胎儿RhD基因型的诊断研究

【目的】 建立一种新生儿RhD血型出生前基因诊断的方法。 【方法】 采用PCR技术对 2 7例妊娠14～ 40周的单胎孕妇血浆中游离胎儿DNA进行RhD基因第 10外显子的特异性扩增 ,扩增片段长度为 186bp ,另外以等位基因RhCE基因为内对照 ,扩增片段长度为 13 6bp。 【结果】 10例Rhd-孕妇中 ,6例扩增出 13 6bp一条特异性片段 ,4例同时扩增出 13 6bp和 186bp两条特异性片段 ;17例RhD+ 孕妇血浆标本 ,均同时扩增出 13 6bp和 186bp两条特异性片段 ,所有RhD PCR扩增结果均得到新生儿脐血血清学检测结果的证实。 【结论】 PCR扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA ,是一种简便、快速且无损伤性的产前诊断胎儿RhD基因型的方法 。

检测孕妇血浆游离胎儿DNA预测胎儿RhD基因型的研究

目的研究运用实时荧光定量PCR技术检测孕妇血浆游离胎儿DNA来预测胎儿RhD基因型的可行性。方法通过微量DNA抽提技术,用实时荧光定量PCR检测81例RhD阴性孕妇血浆游离胎儿DNA,用男性性别决定基因(SRY)确定胎儿DNA的存在,以未有妊娠史的健康女性和健康男性作为阴性和阳性基因对照。对53例孕男胎的RhD阴性孕妇血浆游离胎儿DNA进行RhD基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,与孕妇产后采集的新生儿脐血RhD定型结果对比分析。结果①81例RhD阴性孕妇中53例经产后证实为男胎,母血浆中检测到男性性别决定基因(SRY)特异性扩增的51例,灵敏度为96.2%,特异性为93.3%,准确率为97.5%,说明存在胎儿DNA。②孕妇血浆中胎儿DNA的RhD基因型检测,53例中有49例胎儿DNA的RhD基因型与表型相符,准确率为92.5%。结论利用实时荧光定量PCR技术检测RhD阴性孕妇血浆游离胎儿DNA来预测胎儿RhD基因型,是一种敏感性高、特异性好的无创性产前诊断方法,可用于新生儿RhD溶血病的诊断和预防。

应用实时荧光定量PCR检测母血浆胎儿DNA进行RhD基因型产前诊断

目的建立实时荧光定量PCR(real time PCR)技术检测RhD阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性产前诊断胎儿RhD基因型的方法。方法通过微量DNA抽提技术提取母血浆中胎儿游离DNA,利用Real time PCR检测22例妊娠15～40周的单胎RhD阴性孕妇血浆中胎儿游离DNA,进行男性性别决定基因(SRY)和RhD基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,基因型结果与血清学RhD定型结果对比,评价该技术方法的准确性。结果孕妇血浆中存在游离胎儿DNA。19例RhD真阴性孕妇血浆中,14例均检测到胎儿游离DNA的RhD基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,判断为RhD阳性,基因定型结果与血清学表型相符。3例未检测到胎儿游离DNA的RhD基因特异性扩增,结果与胎儿血清学表型相符。因此检测胎儿游离DNA的RhD基因型准确率达到89.5%。另外2例只检测到RhD基因外显子10扩增,通过新生儿脐血血清学吸收放散试验确定为RhDel型。3例RhDel型孕妇血浆中检测到RhD基因扩增,不适于胎儿RhD基因型的分型。结论实时荧光定量PCR方法检测RhD阴性孕妇血浆中游离胎儿DNA进行无创性诊断胎儿RhD基因型,是一种简便、准确、快速的产前基因诊断的可行性方法,值得临床推广应用。

应用多重PCR方法鉴定RHD基因型的研究

目的建立一种可靠的PCR方法,用于RHD血型基因型的研究。方法根据RHD血型基因的特点,设计针对不同RHD基因型的特异性引物,建立多重PCR方法,并与商用试剂盒进行对比。结果本研究所建立的用于鉴定RHD血型基因型的多重PCR方法,与商用试剂盒具有相同的试验结果。结论本研究建立的多重PCR方法具有简便、准确和经济的特点,可以用于RHD基因分型。

用荧光定量PCR的方法检测RhD基因型

Rh血型的确定在产科临床上有重要的意义。近20年,虽然由Rh血型不合而引起的同种免疫疾病因为Rh免疫球蛋白的应用而急剧下降,但仍有0.83％～1.

