郑州地区RhD变异型献血者分子生物学分析

目的研究郑州地区RhD变异型献血者血清学特征及基因突变机制。方法选择2023年1月—2023年12月送至本实验室的1619名RhD阴性献血者为研究对象,应用试管法和微柱凝胶间接抗球蛋白试验方法进行RhD阴性确认试验及RhCE表型检测。采用RHD基因扩增和Sanger测序检测RhD变异型标本基因型。结果RhD阴性确认试验共检出RhD变异型69例,比例为4.26%(69/1619)。RhCE表型分别为ccEe、Ccee、CcEe、CCee。包含17种基因型,15种D变异型表型。RHD^(*)weak partial 15等位基因最多(33例),频率为47.83%(33/69),主要表型为ccEe;其次是RHD^(*)DVI.3等位基因20例,频率为28.99%(20/69),主要表型为Ccee。RHD^(*)weak partial 15/RHD^(*)01EL.01杂合子3例,频率为4.35%(3/69),皆为CcEe表型。其他罕见基因型共13例,频率为18.84%(13/69)。抗筛阳性3例,比例为4.35%(3/69)。女性献血者2名,皆有孕产史,经抗体鉴定为抗-D;男性献血者1名,为抗-M。结论郑州地区RhD变异型献血者中RHD^(*)weak partial 15基因型最常见,其次为RHD^(*)DVI.3基因型。对保障安全供血,指导临床精准输血具有重要作用。

新疆地区249例RhD变异型基因分型研究

目的研究分析新疆地区RhD变异型标本的RHD基因分型特征。方法收集2006年1月—2023年6月常规RhD阴性确认工作中RhD抗原盐水法阴性或弱阳性、间接抗人球蛋白试验(IAT)阳性的RhD变异型标本249例,并做RhCE抗原分型,提取血液基因组DNA,采用PCR-SSP或qPCR方法对RHD基因进行分型,必要时用基因测序验证。结果249例RhD变异型标本中,检出弱D15型(RHD*15)155例(62.25%)、DⅥtype 3型(RHD*06.03.01)30例(12.05%),弱D1型(RHD*01W.1)7例(2.81%)、弱D17型(RHD*01W.17)2例(0.80%)、DⅥtype 4型(RHD*06.04)3例(1.20%)、DⅤtype 2型(RHD*05.02)9例(3.61%)、DⅢa型(RHD*03.01)1例(0.40%),以及DEL1227A(RHD*01EL.01)6例(2.41%),未能确定RHD等位基因型别,有待进一步基因测序分析的标本有36例。RHD*15的常见Rh表型为ccEe。结论新疆地区RhD变异型的RHD基因以RHD*15为最常见,并存在丰富的遗传多态性。

重庆地区RhD变异型无偿献血者的基因多态性及其表型研究

目的对重庆地区22例RhD变异型无偿献血者标本进行Rh血型血清学检测和三代基因测序,了解重庆地区RhD变异型的表型分布及其基因分型。方法选择2023年1—8月本中心参与无偿献血的人群作为研究对象。使用传统血清学方法对其进行RhD表型鉴定,确定为RhD变异型后使用D-screen试剂盒对其进行RhD不同抗原表位的检测。此外,提取其基因组DNA,使用叠瓦式引物设计进行多段扩增、拼接获得RHD基因全长序列进行三代测序检测,并用SnapGene软件对序列结果进行分析。结果在22例RhD变异型中,8例为DVI 3型(36.36%),其存在RHD-CE(3-6)-D杂交等位基因;6例部分弱D15型(27.27%),主要发生的突变为c.845G>A;6例亚洲型Del(27.27%),主要发生的突变为c.1227G>A,还有1例弱D17型发生的突变为c.340C>T和1例推测为部分D(c.491A>T,p.Asp164Val,错义突变)。结论重庆地区无偿献血人群中最常见的RhD变异型为DVI 3型,使用SMRT三代测序技术可以获得RhD变异型单倍体全长。

