情发展，刚地弓形虫感染可导致机体免疫细胞补体调节蛋白的表达水平降低，但对不同免疫细胞各补体调节蛋白影响程度并不相同。

弓形虫MIC10基因敲除株的构建及鉴定

为了解弓形虫MIC10基因特性,利用CRISPR/Cas9技术构建了弓形虫MIC10基因敲除虫株,通过乙胺嘧啶药物筛选、GFP绿色荧光观察及96孔板筛选阳性敲除虫株,并进行体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因进一步确定单克隆敲除虫株。结果表明,加入乙胺嘧啶后MIC10基因敲除株能够正常生长,在荧光显微镜下观察敲除株呈现绿色荧光,在96孔板的单孔中筛选出唯一绿色荧光虫体;经体外和小鼠体内PCR鉴定MIC10基因,敲除虫株扩增出1 000 bp的外源片段,未扩增出MIC10基因片段,而在对照组RH虫株扩增出263 bp MIC10基因片段,未扩增出1 000 bp外源片段;说明本试验成功构建并筛选出MIC10基因敲除的单克隆虫株,暂命名为弓形虫KO-MIC10-RH。本试验为弓形虫MIC10基因敲除株的致病性研究奠定基础。