一种新的RHD合子型直接测定方法

目的 建立简易的RHD合子型直接测定方法。方法 根据RHD基因序列和RHD基因缺失的原理设计两对引物 ,分别特异性针对RHD基因第一外显子和融合Rh盒子 ,再引入一对内对照引物 ,建立新的双管复式PCR方法 ;并用于检测 15 2份已知RHD基因序列和基因型的DNA样本、以及 35 9份已知Rh表型样本的RHD合子型。检测结果与使用近期报道的限制性片段长度多态性(RFLP)技术的鉴定结果相比较。结果 15 2份已知RHD基因序列和基因型的DNA样本包括 92份Rh阴性、2 8份D放散型、3例部分D表型、5例弱D型及 2 4例Rh阳性样品 ,全部样品的RHD合子型PCR检测结果均与已知的基因型相符合 ,可直接判断RHD(+) /RHD(+)、RHD(+) /RHD( )和RHD( ) /RHD( )三种合子型 ;35 9份已知Rh表型的样本 ,包括 12例孕妇配偶、18名家系成员、4 8例Rh阴性及2 81例Rh阳性捐血者 ,PCR检测结果 ,除一例外 ,均与RFLP结果一致。该个例PCR检测为RHD(+) /RHD( )杂合型 ,而RFLP结果为RHD( ) /RH1D( )纯合型 ,由于个例为Rh阳性表型 ,肯定存在至少一条RHD基因 ,所以显然RFLP检测下游Rh盒子出现假阴性。结论 双管PCR技术鉴定RHD合子型 ,简便、快速 ,具有较高的准确率 ,可常规用于临床或血库实验室。

浙江汉族人群RHD基因合子型检测

目的了解浙江汉族人群RHD基因合子型多态性情况。方法采用PCR-SSP方法检测438例RhD阳性、弱D表现型、RhD阴性表型个体的RHD基因上、下游盒和杂交盒,根据个体盒子的检测结果推测其合子型。结果198例RhD阳性样本中12例(6.06%)为RHD+/RHD-型,其余186例(93.94%)为RHD+/RHD+型;32例弱D表现型样本中29例(90.63%)为RHD+/RHD-型,3例(9.37%)为RHD+/RHD+型;208例RhD阴性样本中53例(25.48%)为RHD+/RHD-型,145例(69.71%)为RHD-/RHD-型,10例(4.81%)为RHD+/RHD+型。结论浙江汉族人群中RhD阳性、弱D表现型、RhD阴性表型个体RHD基因合子型分布频率不同,RhD阴性人群中存在缺失RHD基因或有完整RHD基因的情况。

中国人RHD基因合子型检测分析

目的判定中国人群中RHD基因是否是纯合子。方法从上海地区正常献血者中选取RhD阳性、RhD阴性、Del和其它D变异型样本共50份,采用PCR-RFLP方法扩增Rhesus盒子判断RHD合子型,同时相对实时定量real-time quantitative(RQ)PCR扩增检测RHD基因第5、7外显子的特征区域。结果9份样本在2种方法的检测结果中出现矛盾。进一步对RHD基因的特异性序列进行PCR-SSP及克隆测序分析,证实这9份样本中,4份是DⅥⅢ变异型,2份是Del与RHD711del C等位基因杂合子,另外3份是携带有中国RhD阴性人群中较常见的RHD-CE(2—9)-D RH阴性等位基因。结论中国人Rh血型系统遗传背景较白种人复杂,RHD基因存在较多的变异情况。仅使用单一方法判断RHD合子型及RhD血清学表型容易产生误判,而从Rhesus盒子和RHD基因不同外显子2个角度进行综合判断,可以减少误判。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

高通量MLPA基因分型技术在1个D^(el)表型家系基因鉴定中的应用

目的对1个Del表型家系作基因鉴定。方法运用血型血清学方法对先证者及其家系的3名成员作RhD及相关血型抗原鉴定;提取先证者及其父母和妹妹的静脉血DNA。运用高通量红细胞血型基因的多重连接依赖探针扩增技术(MLPA)对先证者及其他成员血型基因作定性及定量分型;用PCR产物直接测序方法对发现的变异作确认。结果血型血清学检测:先证者为Del表型,其他3名家系成员为正常的RhD阳性个体。MLPA基因分型:先证者有2条包含1227G>A突变位点的RHD等位基因,而3名家系成员有1条包含1227G>A突变位点的RHD等位基因及1条正常的RHD等位基因。结论高通量红细胞血型基因分型的MLPA技术能够对Del表型作明确的基因鉴定,有助于节约宝贵的RhD阴性血液。