RhD血型基因定型在新生儿溶血病产前诊断的应用

目的检测血液RhD血型基因型并应用于新生儿溶血病(HDN)的产前诊断。方法采用聚合酶链反应序列特异性引物(PCR SSP)方法,根据PCR产物的强弱判定RhD基因型。结果36名个体血液样本中,10名为RhD-/RhD-纯合子,3名为RhD+/RhD-杂合子,23名为RhD+/RhD+纯合子。结论该方法可以准确检测出RhD血型基因型,并可用于RhD血型不合引起HDN的产前诊断。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

血清学弱D表型患者RHD基因分型的必要性

Rh血型是最复杂的血型系统,D抗原是其最重要的抗原,临床意义仅次于ABO血型抗原。对绝大多数血型抗原而言,如果排除检测试剂和实验方法等因素的干扰,血清学试验能够明确显示血型抗原阳性或阴性,而D抗原则不同,由于红细胞（RBC）表面D抗原质和/或量的改变,在盐水介质加入抗-D血清无凝集或弱凝集,加入抗球蛋白（anti-human globulin, AHG）后,即间接抗球蛋白试验（indirect antiglobulin test，IAT）发生凝集，统称为“血清学弱D表型（serologic weak D phenotype，SWDP）”。

中国人RHD基因合子型检测分析

目的判定中国人群中RHD基因是否是纯合子。方法从上海地区正常献血者中选取RhD阳性、RhD阴性、Del和其它D变异型样本共50份,采用PCR-RFLP方法扩增Rhesus盒子判断RHD合子型,同时相对实时定量real-time quantitative(RQ)PCR扩增检测RHD基因第5、7外显子的特征区域。结果9份样本在2种方法的检测结果中出现矛盾。进一步对RHD基因的特异性序列进行PCR-SSP及克隆测序分析,证实这9份样本中,4份是DⅥⅢ变异型,2份是Del与RHD711del C等位基因杂合子,另外3份是携带有中国RhD阴性人群中较常见的RHD-CE(2—9)-D RH阴性等位基因。结论中国人Rh血型系统遗传背景较白种人复杂,RHD基因存在较多的变异情况。仅使用单一方法判断RHD合子型及RhD血清学表型容易产生误判,而从Rhesus盒子和RHD基因不同外显子2个角度进行综合判断,可以减少误判。

D抗原阳性个体及无效等位基因携带者RHD基因数目测定

目的 测定Rh血型D抗原阳性个体的RHD基因数目。方法 采用聚合酶链式反应 限制性片段长度多态性 (PCR RFLP)技术 ,扩增 10名D阳性、5名弱D、2 5名Del表型和 12名携带无效等位基因的Rh阴性个体的RH基因座位下游盒子和融合盒子序列 ,产物经DNA限制性内切酶PstI消化后电泳 ,以 5份经血清学和序列分析基因分型方法确认的D阴性样本作为RHD-/RHD-纯合子对照 ,鉴定RHD+ /RHD+ 或RHD+ /RHD-基因型。结果 10名D阳性个体均为RHD+ /RHD+ 纯合子、5份弱D样本及 12名携带无效等位基因的Rh阴性个体全部为RHD+ /RHD-杂合型。 2 5名Del表型个体中 9人为RHD+ /RHD+ 纯合型 (36 % ) ,其中 6人Rh表型为DCCee、3人为DCcee ;另 16名Del个体为RHD+ /RHD-杂合型 ,Rh表型均为DCcee。结论 D阳性个体RHD+ /RHD+ 纯合型多见 ,弱D型个体以RHD+ /RHD-杂合型为主 ,在Del表型个体存在高比率的RHD+ /RHD+ 纯合型 ;携带无效等位基因的个体多为RHD+

