中国人输血产生RhCE同种抗体的风险和预防策略

目的探索一种评估输血产生RhCE同种抗体风险的新途径,并制定选择RhCE相容供者的策略。方法根据兰德施泰纳法则和群体遗传学原理,确定在随机输血中供者与受者RhCE抗原错配的组合,根据中国人Rh血型分布大数据资料,计算错配组合的概率以及找到相容供者的机会。结果分析文献报告的458542例中国人RhD、C、c、E和e抗原分型资料,结果表明在只采用RhD同型输血的策略中,RhCE抗原错配占全部输血的25.16%,其中Rh表型DCCee、DccEE、DCcee和DccEe错配分别占比14.97%、5.01%、2.21%和2.26%,表型Dccee、DCCEE、DCCEe和DCcEE错配合计占比0.71%。Rh表型DCcEe个体可以接受任何Rh表型供者的血液。结论中国人Rh血型以高频率DCe单倍型为特征,Rh表型DCCee个体是随机输血后产生RhCE同种抗体的高风险群体。RhC、c、E和e抗原分型对寻找Rh抗原匹配供者有重要意义。使用常见RhCE表型相容供者的输血,可以预防大约90%的受者产生RhCE同种抗体。

1例RHD-CE(3-7)-D基因重组与RHCE变异型患者的血清学与分子生物学分析

目的 研究分析1例Rh血型弱D、弱cE患者的血清学与分子生物学特征,为该类患者的临床安全输血提供实验依据。方法 采用微柱凝胶卡法对患者红细胞进行ABO、RhDCcEe抗原的鉴定,同时采用试管法进行血型复核,抗人球蛋白卡法筛查不规则抗体;采用PCR-SSP法对RhDCcEe(RhD、RhC、Rhc、RhE、Rhe)基因型进行检测;三代全长测序技术对RHD/RHCE基因序列进行测序分析。结果 微柱凝胶卡法鉴定ABO、RhD、RhCcEe血型抗原的结果为:A抗原(-)、B抗原(-)、RhD(1+)、RhC(4+)、Rhc(1+)、RhE(1+)、Rhe(4+)、对照孔(-);试管法ABO、RhD、RhCcEe抗原鉴定该患者表型为:A抗原(-)、B抗原(-)、RhD(w+)、RhC(4+)、Rhc(w+)、RhE(w+)、Rhe(4+),对照管(-);抗人球蛋白卡法筛查患者不规则抗体阴性;PCR-SSP法血型基因分型RhDCcEe结果:RhD(+)、RhC(+)、Rhc(+)、RhE(+)、Rhe(+);RHD/RHCE基因结果:RHD单倍体1为外显子1-10全缺失,而单倍体2为外显子RHD-CE基因重组融合,且确认其重组类型为RHD-CE(3-7)-D,起点在外显子2(g.20238-20312之间),终点在外显子8(g49184-50480之间),同时RHCE基因第6外显子存在新碱基点突变RHCE*cE(827C>A)。结论RHD-CE(3-7)-D基因重组融合与RHCE*cE(827C>A)新等位基因突变可能引起D、cE血型抗原弱表达,为临床安全输血提供了重要的实验数据支持。

基于PCR-SSP技术的RhCE血型基因型检测方法

目的 基于序列特异性引物PCR(PCR-SSP)技术建立一种用于检测临床标本红细胞RhCE血型基因型的快速定型方法。方法 将2023年9至12月宁波大学附属第一医院收检的152例乙二胺四乙酸抗凝血样分别采用试管法、间接抗人球法和微柱凝胶卡法检测RhD血型和RhCE血型。采用硅基质柱法提取样本DNA。采用Sanger测序法选择RhCE基因标准品序列。采用PCR-SSP法确定检测RhC和Rhc、RhE和Rhe两对等位基因的4对序列特异性引物。采用TA克隆技术得到重组质粒并评估序列特异性引物的灵敏度和抗干扰性能。采用PCR-SSP法检测样本,并与血清学结果进行一致性评价。结果 用表型分别为CCee、CcEe、ccEE的3个标本成功确定不同RhCE基因型的标准品序列。4对序列特异性引物能有效区分RhC和Rhc、RhE和Rhe两对等位基因。序列特异性引物在对应等位基因1:128干扰下仍能检测出且灵敏度为10~4~10~5拷贝数/μL。临床样本RhE、Rhe和Rhc基因型检测结果与表型一致性为100.00%,但RhC基因型与表型一致性只有92.76%,其中RhD阳性背景人群中的一致率为98.39%,RhD阴性背景人群中一致率为88.89%。结论 PCR-SSP技术在红细胞RhCE血型基因型快速鉴定方面具有可行性,检测RhE、Rhe和Rhc基因型与表型具有较高的一致性,对RhC基因型的检测,需区分不同RhD血型背景,建议使用两种及以上的方法进行综合判断。

