郑州地区RhD变异型献血者分子生物学分析

目的研究郑州地区RhD变异型献血者血清学特征及基因突变机制。方法选择2023年1月—2023年12月送至本实验室的1619名RhD阴性献血者为研究对象,应用试管法和微柱凝胶间接抗球蛋白试验方法进行RhD阴性确认试验及RhCE表型检测。采用RHD基因扩增和Sanger测序检测RhD变异型标本基因型。结果RhD阴性确认试验共检出RhD变异型69例,比例为4.26%(69/1619)。RhCE表型分别为ccEe、Ccee、CcEe、CCee。包含17种基因型,15种D变异型表型。RHD^(*)weak partial 15等位基因最多(33例),频率为47.83%(33/69),主要表型为ccEe;其次是RHD^(*)DVI.3等位基因20例,频率为28.99%(20/69),主要表型为Ccee。RHD^(*)weak partial 15/RHD^(*)01EL.01杂合子3例,频率为4.35%(3/69),皆为CcEe表型。其他罕见基因型共13例,频率为18.84%(13/69)。抗筛阳性3例,比例为4.35%(3/69)。女性献血者2名,皆有孕产史,经抗体鉴定为抗-D;男性献血者1名,为抗-M。结论郑州地区RhD变异型献血者中RHD^(*)weak partial 15基因型最常见,其次为RHD^(*)DVI.3基因型。对保障安全供血,指导临床精准输血具有重要作用。

熔解曲线分析法用于RHD 1227G>A基因分型的实验研究

目的建立用于RHD 1227G〉A基因分型的熔解曲线分析法。方法设计合成RHD 1227G〉A等位基因特异性引物和公共引物,并在2条等位基因特异性引物5＇端加上不同长度的GC序列。在实时PCR反应后,进行熔解曲线分析,依据PCR产物熔解温度的差异,对RHD 1227G〉A基因分型。将建立的熔解曲线分析法与常规的PCRSSP法比较。对于2种方法检测结果不符的标本,进行RHD基因第9外显子测序,确定该标本为RHD 1227G〉A基因型。结果应用熔解曲线分析法对84例标本进行基因分型,其中RHD 1227A＋/G-32例,1227A-/G＋22例,1227A＋/G＋6例,1227A-/G-24例。发现2例标本熔解曲线法检测的基因型为1227A＋/G-,而PCR-SSP法检测结果为1227A＋/G＋。经基因测序证实这2例标本结果是1227A＋/G-。结论用于RHD 1227G〉A基因分型的熔解曲线法具有操作简单、快速、准确等优点,优于常规的PCR-SSP法。

RHD845A/1227A基因型个体家系调查分析

本研究对1例RHD845A/1227A基因型个体进行家系调查分析,并分析他们的遗传特性。通过盐水法和间接抗人球蛋白试验(IAT)检测RH(D)抗原,PCR-SSP法检测RHD1227A和RHD845A等位基因以及RHD合子型,基因测序方式分析RHD基因编码区序列。研究结果表明:血清学检测发现1例RH(D)抗原盐水法检测阴性、IAT法检测阳性样本,经RHD基因编码序列分析发现,RHD第845位与第1227位均出现G/A碱基杂合现象,推测该个体基因型可能为RHD845A/1227A。家系调查显示,先证者父亲为RHD阴性,母亲为RHD阳性。PCR-SSP检测结果显示,父亲携带RHD1227A等位基因,基因型为RHD1227A/RHD-;母亲携带RHD845A等位基因,基因型为RHD845A/RHD+,证明先证者分别从父亲和母亲遗传RHD1227A和RHD845A等位基因,基因型为RHD845A/1227A。结论:经过家系调查分析发现了1例罕见的RHD845A/1227A基因型个体。根据家系调查证明,RHD845A和RHD1227A等位基因分别由遗传获得,而非由个体基因变异形成。

