中国北方汉族和南方黎族RHCE基因分型

目的建立应用PCR技术进行RHCE基因分型的方法。方法应用序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)检测200例中国北方汉族、南方黎族个体的RHCE基因型,同时对5例亲子鉴定样品进行检测。结果2个民族个体RHCE基因分型结果与血清学分型结果完全一致;其中中国北方汉族RH基因型频率分布为RHCCEE1例,RHCCEe3例,RHCCee88例,RHCcEE4例,RHCcEe20例,RHCcee54例,RHccEE1例,RHccEe22例,RHccee7例;中国南方黎族RH基因型频率分布为RHCCEE2例,RHCCEe2例,RHCCee106例,RHCcEE7例,RHCcEe62例,RHCcee10例,RHccEE3例,RHccEe8例。亲子鉴定样品RHCE基因型检测结果与13个STR位点联合鉴定结论一致。结论PCR-SSP技术能准确判断中国北方汉族和南方黎族个体的RHCE基因型。

RHCE基因和RhCcEe抗原研究进展

RHCE基因编码RhCcEe抗原,与RHD基因一样,RHCE基因也存在许多基因变异体并形成许多RhCcEe抗原变异体,这些变异体可导致血清学抗原鉴定或基因分型出现一些假阳性或假阴。

RHCE基因编码区全长测序方法的建立

目的建立简易的RHCE基因编码区全长测序方法。方法依据RHCE基因序列的特异性,设计10对特异性引物分别扩增RHCE基因的10个外显子,同时再设计10条测序引物用于测序。将该方法用于检测3例Rh阳性标本、1例Rh阴性标本、1例D--表型标本及1例弱E表型标本。结果 10对特异性引物在统一的PCR条件下成功扩增出RHCE基因的10个外显子,3例Rh阳性标本及1例Rh阴性标本的测序序列与RHCE基因标准序列一致;D--标本PCR扩增和测序结果显示缺失第3、4和第5外显子,提示该个体携带一种新的由RHCE/RHD基因交换形成的等位基因RHCE-D(3-5)-CE;弱E标本测序结果发现在第5外显子存在一处碱基突变(762G>C),其他外显子测序结果未发现变异。结论 RHCE基因编码区全长测序方法可用于一般实验室进行RHCE基因测序。

中国江苏地区汉族RhD阴性个体RHCE基因型多样性研究

本研究探究中国江苏地区血清学RhD阴性献血者中,含有RHD基因的献血者和不含RHD基因献血者中的RHCE基因型。采用聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法分析337例血清学RhD阴性无偿献血者的RHCE基因型;同时采用PCR-SSP扩增这些献血者RHD基因特异性位点。结果表明:337例血清学RhD阴性,其中RHD基因阳性献血者RHCE*C/C 20例,RHCE*C/c 62例,RHCE*c/c 24例,RHCE*C及RHCE*c基因频率分别为0.4811和0.5189;RHCE*E/E 0例,RHCE*E/e 25例,RHCE*e/e 81例,RHCE*E及RHCE*e基因频率分别为0.1179和0.8821。231例RHD基因阴性献血者中RHCE*C/C 3例,RHCE*C/c 34例,RHCE*c/c 194例,RHCE*C及RHCE*c基因频率分别为0.0866,0.9134;RHCE*E/E 0例;RHCE*E/e 15例;RHCE*e/e 216例;RHCE*E及RHCE*e基因频率分别为0.0325,0.9675。结论:在中国江苏地区RHD基因阴性人群中,RHCE基因主要以RHCE*ccee为主。中国江苏地区血清学RhD阴性的献血者中,RHCE基因型在含有RHD基因组和不含RHD基因组存在统计学差异。

中国新疆维吾尔族Rh血型系统RHCE基因分型的研究

本研究目的旨在探讨新疆维吾尔族RHCE基因分型特点。根据文献设计RHCE基因检测的引物,采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)检测非血缘关系RhD阴性样本维吾尔族89例、汉族233例及RhD阳性样本汉族109例。结果表明,维吾尔族及汉族无论RhD阴性或RhD阳性全部样本中RHE/e基因分型结果与血清学检测结果一致;89例维吾尔族RhD阴性样本RHC/c等位基因分型结果与其血清学检测结果一致,而233例汉族RhD阴性及109例汉族RhD阳性样本中RHC/c基因错误定型率为5.05%。结论:本研究方法适合用于维吾尔族RHE/e基因分型,在本研究中用于维吾尔族RHC/c基因分型中未发现有错误,但今后仍需进一步验证。