广州地区RhD阴性献血者Del表型及基因型分析

目的研究广州地区RhD阴性献血者D放散型(Del)分布、表型及基因型以了解本地区DEL血型分子生物学背景。方法对2021年11月1日—2022年6月30日期间广州地区献血者采用盐水法初筛为RhD阴性血液进行间接抗人球蛋白试验(IAT)血清学确认、采用RhCE分型卡确定RhCE表型,对1146例确认RhD阴性所有C+(n=459)以及随机抽取部分C-标本(n=175)进行吸收放散(Del)筛查(共634例);提取Del阳性标本DNA进行高分辨熔解曲线分析法(HRM)实时荧光PCR检测RHD基因c.1227位点基因情况;对HRM检测RHD^(*)1227位点无突变标本采用限制性片段多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)扩增后产物作PstⅠ酶切,进行电泳分析RHD基因合子型;sanger法进行RHD基因进行外显子测序(exon 1-10),采用SeqMan软件分析基因突变情况;采用第3代单分子测序技术对可疑Del阳性标本进行RHD全基因分析。结果634例确认RhD阴性标本吸收放散试验结果显示Del表型占36.1%(229/634),占总RhD确认阴性的20%(229/1146);229例DEL的RhCE分型分别为Ccee 181例,CCee 40例,CcEe 7例,ccEe 1例,HRM结合RHD盒子型分析结果显示170例RHD基因为RHD^(*)1227A/01N.01、32例为RHD^(*)1227A/1227G,26例为RHD^(*)1227A/1227A、6例为RHD^(*)1227G/1227G(其RHD基因测序结果显示1例为弱D12型、4例为D-和1例RHD^(*)01EL.02)。结论广州地区献血者DEL个体基因型以RHD^(*)1227A/01N.01为主且其RhCE表型均为C+的特征;HRM可作为常规筛查“亚洲型”DEL血型基因的分子生物学方法。

RHCE~* ce(308C>T)突变型等位基因Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

目的建立Rh血型系统RHCE＊ ce（308C〉T）突变型等位基因的Taqman探针实时荧光定量PCR检测方法,筛查携带该等位基因的个体,并对其Rh CE血型抗原进行鉴定分析。方法针对RHCE基因c. 308C〉T突变位点设计特异性引物及Taqman-MGB探针,采用已知携带该突变位点的标本作为阳性对照,建立实时荧光定量PCR方法。应用该方法对800例RhD阴性标本、1 000例RhD阳性标本以及400例D放散型标本进行突变筛查,同时随机抽取200例标本进行RHCE基因外显子2直接测序。对筛查出携带该突变型等位基因的标本进行RHCE基因外显子2测序确证,同时应用多重连接依赖式探针扩增（MLPA）基因检测结合测序方法对其进行Rh血型基因型鉴定,并进行Rh血型血清学检测。此外,采用6种针对不同抗原表位的单克隆抗体对Rhc抗原的表达进行血清学鉴定,并采用4种抗-c进行Rhc抗原的流式细胞检测。结果成功建立RHCE＊ ce（308C〉T）等位基因的Taqman探针实时荧光定量PCR方法。应用该方法从800例RhD阴性标本中筛查出2例携带该突变型等位基因标本,RHCE基因外显子2测序结果证实存在杂合点突变（c. 308C〉T,p. 103Pro〉Leu）,但在RhD阳性及D放散型标本中未检出此突变。此2例标本的Rh抗原表型均为CCdee,基因型均为Cde/c^vde[c^v表示RHCE＊ ce（308C〉T）突变型等位基因]。该2例标本的Rhc抗原血清学和流式细胞检测均为阴性,而Rh C抗原表达正常。结论 Taqman探针实时定量PCR方法进行RHCE＊ ce（308C〉T）等位基因检测快速准确,该等位基因可导致c抗原不表达。