基于RASSF1A为标志的无损性孕妇血浆中胎儿RHD-DNA检测方法的建立

目的建立基于表观遗传标志RASSF1A为标志的孕妇外周血浆中胎儿RHD-DNA检测路径,用于无损性产前胎儿RhD血型预测。方法首先采用PCR-SSP对孕妇外周血细胞基因组DNA做RHD基因多个外显子检测,以确定其RHD基因型;其次对无外显子表达或部分外显子表达的孕妇,对其外周血浆中胎儿游离的DNA采用RTPCR扩增其RHD基因exon7与10,同时扩增SRY基因;另对exon 7、10和SRY都为阴性的标本检测甲基化RASSF1A基因作为胎儿DNA存在的标志。待胎儿分娩后,将基因检测结果与婴儿血清学检测结果比对,以评价该方法的准确性。结果 57位受检孕妇中,含RHD全部外显子者有17人;3人含exon 1和10,为RHD1-CE(2-9)-D10杂化基因;37人不含外显子。后两者40名孕妇中,22人检测出SRY基因,出生胎儿均为男性;另有2人为假阴性结果。39人检测出exon 7和10,其中38人基因型结果与胎儿出生后血清学结果相符,1例假阳性结果;1人未检测到SRY、exon 7和10的标本,检测到RASSF1A证明胎儿DNA存在,且胎儿出生后证实为RhD阴性女婴。结论建立了基于RASSFIA为标志的、符合中国人RHD基因特点的RhD阴性孕妇血浆游离DNA中胎儿RHD基因的检测程序,可用于临床无损性产前胎儿RhD血型预测。

Rh阴性孕妇外周血基因鉴定胎儿RhD血型的方法

目的建立可靠有效的检测孕妇外周血中胎儿游离DNA的方法,探讨其在非创伤性产前诊断中的价值。结论采用PCR技术对5例RhD阴性孕妇外周血血浆DNA进行分析,然后对出生后婴儿脐带血进行Rh血清学表型分析,回顾性评价无创性预测胎儿RhD基因分析的准确性。结果 5例RhD阴性血浆标本扩增出180bp与156bp两条特异性片段,产后新生儿脐血血清学检测结果为RhD阳性,与PCR检测结果完全吻合。结论孕妇外周血浆中胎儿游离DNA的测定能实现对胎儿RhD基因型的预测判定。孕妇外周血检测胎儿DNA可应用于非创伤性产前诊断。

RhD阴性育龄妇女中RHD1227A基因型检测的临床意义

目的:研究RhD阴性育龄妇女RHD1227A基因型检测的价值。方法:采用血清学方法检测RhD血型,采用分子生物学技术(熔解曲线分析法)检测RHD1227A基因。结果:261例RhD初筛阴性妇女,RHD1227A基因型46例,占17.62%;且RHD1227A基因型只存在于93例含C抗原的表现型中,占这类表现型的49.46%。对38例生育1胎的RHD1227A基因型妇女进行生育2胎意愿调查,检测前后,有意愿从43.75%提升到87.5%。结论:RhD阴性育龄妇女RHD1227A基因型是常见基因型,与含C抗原表现型密切相关,对其检测有利于制定胎-母免疫保护策略和提高育龄妇女2胎意愿。

RhD血型检测在HDN产前诊断中的意义

目的探讨RhD血型检测在新生儿溶血病(HDN)产前诊断中的意义。方法对产前检查的孕妇7230例做RhD血型检测,对其中27例RhD阴性孕妇的配偶采血用双管PCR法做RhD基因定型,了解其RhD基因是纯合子还是杂合子,以预测由于RhD血型不合引起HDN的风险。结果7230例孕妇中RhD阴性有27例,占0.37%,对其配偶的RhD基因检测显示,19例为RhD+/RhD+纯合子,另外8例为RhD+/RhD-杂合子。结论检测RhD血型及基因型在RhD血型不合引起HDN的产前诊断中有重要意义。