RhD阴性育龄妇女中RHD1227A基因型检测的临床意义

目的:研究RhD阴性育龄妇女RHD1227A基因型检测的价值。方法:采用血清学方法检测RhD血型,采用分子生物学技术(熔解曲线分析法)检测RHD1227A基因。结果:261例RhD初筛阴性妇女,RHD1227A基因型46例,占17.62%;且RHD1227A基因型只存在于93例含C抗原的表现型中,占这类表现型的49.46%。对38例生育1胎的RHD1227A基因型妇女进行生育2胎意愿调查,检测前后,有意愿从43.75%提升到87.5%。结论:RhD阴性育龄妇女RHD1227A基因型是常见基因型,与含C抗原表现型密切相关,对其检测有利于制定胎-母免疫保护策略和提高育龄妇女2胎意愿。

1名RhD弱表现型个体携带D^(el)等位基因

目的 探讨 1名RhD弱表现型个体的RH基因型及RHD基因的分子机制。方法 采用常规血清学方法检测RhD、C、c、E和e抗原表型 ,间接抗球蛋白试验确认D抗原 ,用序列特异性引物 聚合酶链反应 (PCR SSP)测定RHD/RHCE基因 ,然后分析RHD编码区全长序列 ,并用PCR检测RhD杂合型。结果 血清学结果显示该个例为D抗原弱表现型 ,Rh因子为D +C +c +E e +,PCR SSP检测RHD/RHCE基因与之相符 ;RHD编码区序列析发现第 9外显子存在 1 2 2 7G→A碱基突变 ,其余外显子序列则与正常RHD基因一致 ,表明该个体携带RHD1 2 2 7A等位基因。RhD合子型鉴定结果为RHD +/RHD -杂合型 ,拟定RHCE和RHD为cis遗传 ,提示该个体基因型为CDe/cde。结论 该RhD弱表现型个体携带RHD 1 2 2 7A等位基因 ,而这一等位基因是Del表型的主要等位基因 。

多重连接依赖的探针扩增(MLPA)技术在广州地区RhD阴性献血者基因分型研究中的应用

目的采用新型Rh血型系统的MLPA检测试剂盒,对广州地区收集的200名RhD阴性献血者进行基因分型。方法采用传统的血型血清学方法,对RhD阴性献血者进行RhD表型鉴定。提取基因组DNA,采用MLPA检测试剂盒对收集的200名RhD阴性献血者进行RHD基因分型。对于不能明确分型的标本,进行RHD基因直接测序分析。结果在200名RhD阴性献血者中,采用MLPA方法对196名进行了明确的基因分型。其中,127名为RHD基因缺失(占63.5%);仅检测到包含RHD1227A突变的DEL等位基因有41例,其中38例包含杂合等位基因,其余3例包含纯合等位基因;仅检测到RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10)等位基因的有23例,其中19例杂合,4例纯合;3例包含2种不同的RHD等位基因(1条为RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为RHD1227A);其余2例分别包含杂合的DFR-2(RHD-CE(4)-D)及弱D15型(RHD845A)等位基因。在其余4例直接测序分析的标本中,2例包含杂合的RHD711delC突变;1例1条等位基因为MLPA检测到的包含RHD1227A突变的DEL等位基因,另1条为包含711delC突变的RHD等位基因;其余1例的1条等位基因为MLPA检测到的RHD(1-2)-CE(3-9)-D(10),另1条为包含新突变的RHD等位基因(1154G>T,385Gly>Val)。结论 MLPA检测试剂盒是适用于中国人群的1种快速、有效的高通量基因分型方法,能够对中国人群常见的各种RHD基因型进行明确分型,适用于参比实验室相关疑难标本的基因分型检测。也可应用于中国人群常见的Del表型检测,使Del表型患者不必再输注RhD阴性血液,节约稀有的RhD阴性血液资源。