中国北方汉族和南方黎族RHCE基因分型

目的建立应用PCR技术进行RHCE基因分型的方法。方法应用序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)检测200例中国北方汉族、南方黎族个体的RHCE基因型,同时对5例亲子鉴定样品进行检测。结果2个民族个体RHCE基因分型结果与血清学分型结果完全一致;其中中国北方汉族RH基因型频率分布为RHCCEE1例,RHCCEe3例,RHCCee88例,RHCcEE4例,RHCcEe20例,RHCcee54例,RHccEE1例,RHccEe22例,RHccee7例;中国南方黎族RH基因型频率分布为RHCCEE2例,RHCCEe2例,RHCCee106例,RHCcEE7例,RHCcEe62例,RHCcee10例,RHccEE3例,RHccEe8例。亲子鉴定样品RHCE基因型检测结果与13个STR位点联合鉴定结论一致。结论PCR-SSP技术能准确判断中国北方汉族和南方黎族个体的RHCE基因型。

RHCE基因和RhCcEe抗原研究进展

RHCE基因编码RhCcEe抗原,与RHD基因一样,RHCE基因也存在许多基因变异体并形成许多RhCcEe抗原变异体,这些变异体可导致血清学抗原鉴定或基因分型出现一些假阳性或假阴。

RHCE基因编码区全长测序方法的建立

目的建立简易的RHCE基因编码区全长测序方法。方法依据RHCE基因序列的特异性,设计10对特异性引物分别扩增RHCE基因的10个外显子,同时再设计10条测序引物用于测序。将该方法用于检测3例Rh阳性标本、1例Rh阴性标本、1例D--表型标本及1例弱E表型标本。结果 10对特异性引物在统一的PCR条件下成功扩增出RHCE基因的10个外显子,3例Rh阳性标本及1例Rh阴性标本的测序序列与RHCE基因标准序列一致;D--标本PCR扩增和测序结果显示缺失第3、4和第5外显子,提示该个体携带一种新的由RHCE/RHD基因交换形成的等位基因RHCE-D(3-5)-CE;弱E标本测序结果发现在第5外显子存在一处碱基突变(762G>C),其他外显子测序结果未发现变异。结论 RHCE基因编码区全长测序方法可用于一般实验室进行RHCE基因测序。

多血型系统抗体鉴定和交叉配血策略一例抗-f合并抗-M

目的鉴定一例患者血浆中抗体的特异性并制定交叉配血的策略。方法采用盐水介质试管法和抗人球蛋白卡(LISS/Coombs卡)做抗体筛选和抗体鉴定,根据谱细胞、酶处理谱细胞及4℃谱细胞反应格局,确定患者血浆中意外抗体的特异性。结果患者Rh血型为CCDee,MN血型为NN。多种抗体鉴定结果显示,其血浆中存在同种抗体:Rh血型系统抗-f(f:ce复合抗原)合并MNS血型系统抗-M。结论抗-f仅与具有f抗原(R0、r)的红细胞反应,且能被蛋白水解酶增强;IgG类抗-M在4℃环境的反应性更强。经过输血免疫后,患者产生抗-f和抗-M抗体,交叉配血策略为优先选择无M抗原红细胞进行交叉配血,对配血相合的红细胞成分血进行RhCE抗原检测,选择无f抗原红细胞发血。

中国江苏地区汉族RhD阴性个体RHCE基因型多样性研究

本研究探究中国江苏地区血清学RhD阴性献血者中,含有RHD基因的献血者和不含RHD基因献血者中的RHCE基因型。采用聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法分析337例血清学RhD阴性无偿献血者的RHCE基因型;同时采用PCR-SSP扩增这些献血者RHD基因特异性位点。结果表明:337例血清学RhD阴性,其中RHD基因阳性献血者RHCE*C/C 20例,RHCE*C/c 62例,RHCE*c/c 24例,RHCE*C及RHCE*c基因频率分别为0.4811和0.5189;RHCE*E/E 0例,RHCE*E/e 25例,RHCE*e/e 81例,RHCE*E及RHCE*e基因频率分别为0.1179和0.8821。231例RHD基因阴性献血者中RHCE*C/C 3例,RHCE*C/c 34例,RHCE*c/c 194例,RHCE*C及RHCE*c基因频率分别为0.0866,0.9134;RHCE*E/E 0例;RHCE*E/e 15例;RHCE*e/e 216例;RHCE*E及RHCE*e基因频率分别为0.0325,0.9675。结论:在中国江苏地区RHD基因阴性人群中,RHCE基因主要以RHCE*ccee为主。中国江苏地区血清学RhD阴性的献血者中,RHCE基因型在含有RHD基因组和不含RHD基因组存在统计学差异。