RhD变异体Type33型受血者同种免疫产生抗-D合并抗-E混合抗体的研究

目的:探讨1例RhD阳性患者免疫产生抗-D合并抗-E混合抗体的原因。方法:用常规血清学方法鉴定ABO/Rh血型和不规则抗体特异性,采用序列特异性引物聚合酶链式反应(PCR-SSP)检测患者的RHD基因外显子1-10区域并进行杂合性分析,利用一代测序方法分析全外显子序列。结果:患者Rh血型为弱D Type33型,其RHD等位基因为RHD01W.33,患者表现为RHD+/RHD-杂合型,Rh分型为Ccee,产生了抗-D合并抗-E混合抗体。结论:该患者RHD基因外显子4发生了c.520G>A的突变,这一变异导致了红细胞上RhD抗原的表达减弱。

芜湖地区初筛RhD阴性献血人群RHD基因分型特征

目的:了解芜湖地区献血者初筛RhD^(-)汉族人群的RHD基因分型的分子机制及分布特征。方法:收集2021年8月-2022年8月芜湖市中心血站无偿献血人群初筛RhD^(-)样本共210例,对样本的RHD基因第1、10号外显子进行PCR扩增,确定样本是否存在RHD基因。对含有D基因的82例样本RHD基因1-10号外显子进行PCR扩增及合子型分析,对55例含全部RHD外显子样本进行Sanger测序以确定基因型。结果:在210例RhD^(-)标本中,128例(60.38%)为RHD基因缺失;27例存在部分RHD外显子,包括2例RHD*DVI.3/RHD*01N.01,24例RHD*01N.04/RHD*01N.01和1例RHD-CE(2-10)/RHD*01N.01;55例含有全部RHD外显子,包括4例RHD*01/RHD*01N.01,6例RHD*15/RHD*01N.01,1例RHD*01 W.72/RHD*01N.01,1例RHD*15/RHD*01EL.01,39例RHD*01EL.01/RHD*01N.01,余下4例样本根据合子型分析确定不存在RHD基因缺失、测序显示存在1227G>A突变。结论:芜湖地区献血人群RhD^(-)D基因的分子机制存在多态性,其中RHD*01EL.01和RHD*15为本地区主要D变异型,本研究结果为本地区RhD血型鉴定和临床输血提供理论基础。

8例RhD变异型的血清学特征及基因序列分析

目的探讨RhD变异型患者的血清学特征及基因序列分析。方法采用微柱凝胶卡式法对拟输血患者进行ABO及RhD血型检测,对RhD抗原减弱及阴性标本进行盐水试管法复查和RhD阴性确认试验,对检出的D变异型样本进行基因检测。结果726例RhD抗原减弱及阴性标本经RhD阴性确认试验共检出8例D变异型,该8例样本经基因测序共检出7种基因型分别为RHD*01W.72/RHD*01N.01、RHD*15/RHD*D-CE(2)-D、RHD*01EL.01/RHD*15、RHD*DCE(3-9)-D/RHD*01N.01、RHD*15/RHD*01N.01、RHD-496G/RHD*01N.01和RHD*01EL.01/RHD*01W.71。其中,2例RHD*15/RHD*01N.01为弱D15型;1例RHD*01W.72/RHD*01N.01为弱D72型;2例RhD和RhCE基因重组,分别为RHD*15/RHD*D-CE(2)-D和RHD*D-CE(3-9)-D/RHD*01N.01;1例RHD-496G/RHD*01N.01的c.496C>G为新的RHD变异位点,已向GenBank数据库提交确认申请;3例两条配子基因均出现突变,其中2例为新的组合方式:RHD*15/RHD*D-CE(2)-D和RHD*01EL.01/RHD*01W.71。6例样本进行了RhCE表型检测,其中5例样本含有C抗原,占83.3%,以Ccee表型居多,3例,占50%。结论血清学检测联合基因测序有助于发现血型表现型和基因型特点,为了解RhD变异型及指导临床输血提供参考。