RhD阴性初筛样本的血清学和基因分型结果

目的了解初筛RhD阴性血液样本的血清学和基因分型检测结果。方法对107例初筛为RhD阴性血液样本,用间接抗人球蛋白试验(IAT)检测弱D型,用吸收放散试验检测DEL型。对3例弱D型、28例吸收放散试验阳性和35例吸收放散试验阴性的标本进行基因分型检测。结果 107例初筛为RhD阴性的样本用血清学方法检出3例弱D型(2.8%);吸收放散试验检测出阳性30例(28.0%),阴性74例(69.2%)。基因分型结果表明,3例弱D型中2例为RhD阳性,1例为弱D15型;对74例吸收放散试验阴性标本中的35例进行了基因分型,其中RhD阴性28例(80.0%),RhD-CE(2-9)-D型5例(14.3%),DEL 1227A型2例(5.7%);RhD DEL型基因分型检测结果表明,28例吸收放散阳性标本中DEL 1227A型19例(67.9%),未能分型5例(17.9%),未出现条带4例(14.3%)。用RhD阴性鉴定基因分型检测试剂盒对4例未现条带者进行基因分型,结果为弱D15型1例,RhD阴性2例,RhD阳性1例;初筛RhD阴性样本中,血清学检出率为69.2%,基因分型检出率为57.3%,差异无统计学意义(χ2=1.78,P>0.05)。结论初筛为RhD阴性样本中RhD基因存在多态性,DEL 1227A型是DEL型的主要等位基因。

RhD初筛阴性孕产妇RHD基因表型相关研究

目的研究不同RhD基因型与抗-D产生的相关性,以发现与产生抗-D及能引起Rh血型新生儿溶血病(HDN)相关的D基因表型。方法应用血清学方法结合分子生物学(PCR-SSP)技术。结果 RhD初筛阴性样本128例,再行RhD阴性确认试验,有3例样本阳性,为D变异型。根据分子生物学结果表明缺失RHD基因104例;DEL型21例;弱D15型2例;DⅥ型Ⅲ型1例。结论应对RhD抗原初筛试验阴性的个体进一步鉴定RHD基因型,以预测与评估产生抗-D的可能性,从而对孕产妇进行孕期指导、监测及产后干预。

中国江苏地区汉族RhD阴性个体RHCE基因型多样性研究

本研究探究中国江苏地区血清学RhD阴性献血者中,含有RHD基因的献血者和不含RHD基因献血者中的RHCE基因型。采用聚合酶链式反应-序列特异性引物(PCR-SSP)方法分析337例血清学RhD阴性无偿献血者的RHCE基因型;同时采用PCR-SSP扩增这些献血者RHD基因特异性位点。结果表明:337例血清学RhD阴性,其中RHD基因阳性献血者RHCE*C/C 20例,RHCE*C/c 62例,RHCE*c/c 24例,RHCE*C及RHCE*c基因频率分别为0.4811和0.5189;RHCE*E/E 0例,RHCE*E/e 25例,RHCE*e/e 81例,RHCE*E及RHCE*e基因频率分别为0.1179和0.8821。231例RHD基因阴性献血者中RHCE*C/C 3例,RHCE*C/c 34例,RHCE*c/c 194例,RHCE*C及RHCE*c基因频率分别为0.0866,0.9134;RHCE*E/E 0例;RHCE*E/e 15例;RHCE*e/e 216例;RHCE*E及RHCE*e基因频率分别为0.0325,0.9675。结论:在中国江苏地区RHD基因阴性人群中,RHCE基因主要以RHCE*ccee为主。中国江苏地区血清学RhD阴性的献血者中,RHCE基因型在含有RHD基因组和不含RHD基因组存在统计学差异。

应用多重PCR方法鉴定RHD基因型的研究

目的建立一种可靠的PCR方法,用于RHD血型基因型的研究。方法根据RHD血型基因的特点,设计针对不同RHD基因型的特异性引物,建立多重PCR方法,并与商用试剂盒进行对比。结果本研究所建立的用于鉴定RHD血型基因型的多重PCR方法,与商用试剂盒具有相同的试验结果。结论本研究建立的多重PCR方法具有简便、准确和经济的特点,可以用于RHD基因分型。