RHCE基因结构研究

目的研究中国人RHCE基因结构特征。方法根据文献设计RHCE基因检测的引物,采用PCR-SSP法检测RhD阳性100例,RhD阴性300例的RHCE基因结构。结果RHE/e和RHC/c等位基因定型结果表明,RHE/e和RHc的定型结果与血清学的一致,没有发现假阳性和假阴性。利用RHCE基因外显子1的nt48的C→G多态性检测RHC等位基因将产生6.06%的假阳性,未发现假阴性。利用109bp插入序列这一多态性来检测RHC等位基因,总的假阴性率为4.00%,没有发现假阳性。结论RHE/e和Rhc基因定型可获得准确结果,对RHC等位基因的定型必须使用2种方法或利用至少2个以上的多态性位点。

中国南方汉族和西藏藏族RHCE基因109bp插入序列和733C>G多态性研究

目的研究中国南方汉族人群和西藏藏族人群RHCE基因内含子2中109bp插入序列缺失情况和外显子5中733C>G多态性,并比较2民族间有无差异。方法收集186例中国南方汉族人样本和50例西藏藏族人样本,应用PCR-SSP方法对内含子2的109bp插入序列和外显子5的733C>G多态性进行检测,并用测序方法验证。结果在中国南方汉族人群中携带RhC抗原个体其RHCE基因内含子2中109bp插入序列的缺失率为1.08%,在西藏藏族人群中缺失概率为0,二者缺失率相比无统计学差异(χ2=0.02,P>0.05)。2民族所有样本RHCE基因外显子5的733位核甘酸均为G,未发现该位点存在733C>G多态性。结论 2民族在内含子2的109bp插入序列缺失和外显子5的733C>G多态性方面未发现二者有差异。在南方汉族人群中针对RHCE基因内含子2的109bp插入序列来检测RHCc基因会因缺失而导致假阴性错误。

1条突变型RHCE*ce新等位基因的发现

目的采用新型Rh血型系统的多重连接依赖式探针扩增(MLPA)检测试剂盒,对广州地区收集的200例RhD阴性献血者进行RHCE基因分型。方法收集RhD阴性献血者200例,从静脉血提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒进行RHCE基因分型和拷贝数定量分析。对MLPA显示的RHCE拷贝数异常的样本,进行RHCE基因外显子1至10测序分析。对发现的杂合突变进行克隆测序。结果在200例RhD阴性献血者中,MLPA基因分型结果显示有6例标本RHCE等位基因定量拷贝数下降,测序发现RHCE基因外显子2的一个新杂合突变(c.308C>T,p.103Pro>Leu),克隆测序证实了该突变。结论在中国人群中,首次发现了一条新的突变型RHCE*ce(308C>T)等位基因,该等位基因在广州地区RhD阴性献血者中频率为6/400。

RHCE~* ce(308C>T)突变型等位基因Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立Rh血型系统RHCE＊ ce（308C〉T）突变型等位基因的Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法,筛查携带该等位基因的个体,并对其Rh CE血型抗原进行鉴定分析。方法针对RHCE基因c. 308C〉T突变位点设计特异性引物及Taqman-MGB探针,采用已知携带该突变位点的标本作为阳性对照,建立实时荧光定量PCR方法。应用该方法对800例RhD阴性标本、1 000例RhD阳性标本以及400例D放散型标本进行突变筛查,同时随机抽取200例标本进行RHCE基因外显子2直接测序。对筛查出携带该突变型等位基因的标本进行RHCE基因外显子2测序确证,同时应用多重连接依赖式探针扩增（MLPA）基因检测结合测序方法对其进行Rh血型基因型鉴定,并进行Rh血型血清学检测。此外,采用6种针对不同抗原表位的单克隆抗体对Rhc抗原的表达进行血清学鉴定,并采用4种抗-c进行Rhc抗原的流式细胞检测。结果成功建立RHCE＊ ce（308C〉T）等位基因的Taqman探针实时荧光定量PCR方法。应用该方法从800例RhD阴性标本中筛查出2例携带该突变型等位基因标本,RHCE基因外显子2测序结果证实存在杂合点突变（c. 308C〉T,p. 103Pro〉Leu）,但在RhD阳性及D放散型标本中未检出此突变。此2例标本的Rh抗原表型均为CCdee,基因型均为Cde/c^vde[c^v表示RHCE＊ ce（308C〉T）突变型等位基因]。该2例标本的Rhc抗原血清学和流式细胞检测均为阴性,而Rh C抗原表达正常。结论 Taqman探针实时定量PCR方法进行RHCE＊ ce（308C〉T）等位基因检测快速准确,该等位基因可导致c抗原不表达。