弱RhCe型家系调查

目的 了解弱RhCe抗原遗传背景。方法 采用红细胞凝集试验检测先证者父母和兄弟姐妹的RhD、C、c、E、e抗原 ,用PCR SSP方法检测RH基因。观察Rh血型基因的构成和抗原表达情况。结果 父亲带有弱RhCe抗原和正常的RhcE抗原 ,基因型为RHCe/RHcE ;母亲有正常RhCe抗原 ,基因型为RHCe/RHCe ;先证者有与父亲相同的弱RhCe抗原 ,基因型为RHCe/RHCe ;哥哥和弟弟都仅有RhcE抗原 ,基因型为RHcE/RHCe ;姐姐有正常的RhcE和RhCe抗原 ,基因型为RHcE/RHCe。结论 我国人群中RHCE基因存在有无效的RHCe基因和弱RHCe等位基因。

RhCE抗原基因分型和表型不一致与等位基因变异的相关性研究

目的探讨变异RhCE抗原的分子背景及RHCE基因的遗传学特征与基因多态性。方法采用单克隆抗-C、-c、-E和-e试剂检测10 373例RhD阳性和635例RhD阴性献血者的RhCE表型;选择942例标本PCR-SSP技术做RHCE基因分型,对基因分型与血清学分型不一致标本采用PCR-SSP检测22个主要RHCE变异等位基因,部分RHCE等位基因采用测序技术鉴定。结果共有54例标本(占94.27%)基因分型结果与血清学表型结果不一致,经PCR-SSP检测出22种与弱表达抗原相关的RHCE等位基因变异体,经血清学复检有36例标本RhCE抗原存在弱反应或极弱反应。结论在血清学检测时表达弱反应的RhCcEe抗原标本中检出多种RHCE等位基因类型,变异的等位基因可以影响基因分型预测血型抗原的准确性:RhCE表型和基因型不一致的原因可能由变异的等位基因或未发现的等位基因引起。

中国南方汉族和西藏藏族RHCE基因109bp插入序列和733C>G多态性研究

目的研究中国南方汉族人群和西藏藏族人群RHCE基因内含子2中109bp插入序列缺失情况和外显子5中733C>G多态性,并比较2民族间有无差异。方法收集186例中国南方汉族人样本和50例西藏藏族人样本,应用PCR-SSP方法对内含子2的109bp插入序列和外显子5的733C>G多态性进行检测,并用测序方法验证。结果在中国南方汉族人群中携带RhC抗原个体其RHCE基因内含子2中109bp插入序列的缺失率为1.08%,在西藏藏族人群中缺失概率为0,二者缺失率相比无统计学差异(χ2=0.02,P>0.05)。2民族所有样本RHCE基因外显子5的733位核甘酸均为G,未发现该位点存在733C>G多态性。结论 2民族在内含子2的109bp插入序列缺失和外显子5的733C>G多态性方面未发现二者有差异。在南方汉族人群中针对RHCE基因内含子2的109bp插入序列来检测RHCc基因会因缺失而导致假阴性错误。

中国新疆维吾尔族Rh血型系统RHCE基因分型的研究

本研究目的旨在探讨新疆维吾尔族RHCE基因分型特点。根据文献设计RHCE基因检测的引物,采用序列特异性引物-聚合酶链反应(SSP-PCR)检测非血缘关系RhD阴性样本维吾尔族89例、汉族233例及RhD阳性样本汉族109例。结果表明,维吾尔族及汉族无论RhD阴性或RhD阳性全部样本中RHE/e基因分型结果与血清学检测结果一致;89例维吾尔族RhD阴性样本RHC/c等位基因分型结果与其血清学检测结果一致,而233例汉族RhD阴性及109例汉族RhD阳性样本中RHC/c基因错误定型率为5.05%。结论:本研究方法适合用于维吾尔族RHE/e基因分型,在本研究中用于维吾尔族RHC/c基因分型中未发现有错误,但今后仍需进一步验证。

RHCE基因结构研究

目的研究中国人RHCE基因结构特征。方法根据文献设计RHCE基因检测的引物,采用PCR-SSP法检测RhD阳性100例,RhD阴性300例的RHCE基因结构。结果RHE/e和RHC/c等位基因定型结果表明,RHE/e和RHc的定型结果与血清学的一致,没有发现假阳性和假阴性。利用RHCE基因外显子1的nt48的C→G多态性检测RHC等位基因将产生6.06%的假阳性,未发现假阴性。利用109bp插入序列这一多态性来检测RHC等位基因,总的假阴性率为4.00%,没有发现假阳性。结论RHE/e和Rhc基因定型可获得准确结果,对RHC等位基因的定型必须使用2种方法或利用至少2个以上的多态性位点。