浙江汉族人群RHD基因合子型检测

目的了解浙江汉族人群RHD基因合子型多态性情况。方法采用PCR-SSP方法检测438例RhD阳性、弱D表现型、RhD阴性表型个体的RHD基因上、下游盒和杂交盒,根据个体盒子的检测结果推测其合子型。结果198例RhD阳性样本中12例(6.06%)为RHD+/RHD-型,其余186例(93.94%)为RHD+/RHD+型;32例弱D表现型样本中29例(90.63%)为RHD+/RHD-型,3例(9.37%)为RHD+/RHD+型;208例RhD阴性样本中53例(25.48%)为RHD+/RHD-型,145例(69.71%)为RHD-/RHD-型,10例(4.81%)为RHD+/RHD+型。结论浙江汉族人群中RhD阳性、弱D表现型、RhD阴性表型个体RHD基因合子型分布频率不同,RhD阴性人群中存在缺失RHD基因或有完整RHD基因的情况。

RHD1227A型弱D的D抗原表位分析

目的分析携带RHD1227A等位基因的Rh血型弱D型个体的红细胞D抗原表位。方法采用常规血清学方法检测Rh血型D、C、c、E和e抗原表型,间接抗人球蛋白试验(IAT)确认D抗原,序列特异性引物-聚合酶链反应(PCR-SSP)测定RHD基因,并检测RHD杂合型。对确认的弱D型,使用12种抗-D抗原不同表位的单克隆抗体,分析红细胞D抗原表位。结果血清学筛选和PCR-SSP检测鉴定出3例携带RHD1227A等位基因的弱D型样本,Rh小因子均为C+c+E-e+,RHD合子型鉴定均为RHD+/RHD-杂合型,提示3例个体基因型为CDe/cde。3例个体红细胞D抗原表位分析显示均具有基本完整D抗原表位,与Rh(D)阳性对照样本相同。结论发现3例RHD1227A型弱D型;不管RHD1227A等位基因表达DEL型或弱D型,其D抗原表位近似,均表达基本完整D抗原,提示该等位基因不同量的表达可能与其它调节因素有关。

河北地区汉族人群RhD阴性血型中Del基因型分布

到目前为止，Rh血型系统是国际输血协会（ISBT）已确认的29个红细胞血型系统中最复杂、最具多态性的血型系统，主要包括D、E、C、c、e5种抗原，D抗原（ISBT004．001；RH1）的免疫原性最强，是临床上引起新生儿溶血病、溶血性输血反应的最重要的血型抗原，其在红细胞上质和量的改变可产生弱D、部分D和Del型，统称为D变异型。

RhD放散型相关的等位基因的鉴定

目的 :为了探讨D放散型 (Del)表型的分子基础。方法 :采用序列分析方法分析 2 6名Del表型个体RHD基因全长编码区和一名个体的RHD基因第 7内含子部分序列 ;同时使用血清学方法检测全部个体的RhCcEe表型。结果 :全部样品的第 9外显子均存在RHD 12 2 7G >A碱基突变 ,其余序列则与正常RHD基因一致 ,一名个体的第 7内含子观察到一处碱基突变RHDIVS7+15 2c >a ;血清学结果显示所有Del表型个体均为RhC抗原阳性个体。结论 :由于 12 2 7A位于RHD基因第 9外显子与第 9内含子交界处 ,可能影响前RNA转录后mRNA的正常拼接 ,形成Del表型。

RhD血型基因定型在新生儿溶血病产前诊断的应用

目的检测血液RhD血型基因型并应用于新生儿溶血病(HDN)的产前诊断。方法采用聚合酶链反应序列特异性引物(PCR SSP)方法,根据PCR产物的强弱判定RhD基因型。结果36名个体血液样本中,10名为RhD-/RhD-纯合子,3名为RhD+/RhD-杂合子,23名为RhD+/RhD+纯合子。结论该方法可以准确检测出RhD血型基因型,并可用于RhD血型不合引起HDN的产前诊断。