北京地区RhD阴性献血者RHD基因分型及RhCE表型分布研究

目的探讨北京地区RhD阴性献血者的RHD基因分型及RhCE表型分布。方法收集2018年3月至2019年6月北京市红十字血液中心确认为RhD阴性的血样100份,应用Rh分型卡鉴定RhCE表型,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测RHD基因,对含有RHD基因的样本进行DNA测序分析。结果100例RhD阴性的献血者中,检出78例RHD基因全缺失型,ccee表型占84.6%(66/78);16例携带RHD1227A基因,均含有C抗原;4例携带RHD-CE(2-9)-D基因,RhCE表型均为Ccee;1例为28T基因,RhCE表型为Ccee;1例携带711delC基因,RhCE表型为CcEe。基因检测为RHD1227A基因的RhD阴性个体均有C抗原,RHD1227A与C抗原的表达显著相关(P<0.001)。结论北京地区RhD阴性献血者的RHD基因呈现多态性,主要为RHD基因全缺失型,RhCE表型主要为ccee。

一例RhD--缺失型患者的血清学及分子生物学分析

目的研究RhD--缺失型患者的血型血清学及分子生物学,指导临床用血安全。方法采用患者EDTA-K 2抗凝血,进行Rh血型系统常见抗原的检测及其相关血清学检测,同时提取患者DNA,利用SBT法对其RHCE基因和RHAG基因的外显子1-10进行测序。结果患者血清学检测为O型RhD--,抗体鉴定10谱全阳性,RHCE基因测序表现为RHCE*02/RHCE*02,RHAG基因测序表现为6号外显子的808号位点G>A和861号位点G>A的突变。结论当患者Rh血清学表现型缺失,在妊娠和或输血史等相关免疫情况下,可采取自体输血或血浆置换等方式满足患者的急救用血。

中国人群中发现的主要弱D型——弱D15个体的分子背景研究

为了探讨中国汉族人群弱D15型个体的Rh血型系统血型血清学表型及分子背景,采用常规血型血清学技术检测RhD抗原弱阳性个体RhD、C、c、E、e抗原表型;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)方法同时检测RHD基因和RHCE基因;标本测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定RHD合子型或RHD基因数目。结果表明,血型血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的人群中,有18例为弱D15型(占D抗原弱阳性表型56%),RHD基因全长编码区序列分析发现其第6外显子有一处碱基突变:845G>A,编码区序列其它部分与正常RHD序列相同;检测Rh小因子有3种表型CcEe(2例)、CcEe(2例)、ccEe(14例),分别占弱D15型的11%、11%、78%,血清学检测结果与分子生物学检测结果一致。RHD杂合性试验鉴定显示仅表型为CcEe的2例标本为纯合型RHD+/RHD+,提示基因型为DCe/DcE;其余为杂合型RHD+/RHD-,提示基因型分别是DCe/dce和DcE/dce。结论:弱D15型是中国人群中最主要的弱D型,其中大部分为杂合型。

华北地区汉族人群Rh(D)抗原弱表现型个体的分子遗传机制研究

目的探讨汉族人群非血缘关系Rh(D)抗原弱阳性个体的血清学表型及分子遗传机制。方法采用常规血清学技术从非血缘关系随机献血者中筛检Rh(D)抗原弱阳性个体(包括弱D型、部分D型),对其进行Rh D、C、c、E、e抗原表型的检测;采用序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)方法同时检测其RHD基因和RHCE基因;测序分析RHD基因全长编码区序列;同时通过特异性PCR技术测定其RHD合子型。结果血清学试验证实为D抗原弱阳性表型的有32例个体,占无关供者人群比率为0.015%,其中18例个体为弱D15型(845G>A),1例为弱D12型(830G>A),1例为携带DEL等位基因(1227G>A)的弱D型,8例为部分D表型中的DⅥⅢ型(RHD-CE(3-6)-D),1例为部分D表型中的DⅤa(Hus)(RHD-CE(5)-D),3例标本10个外显子检测均未见异常。Rh小因子检测有3种表型CcEe(4例)、Ccee(10例)、ccEe(18例),其血清学与分子生物学检测一致。RHD杂合性试验鉴定显示仅4例标本为纯合型RHD+/RHD+,其余为杂合型RHD+/RHD-。结论汉族人群D抗原弱阳性比率明显少于高加索人,汉族人群D弱表现型中,弱D15型频率最高;部分D的弱表现型中,DⅥⅢ型占主要比例。