北京地区RhD阴性献血人群Rh血型研究

目的研究北京地区RhD阴性献血人群中Rh表型的分布情况及不同表型与D变异型的相关性。方法用间接抗球方法(IAT)确认检验科初筛RHD阴性个体的Rh(D)血型,用血型分型卡确定Rh系统表型。结果 3795例初筛阴性标本中ccee 2139例(56.36%)、Ccee 1045例(27.54%)、ccEe 334例(8.80%)、CCee 157例(4.14%)、Cc Ee 106例(2.79%)、ccEE 12例(0.32%)、CCEe 2例(0.05%);其中D变异型144例,各表型D变异型例数及占各自总数的比例为ccee 6例(0.28%)、Ccee 21例(2.01%)、ccEe 92例(27.54%)、CCee 14例(8.91%)、Cc Ee 9例(8.49%)、ccEE 2例(16.67%),CCEe 0例。结论北京市RhD阴性献血者以ccee为主,含有E抗原的初筛Rh阴性个体为D变异型的可能性高于其他表型的个体。

两步法分析RhD阴性及D变异体分子机制(附1例新等位基因的发现)

目的建立用于RhD阴性及RhD变异体大标本量的快速准确的筛查方法。方法采用血清学常规试管法初筛后，对初筛阴性标本以序列特异性引物多聚酶链反应（SSP—PCR）作两步法（第一步检测出阴性，D^el1227突变，以及其他变异体；第二步检定出其他变异体的具体类型）基因检测分型，并用INNO—TRAIN试剂盒作检测结果的比较，对有突变位点的变异体进行基因测序。结果在235例初筛RhD阴性标本中，检测到1—10外显子全缺失137例，2～9外显子缺失20例，1227G〉A突变63例，845G〉A突变4例，3～6外显子缺失2例，3G〉A突变1例，8～9外显子缺失1例，首次发现1例3—10外显子缺失；INNO—TRAIN试剂检测及基因测序结果与之完全符合。结论所建立的两步法基因检测分型，方法经济实用、简洁可靠，适用于大标本量筛查RhD阴性及D变异体。

32名RhD变异型献血者分子遗传背景研究

目的对广州地区收集的32例RhD变异型献血者进行基因分型,以了解RhD变异型在广州献血者中的分布情况。方法采用传统血清学方法,对2016年6月—2017年1月的RhD变异型献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的32例RhD变异型标本进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,使用Sanger测序法对RHD基因进行测序分析。使用D-Screen试剂盒对RhD变异型标本的RhD抗原表位行进一步检测。结果在32例RhD变异型标本中:检出RHD~*DVI.3/01N.01 8例、RHD~*DVI.3/DVI.3 1例、RHD~*weak partial 15/01N.01 7例、RHD~*960A/01N.01 3例、RHD~*weak D type 25/01N.01 3例、RHD~*weak D type 72/01N.01 2例、RHD~*D-CE(4)-D-CE(10)/01N.01 1例、RHD~*95A/01N.01 1例、RHD~*710T/01N.01 1例、RHD~*DVI.3/01EL.01 1例、RHD~*weak partial 15/01EL.01 1例、RHD~*weak D type 25/01EL.01 1例、RHD~*DVI.3/D-CE(3-9)-D 1例和RHD~*538A/D-CE(2-9)-D 1例。结论弱部分D15和部分DVI.3是广州地区献血者人群中最常见的RhD变异型。MLPA基因分型方法是1种有助于检出这2种不同RHD突变型等位基因的方法。

儿童患者RhD弱阳性变异体的初步分析

目的对RhD弱阳性儿童患者进行RhD变异体检测分析。方法用微柱凝胶血型鉴定卡及盐水试管法进行RhD血型初筛;微柱凝胶抗球法进行弱D确认试验;确认试验RhD弱阳性者进行PCR-SSP及RHD外显子测序分析。结果 RhD初筛阴性46例(0.38%),确认实验检出弱阳性4例(8.7%);4例RhD弱阳性标本经基因检测,1例1227A杂合子(Del型),1例DⅢa型,2例弱D15型。结论 Del型也可能被血清学方法检出;RhD弱阳性患者中抗原数量减少者较多;针对RhD阳性红细胞是否产生需进一步研究。