RhD变异型DⅥ Ⅲ型分子生物学研究

目的探讨RhD变异型DⅥⅢ型的分子生物学机制。方法选取2020年11月至2022年5月北京市红十字血液中心血型室接收的RhD血型弱阳性患者血样。使用3个厂家的单克隆抗-D(1个IgM、2个IgM/IgG抗-D)检测患者RhD血型,其中IgM抗-D采用盐水试管法(saline tube method,S)、IgG抗-D采用间接抗人球蛋白试验(indirect anti-human globulin test,IAT);采用直接抗人球蛋白分型卡和Rh分型卡检测患者直抗(direct anti-human globulin test,DAT)和RhCcEe抗原。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测RHD基因缺失情况、RHD基因10个外显子全序列及其相邻侧翼内含子测序分析样本RHD基因型。结果共纳入RhD血型弱阳性患者血样8份,盐水试管法均只与一个厂家的抗-D试剂(IgM/IgG抗-D)呈弱阳性反应,IgM抗-D和另一家IgM/IgG抗-D阴性;IAT与2个厂家的抗-D试剂(IgM/IgG抗-D)均4+;DAT均阴性;RhCcEe表型分别为Ccee(6/8)、ccee(1/8)、CcEe(1/8)。实时荧光定量PCR结果均为RHD基因外显子E3~E6缺失,RHD基因外显子全序列测序均为RHD^(*)06.03.01。结论通过分子生物学方法对RHD基因的检测能准确鉴定为DⅥⅢ型,为受血者和供血者在临床输血中提供不同的保障策略。

胎儿RhD基因型的诊断研究

【目的】 建立一种新生儿RhD血型出生前基因诊断的方法。 【方法】 采用PCR技术对 2 7例妊娠14～ 40周的单胎孕妇血浆中游离胎儿DNA进行RhD基因第 10外显子的特异性扩增 ,扩增片段长度为 186bp ,另外以等位基因RhCE基因为内对照 ,扩增片段长度为 13 6bp。 【结果】 10例Rhd-孕妇中 ,6例扩增出 13 6bp一条特异性片段 ,4例同时扩增出 13 6bp和 186bp两条特异性片段 ;17例RhD+ 孕妇血浆标本 ,均同时扩增出 13 6bp和 186bp两条特异性片段 ,所有RhD PCR扩增结果均得到新生儿脐血血清学检测结果的证实。 【结论】 PCR扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA ,是一种简便、快速且无损伤性的产前诊断胎儿RhD基因型的方法 。

检测孕妇血浆游离胎儿DNA预测胎儿RhD基因型的研究

目的研究运用实时荧光定量PCR技术检测孕妇血浆游离胎儿DNA来预测胎儿RhD基因型的可行性。方法通过微量DNA抽提技术,用实时荧光定量PCR检测81例RhD阴性孕妇血浆游离胎儿DNA,用男性性别决定基因(SRY)确定胎儿DNA的存在,以未有妊娠史的健康女性和健康男性作为阴性和阳性基因对照。对53例孕男胎的RhD阴性孕妇血浆游离胎儿DNA进行RhD基因外显子7、10和内含子4的特异性扩增,与孕妇产后采集的新生儿脐血RhD定型结果对比分析。结果①81例RhD阴性孕妇中53例经产后证实为男胎,母血浆中检测到男性性别决定基因(SRY)特异性扩增的51例,灵敏度为96.2%,特异性为93.3%,准确率为97.5%,说明存在胎儿DNA。②孕妇血浆中胎儿DNA的RhD基因型检测,53例中有49例胎儿DNA的RhD基因型与表型相符,准确率为92.5%。结论利用实时荧光定量PCR技术检测RhD阴性孕妇血浆游离胎儿DNA来预测胎儿RhD基因型,是一种敏感性高、特异性好的无创性产前诊断方法,可用于新生儿RhD溶血病的诊断和预防。