基因分型技术对1例PNH患者抗-C同种抗体合并抗-f类同种自身抗体的辅助鉴定

目的:通过基因分型对1例有输血史的PNH患者疑难抗体进行鉴定。方法:采用卡式凝胶法检测患者RH分型,谱细胞鉴定PNH患者抗体特异性。在血清学鉴定困难的情况下,利用基因分型的方法排除RH无关表型,利用不同的RH表型细胞分别吸收放散后进行抗体鉴定,不同的RH表型细胞组合排除其它无关抗体。结果:卡式凝胶法鉴定显示RH分型C抗原存在双群,其它抗原阳性,分别进行RHD合子型鉴定、RHD和RHCE基因测序分析。结果显示,RHD基因型为纯合子RHD/RHD,RHCE基因未发现c.122A>G突变,排除携带有Cw抗原;RHCE第1外显子48G,第5外显子存在676碱基G/C杂合,第2-4、6-10外显子没有发生突变,第4内含子发现一个新的突变IVS4+29A>C。因此可以判断出RH血型基因型为Dce/DcE,其表型应该为ccDEe。结合不同的RH表型细胞吸收放散实验最终确定患者血清中含有抗-C同种抗体合并罕见的抗-f类同种自身抗体,最后选择配血相合的AB型ccDEE的红细胞输注给患者,未出现输血不良反应。结论:基因分型可以辅助用于患者血清中疑难抗体的鉴定,从而减少患者输血风险。

洛阳献血者Rh抗原和基因多态性研究

目的通过观察随机选择的献血者人群Rh表型频率，从表型推测RHCE基因频率，从而估测Rh单倍型频率。分析RH基因的遗传学特征和抗原多态性，为Rh血型在中国临床输血医学和产科学的应用提供理论依据。方法统计2005年1月～2011年12月356071例捐献全血的献血者中的RHD阴性数据，随机选择10373例RHD阳性献血者检测RhCE血清学表型。利用哈德～伯格遗传平衡定律检测吻合度，用方根法计算Rh基因频率和单倍型频率，妒检验分析不同分类的差异。结果Rh血型基因和单倍型频率为D：0．9329、d：0．0671、DCe：0．6153、DeE：0．2704，Dce：0．0341、DCE：0．0132、dCe：0．0123、dCE：0．0006、dcE：0．0024、dee：0．0518，与中国汉族人在基因平衡条件下的差异无统计学意义（x^2=13．16，P〉0．05）。RHCE基因和单倍型频率在不同RhD表达类型中的分布差异有统计学意义（P〈0．05）。结论本研究准确估计了RH等位基因频率，证实了估测的单倍型频率的可靠性，血清学检测中携带RhC和／或RhE抗原的表型与不同表达的RhD类型有关。该结果可以代表中国汉族人的Rh抗原和基因多态性特点。需要制定标准的弱D定型方法和合理的输血策略，以避免抗球蛋白试验对弱D抗原的漏检。

PCR-SSP RHD基因定型方法的初步应用

目的采用序列特异性引物PC R技术(PC R-SSP)进行R H D基因定型。方法采用新近报道的PC R-SSP R H D定型方法检测10例R hD阳性个体,包括2例哈萨克族人、2例蒙古族人、2例藏族人和4例维吾尔族人,以及11例R hD阴性个体(汉族10例、维吾尔族人1例),并通过测序和内含子检测分析1例汉族个体的R H D基因型。结果全部样品的PC R-SSP检测结果与血清学表型相符,1例汉族R hD阴性个体鉴定为D放散型,携带R H D1227A等位基因,1例个体的检测结果提示携带融合R H D基因。测序分析显示该融合基因的第1、2和第10外显子序列与正常R H D基因相应外显子相同,而缺失其余外显子,由于R H D基因和R H C E(e)基因的第2外显子序列相同,笔者采用PC R方法检测R H D基因第2内含子,结果为阴性,说明该个体携带的融合基因为R H D-C E(2-9)-D2等位基因。结论PC R-SSP可用于中国人R h血型D抗原基因定型。

基于氨基酸特征序列对人类Rh血型系统的蛋白质结构分析

利用代数学中同态思想和物理中的"粗粒化"思想,以及HP模型,根据a,t,c,g的化学结构分类,提出了DNA序列的特征序列概念(σ-,τ-,σ∩τ-)并推广到蛋白质序列中,从而给出一种数值刻划,将蛋白质序列简化成一个(0,1)序列[6],基于上述给出特征序列的方法,根据氨基酸分子量与简并度的关系,提出了另外一种DNA序列的特征序列概念(-)并推广到蛋白质序列中,进而给出了另外一种数值刻划,将蛋白质序列简化成一个(0,1,2)序列,通过比较RHD基因和RHCE基因的特征序列的数值刻划图,得出RHD基因和RHCE基因均偏爱使用低分子量且高简并度的氨基酸。