38例血清学弱D表型献血者RhCcEe表型与RHD基因型检测情况分析

目的研究深圳地区血清学弱D表型献血者RhCcEe表型与RHD基因型特点。方法收集38例献血者血液样本,抗-D抗体(IgM/IgG)检测RhD抗原。采用IgM抗-C、抗-c、抗-E、抗-e抗体检测RhCcEe抗原。利用PCR-SSP方法分析RHD基因10个外显子,必要时对RHD基因的所有外显子进行直接测序。统计学方法分析RhCcEe表型与RHD基因型之间的相关性。结果38例血清学弱D表型献血者中发现8种已报道的等位基因,RHD^(*)weak partial 15(15/38)、RHD^(*)DEL 1(11/38)、RHD^(*)DVI.3(5/38)、RHD^(*)weak D type 61(1/38)、RHD^(*)weak D type 95(1/38)、RHD^(*)DCC(1/38)、RHD^(*)DFR 1(1/38)、RHD^(*)weak D type 50(1/38)、RHD^(*)weak partial 15/RHD^(*)DEL 1杂合(1/38)。其中RHD^(*)weak D type 50在中国汉族人群中首次报道。另外,发现了1例新的RHD等位基因RHD^(*)IVS 9-1C(c.1228-1G>C)。该等位基因的序列数据已提交GenBank,登记号为MT755965。经相关性分析,RHD^(*)weak partial 15与RhE抗原相关系数为0.727(P<0.01),RHD^(*)DEL 1与RhC抗原相关系数为0.645(P<0.01)。结论深圳地区血清学弱D表型献血者的RHD基因结构呈现多态性,主要为RHD^(*)weak partial 15、RHD^(*)DEL 1、RHD^(*)DVI.3,并存在其他稀有的基因型;RHD^(*)weak partial 15与RhE抗原、RHD^(*)DEL 1与RhC抗原存在显著正相关。

49例初筛RhD阴性汉族个体中D基因多态性的分析

目的探讨鉴定RhD传统血清学方法和PCR-SSP基因检测方法在中国汉族个体中的应用价值。方法收集49例用传统血清学试验初筛确认的RhD阴性汉族人群标本,用PCR-SSP的方法对RhD阴性表型中个体基因进行分析,检测RhD阴性等位基因的构成。结果49例标本中,RhD阴性(RHD外显子全缺失型)29例,占总数比例59.2%;部分D型[RHD-CE(2-9)-D型]10例,占总数比例20.4%;弱D型(弱D15型)2例,占总数比例4.1%;Del型(RHD1227A纯合型)8例,占总数比例16.3%。49例标本中,经血清学吸收放散试验鉴定6例为Del型,经基因检测确定8例为Del(RHD1227A型);经血清学鉴定共12例标本为D变异型,经基因检测10例为部分D型[RHD-CE(2-9)-D2型],2例为弱D型(弱D15型)。结论RHD基因分型比血清学方法更加精准,血清学方法联合基因分型技术对于保障临床输血安全意义深远。

1例RHD^(*)weak D type 72患者的血型鉴定及家系RHD基因序列分析

目的研究1例RhD血型鉴定部分凝集结果个体及其家系血清学表现和RHD基因。方法通过血型微柱凝胶卡检测先证者ABO及RhD血型;盐水试管法检测先证者及其父母RhCcEe抗原;间接抗人球蛋白试验(indirect anti-human globulin test,IAT)及流式细胞术检测先证者RhD抗原。PCR序列特异性引物(PCR sequence specific primer,PCR-SSP)检测RHD基因以及RhD杂合型分析,基因测序方法分析RHD基因编码区序列。结果血清学检测发现先证者血型为A型RhCcee,血型微柱凝胶卡、盐水试管法以及IAT法检测RhD抗原,结果呈部分凝集现象。流式细胞术结果显示先证者RhD抗原性减弱。经RHD基因编码序列分析发现,RHD基因第9外显子上的第1212位碱基发生C>A纯合突变,为RHD^(*)weak D type 72的特征性突变点。家系调查显示,先证者父亲为O型RhCCDee,母亲为A型RhCcDee。父亲携带RHD^(*)weak D type 72等位基因,基因型为RHD^(*)weak D type 72/RHD+;母亲一条染色体缺失了全部的RHD基因,基因型为RHD+/RHD-。证明先证者分别从父亲和母亲遗传RHD^(*)weak D type 72和RHD-等位基因,基因型为RHD^(*)weak D type 72/RHD-。结论发现了1例RHD^(*)weak D type 72/RHD-基因型个体,丰富了RHD^(*)weak D type 72变异型的研究数据。根据家系调查证明,RHD^(*)weak D type 72等位基因由遗传获得,而非由个体基因变异形成。