1条突变型RHCE*ce新等位基因的发现

目的采用新型Rh血型系统的多重连接依赖式探针扩增(MLPA)检测试剂盒,对广州地区收集的200例RhD阴性献血者进行RHCE基因分型。方法收集RhD阴性献血者200例,从静脉血提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒进行RHCE基因分型和拷贝数定量分析。对MLPA显示的RHCE拷贝数异常的样本,进行RHCE基因外显子1至10测序分析。对发现的杂合突变进行克隆测序。结果在200例RhD阴性献血者中,MLPA基因分型结果显示有6例标本RHCE等位基因定量拷贝数下降,测序发现RHCE基因外显子2的一个新杂合突变(c.308C>T,p.103Pro>Leu),克隆测序证实了该突变。结论在中国人群中,首次发现了一条新的突变型RHCE*ce(308C>T)等位基因,该等位基因在广州地区RhD阴性献血者中频率为6/400。

南京地区Rh(D)阳性献血者RhCE抗原调查

Rh血型系统是ABO血型系统以外最具临床意义的一个血型系统，也是目前红细胞血型中最复杂的血型系统。Rh血型不合的输血可能产生严重的危及生命的溶血性输血反应，母子Rh血型不合可能会导致新生儿溶血病的发生。在Rh血型系统中，Rh（D）抗原抗体与输血的关系最密切。随着普遍采用Rh（D）同型输血及Rh（D）免疫球蛋白的使用，Rh（D）抗体引起输血反应逐渐减少。

RhCE复合抗体的鉴定及特征分析1例

目的探讨Rh血型系统CE复合抗体的鉴定及其特征。方法对1例抗体筛查试验阳性的患者,做Rh表型分型及直接抗球蛋白试验,采用微柱凝胶卡做抗体鉴定确定抗体的特异性,同时对Rh复合抗体的特征进行文献复习。结果患者Rh表型为DCcEe,血清中存在单一的Rh血型系统CE复合抗体,为抗-ce(抗-f、抗-RH6)复合抗体。结论患者红细胞上缺失ce复合抗原,通过输血或妊娠免疫,产生了针对ce复合抗原的抗-ce复合抗体,而这种抗-ce复合抗体与单纯的c或e抗原均无反应性,只与ce复合抗原有反应性。

简易RHCE基因定型方法用于Rh配型输血的可行性探讨

目的探讨简便易的RHCE基因分型技术用于Rh配型输血的可行性。方法采用PCR-SSP技术对481名定期输血的β-地中海贫血(简称地贫)患者进行Rh CcEe表型的基因分型(实验组),对其中≥3个月连续输注RhCcEe同型血的患者使用微柱凝胶卡法复查其Rh CcEe表型;对照组取400名献血者,以微柱凝胶卡法检测其Rh CcEe表型,对其中164例做RHCE基因分型;分析比较2组Rh CcEe表型频率和基因定型方法的可行性。结果实验组中203名连续接受CcEe同型输血的地贫患者,微柱凝胶卡法检测均获得Rh CcEe血清学清晰的结果,并与PCR-SSP的基因分型结果一致。对照组中164名献血者的RHCE基因分型结果亦均与其血清学结果一致,对其中7名血清学c、E或e抗原弱阳性个体所做RHCE基因编码区序列分析:仅1例观察到1059G/A杂合峰(Gen Bank KT957625),其余6例未发现异常。2组均以CcEe和CCee表型为主,分别为实验组的55. 3%(266/481)和24. 9%(120/481),对照组的49. 3%(197/400)和31. 3%(125/400)。结论简易PCR-SSP RHCE基因分型方法可初步用于中国人Rh配型输血。

PCR-SSP检测RhD阴性献血者的RHCE基因型

目的研究江苏省血清学RhD阴性献血者中,含有RHD基因的献血者和不含RHD基因献血者中的RHCE基因型。方法对江苏省血液中心和无锡市红十字中心血站无偿献血者中337例血清学RhD阴性献血者,DNA离心柱法提取血液中的基因组DNA,采用多重聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法扩增RHD基因特异性内含子4和外显子7;如为阴性,则继续检测是否含有RHD基因启动子和外显子10。并进一步检测这些献血者的RHCE基因型。结果337例血清学RhD阴性无偿献血者中有84例为RHD基因内含子4和外显子7阳性,其余253例中有22例为启动子和外显子10阳性;