D—变异体的分析——附1例报告

目的分析1例D—变异体的分子背景。方法分别采用血清学方法和序列特异性引物PCR(PCR-SSP)方法检测标本RhD、C、c、E、e抗原和RHCE基因,同时序列分析RHAG、RHCE基因全长编码区序列,最后进行RHD合子型分析和家系分析。结果先证者血清学测定Rh表型为D—,PCR-SSP结果为DC-;RHAG第1-10外显子测序显示,编码区与Gen Bank NC-000006标准序列一致,未观察到形成Oldeide和Duclos-Like抗原的碱基变异,亦未见形成高频抗原Duclos(RHAG1)的RHAG316C>G突变,所有序列均未见杂合峰;RHCE基因第1-10外显子扩增显示,缺失第3-5外显子,其余外显子序列与标准序列一致,分析第1、2外显子序列为RHC,提示该等位基因为RHCE(e)-D(3-5)-CE(e);家系分析其父母、弟弟的RHAG序列与先证者完全一致,父母Rh血清学表型分别为DCCee和Dcc EE,其父亲的PCR-SSP和测序结果一致,其母亲PCR-SSP结果 DCc EE与测序结果一致,而与血清学结果不符(Dcc EE),其弟血清学表型、PCR-SSP和测序结果,均与先证者一致,结合RHD合子型分析结果,该家系父母分别为DCe/DC-和Dc E/DC-基因型,先证者和弟弟为DC-/DC-。结论 RHCE-D(3-5)-CE等位基因形成D—表型并稳定遗传。

RhD阴性献血者的遗传背景研究

目的通过检测RhD阴性献血者RHD和RHCE基因,分析RhD阴性献血者的遗传背景。方法对2021年3月~2022年5月雅安市中心血站经RhD初筛及确证试验为RhD阴性的无偿献血者标本,首先鉴定RHD等位基因是否完全缺失,随后检测非RHD等位基因完全缺失型标本10个外显子是否存在缺失,最后对无RHD等位基因及外显子缺失的剩余标本进一步进行DNA测序分析;采用SSP-PCR法检测RHCE基因。结果104份RhD阴性标本的RHD基因检测结果中,完全缺失65份(d/d),RHD基因部分缺失(1条等位基因缺失)33份,RHD基因无缺失6份;对上述33份RHD基因部分缺失标本的RHD等位基因进行10个外显子检测发现13份部分外显子缺失,其基因型均为RHD~*D-CE(3-9)-D/d,表型为RhD阴性,余20份未见外显子缺失;其余无缺失标本的外显子测序结果显示,6份标本的基因型为RHD~*1227A/RHD~*1227A型,19份标本的基因型为RHD~*1227A/d型,1份标本的基因型为RHD~*3A/d型,以上2种突变类型均被ISBT视为D。RHCE基因检测结果中发现,cc基因型献血者全是RhD真阴性,D型献血者中未见cc基因型。结论通过RhD阴性献血者的遗传背景研究,发现其中存在较高比例的RhD抗原弱表达的D型,该血型是否影响临床血液安全尚需进一步研究。

RhCE血型基因分型与血清学分型的比较研究

目的对中国汉族、新疆维吾尔族和哈萨克族人的RHCE基因进行定型，并与血清学分型结果进行了比较。方法使用PCR-序列特异性引物技术对98例随机非血缘关系汉族RhD阳性样本和RhD和RHD均为阴性汉族人样本230例，新疆维吾尔族人样本72例、哈萨克族人样本18例进行RHCE基因定型。结果RhD阳性和RhD阴性样本中RHE／RHe等位基因定型结果都与其血清学结果相符；在中国汉族人中，利用RHCE基因第1外显子的nt48的C→G多态性来检测RHC等位基因将产生4．44％的错误，利用109bp插入序列这一多态性来检测RHC等位基因，将导致4．05％的漏检；表型为RhD阴性的72例随机非血缘关系维吾尔族人和18份哈萨克族人样本的RHE／RHe和RHC／RHc等位基因定型结果与血清学的一致，没有发现假阳性和假阴性。结论使用PCR-序列特异性引物技术对RHE／RHe和RHc进行基因定型结果准确，与血清学结果相符；利用RHCE基因第1外显子第48位多态性来检测RHC等位基因会因RHc在此位点的突变干扰而导致假阳性结果；利用109bp插入序列来检测RHC等位基因会因109bp的缺失而导致假阴性结果，对RHC等位基因定型必须用两种以上的多态性来检测。