广东省中山地区临床初检RhD阴性人群中D变异体分布及特征分析

目的研究分析中山地区初检RhD阴性人群中D变异体血清学和基因分型特征。方法研究共收集2017年12月~2019年2月中山市人民医院门诊及住院病人的血液样本24286例,采用微柱凝胶卡法对其中RhD阴性样本进行初筛;再经间接抗人球蛋白试验(indirect antiglobulin test,IAT)确认弱D或部分D变异型;然后用吸收放散试验对剩余样本进行Del表型筛选。同时,通过聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primmer,PCR-SSP)技术对初筛RhD阴性的样本进行RHD等位基因分型以及血清学方法对初筛阴性样本进行C,c,E和e抗原表型的检测。结果在24286例血液样本中初筛共检出102例阴性样本,中山地区初检阴性比例约为0.42%。经IAT确认试验共鉴定出7例弱D或部分D血液样本(6.86%),且基因型表现多样,但未见亚洲地区常见的弱D15和弱D12表型。接下来的放散试验检测出25例Del型,通过PCR-SSP基因分型技术又检出3例漏检的Del型,Del型在初检阴性样本中占比27.45%,PCR-SSP结果显示该研究中所有Del型血液样本等位基因均为RHD1227A。该研究纳入的102例初检阴性血液样本的RhCcEe表型分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡(χ^(2)=2.625,P>0.05),表示相应等位基因所占比例在遗传中保持不变。在Del型变异体中,除Ccee和CCee表型外,未见其他表型。结论中山地区人群RhD变异体有丰富的类型和不同分子机制,其中Del型占比较高,血清学与基因分型结合可提高D变异体的鉴定能力,防止漏检情况的发生。

罕见RhD变异型的分子机制及D抗原生物信息学分析

目的研究9例罕见RhD变异型的分子机制及其D抗原表位和蛋白结构。方法在深圳地区210644名无偿献血者中筛选得到RhD变异型标本9例。采用常规血清学方法对9例标本进行Rh分型,间接抗球蛋白试验(IAT)确认RhD抗原以及抗体筛查。D-screen试剂分析标本的RhD抗原表位。分别利用序列特异性引物聚合酶联反应(PCR-SSP)法和Sanger测序方法分析RHD基因杂合性和RHD基因编码区及其侧翼区域序列。利用PROVEAN、SIFT、PolyPhen-2和MutationTaster软件分析预测突变对RhD蛋白质功能的影响。使用Robetta服务器和Swiss-PdbViewer 4.1.0进行RhD蛋白模型构建。结果9例标本的RHD基因型分别为:RHD^(*)weak D type 25、RHD^(*)weak D type 50、RHD^(*)weak D type 95、RHD*weak D type 12、RHD^(*)weak D type 128和4个新的RHD等位基因。生物信息学软件和三维结构预测结果显示突变影响了蛋白质的结构和功能。结论鉴定了5个罕见的RhD变异型和4个新的RHD等位基因。这些RhD变异型的表型和基因型结果丰富了RHD等位基因库的研究数据。通过对RhD抗原的生物信息学分析,有助于进一步研究RHD基因突变对蛋白结构和功能的影响。

嘉峪关市RhD阴性汉族人群基因多态性及抗体筛选调查

目的利用分子生物学技术调查分析本地区RhD阴性人群RHD基因的多态性,对RhD阴性个体准确鉴定,制定针对不同个体的临床输血策略。方法招募RhD阴性自愿无偿献血者及患者(以孕产妇为主),经知情同意后,征询调查输血史及女性孕产史,并采集标本进行RhD阴性血清学确认、基因测序和抗体筛选鉴定。结果 96例标本中,检出73例RHD基因全缺失型,18例RHD^(*)01EL.01基因型,其中RHD1227A纯合型17例,RHD1227A杂合型1例,2例RHD^(*)15基因型,1例部分D,为RHD^(*)58基因型,2例RHD^(*)01N.16变异型。检出产生抗体者4例,其中抗-D阳性2例,抗-D和抗-E均阳性1例,抗-Di^(a)阳性1例。结论本地区RhD阴性汉族人群中DEL型比例略低于一般汉族人群数据,DEL型女性未见因怀孕或生产多胎D抗原阳性新生儿而产生抗-D或发生RhD-HDN的情况。

多重聚合酶链反应分析中国汉族人群RHD基因

目的 分析中国汉族人群 RHD基因的构成。 方法 采用 2套多重 PCR-SSP扩增体系 ,对 45 0例献血者 (3 2 8例 Rh D阳性、1 1 2例 Rh D阴性、1 0例 D变异型 )的基因组 DNA进行 RHD特异性外显子 3、4、5、6、7、9和内含子 4,RHDΨ及C、c等位基因扩增 ,并与血清学 Rh定型结果进行对比。 结果 3 2 8例 Rh D阳性献血者中 ,3 2 6例具有全部的 RHD基因特异性外显子 ,另有 2例分别为 DVa和 DIVb;1 1 2例血清学 Rh D阴性献血者中 ,3 5例存在全部的 RHD基因特异性外显子 (3 1 .2 5 % ) ,但该 3 5例样本中未检出 RHDΨ基因 3 7bp的插入片段。 1 0例 D变异型中 3例为 D ,1例 DVa,1例 RHar0 ,1例DDFR;另外 4例中 ,2例缺乏 RHD所有特异性外显子 ,2例扩增出 RHD所有特异性外显子。 结论 中国汉族人群 RHD基因的表达存在多种模式。多重 PCR体系分析 RHD基因既可诊断个体的 Rh D表型 ,又具有确认不完全 D以及发现新的

宁夏地区RhD阴性献血人群D变异型及Rh表现型研究

目的探究宁夏地区RhD阴性献血人群Rh表型分布及表型与D变异型的关系。方法Rh阴性献血者通过微量板盐水法筛选,用间接抗人球蛋白试验(IAT)进行确认,鉴定C、c、E、e抗原表型。结果在1092例初筛RhD阴性标本中,确认为RhD阴性1032例(94.51%);检出D变异型60例(5.49%),分型分别为Ccee12例(20.00%)、CCee 4例(6.67%)、ccEe 34例(56.67%)、CcEe 8例(13.33%)、ccEE 2例(3.33%);E抗原阳性初筛RhD阴性125例,D变异型占35.20%(44/125)。确认RhD阴性献血者与D变异型献血者E抗原分布差异具有统计学意义(χ^2=239.88,P<0.01)。结论宁夏地区D变异型献血者表型以ccEe为主,含有E抗原的初筛RhD阴性个体D变异型的可能性高于其他表型的个体。

利用基因定点突变技术构建RHD变异型克隆的初步研究

目的利用基因定点突变技术构建RHD变异型克隆,克服RHD变异型克隆难以获得的问题。方法提取总RNA并反转录后,扩增获得RHD和RHCE混合c DNA,从克隆质粒中筛选RHD;根据弱D12、弱D25和弱D33的特异性突变位点设计引物,分别进行PCR扩增反应,诱导目的基因突变,Dpn I酶处理PCR产物,转化后测序验证。结果克隆测序的结果显示,质粒中分别存在830A、341A和520A的突变,证实已经通过基因定点突变技术成功获得了弱D12、弱D25和弱D33的克隆。结论通过基因定点突变可以改造野生型RHD-c DNA,获得变异型的RHDc DNA,为血型研究打开新的路径。

RHD第9内含子全长序列分析

目的了解RHD第9内含子碱基变异对其正常剪切是否存在影响。方法采用PCR方法扩增和测序分析中国汉族1名正常Rh阳性个体和2名DEL(D放散型)表型个体[携带RHD(1227A)等位基因]的RHD第9内含子,并做相互比对,同时通过NCBI Basic BLAST与参考序列(GenBank BN000065)加以比对。结果在3名中国汉族个体的第9内含子中,共观察到28处碱基变异(EMBL/GenBank/DDBJ EU372940～2),其中7处变异相同,可能为中国人第9内含子的特异性碱基变异;另有1处碱基变异仅在DEL样本中检出,在正常Rh阳性个体中未发现,可能为DEL特异性。结论未发现中国汉族人DEL第9内含子存在可能影响正常拼接的碱基变异,提示DEL mRNA缺失第9外显子相应的序列的分子机制即1227A>G碱基突变造成错误拼接所致。