RHD1227A等位基因在Rh阴性人群的频率研究

目的调查衢州地区Rh阴性人群中RHD1227A等位基因频率。方法Rh表型鉴定采用常规盐水试管法。74例来源于随机无偿献血人群的Rh阴性样本,用序列特异性引物-聚合酶链反应进行RHD1227A等位基因鉴定。结果在74例Rh阴性样本中,25例RHD1227A等位基因检测为阳性(33.8%)。具有RhC抗原的表型,RHD1227A等位基因阳性率为61.0%,而RhC抗原阴性的表型,RHD1227A等位基因均为阴性。结论衢州地区Rh阴性人群中RHD1227A等位基因频率为33.8%,RHD1227A等位基因和RHC等位基因具有一定的关联性。

辽宁地区RHD1227A等位基因的频率调查研究

目的研究调查辽宁地区RHD1227A等位基因在RhD阴性人群和随机人群中的基因频率。方法采用吸收放散试验和RHD基因特异的聚合酶链反应-序列特异性(PCR-SSP)筛查Del表型,RHD外显子9的核苷酸序列分析方法确认RHD1227A等位基因,RHD等位基因数采用D杂合性试验进行确定。结果在117例RhD阴性献血者中,吸收放散试验阳性24例,19例RHD外显子9测序结果检测到RHD1227A等位基因,2例测序结果含有RHD1227G等位基因,3例RHD外显子9扩增阴性;PCR-SSP方法共检测到23例RHD1227A等位基因携带者,与RHD外显子9测序结果一致。

RHD 1227A等位基因在Rh阴性人群和随机人群中的频率研究

本研究调查RHD1227A等位基因在Rh阴性人群和随机人群中的频率。采用等位基因特异-聚合酶链反应(allelespecific-polymerasechainreaction,AS-PCR)检测RHD1227A等位基因,RHD基因拷贝数采用D杂合性试验和RHD外显子9的核苷酸序列分析方法进行确定。结果表明在143例Rh阴性献血员中,共检测到41例RHD1227A等位基因携带者,其中8例(19.51%)为RhCCdee,32例(78.05%)为RhCcdee,1例(2.44%)为RhCcdEe。在这41例RHD1227A等位基因携带者中,35例有RHD基因的缺失,另外的6例是RHD1227A等位基因的纯合子。在489例随机献血员中检测到7例RHD1227A等位基因先证者,都是RHD1227G/A杂合子,且是正常Rh阳性血型。结论RHD1227A等位基因在Rh阴性人群中的频率为16.43%,在随机人群中的频率为0.72%。

RHD^(*) 1227A等位基因在辽宁汉族Rh阴性人群和随机人群中的频率分析

目的研究调查辽宁地区汉族RHD^(*)1227A等位基因在Rh阴性人群和随机人群中的频率。方法采用吸收放散实验筛查Del表型,RHD基因特异聚合酶链反应-序列特异性(PCR-SSP)筛查RHD^(*)1227A等位基因,RHD全编码区的核苷酸序列分析方法确认RHD^(*)1227A等位基因,杂交合子技术检测RHD基因的杂合性。结果在117例Rh阴性献血者中,吸收放散试验检测到24例Del表型,PCR-SSP方法和RHD全编码区测序共检测到23例RHD^(*)1227A等位基因携带者;23例RHD^(*)1227A等位基因携带者通过基因测序19例基因型RHD^(*)1227A/RHD^(*)01N.01,另外4例基因型是RHD^(*)1227A/RHD^(*)1227A纯合。在1 045例随机献血者中检测到11例RHD^(*)1227A等位基因携带者,9例基因型是RHD^(*)1227A/RHD^(*)01,2例基因型是RHD^(*)1227A/RHD^(*)01N.01。结论辽宁地区RHD^(*)1227A等位基因在Rh阴性人群中的频率为0.115 4,在随机人群中的频率为0.005 3。

西安地区RhD阴性个体RHD 711D^(el) C等位基因频率研究

目的研究西安地区RHD基因711Del C等位基因分布状况。方法应用PCR方法检测RhD阴性个体,对特殊标本进行测序分析。结果在1 492名RhD阴性个体中,检出RHD 711Del C等位基因8例(占0.54%),且均为E抗原阳性。结论获得了西安地区RHD 711Del C基因分布的初步状况,RHD基因711Del C的突变可能与E抗原有相关性。

RhD放散型相关的等位基因的鉴定

目的 :为了探讨D放散型 (Del)表型的分子基础。方法 :采用序列分析方法分析 2 6名Del表型个体RHD基因全长编码区和一名个体的RHD基因第 7内含子部分序列 ;同时使用血清学方法检测全部个体的RhCcEe表型。结果 :全部样品的第 9外显子均存在RHD 12 2 7G >A碱基突变 ,其余序列则与正常RHD基因一致 ,一名个体的第 7内含子观察到一处碱基突变RHDIVS7+15 2c >a ;血清学结果显示所有Del表型个体均为RhC抗原阳性个体。结论 :由于 12 2 7A位于RHD基因第 9外显子与第 9内含子交界处 ,可能影响前RNA转录后mRNA的正常拼接 ,形成Del表型。

发现1个新的无效RHD等位基因

目的鉴定1个疑似新的无效RHD等位基因。方法采用常规血清学方法检测1名孕妇的Rh血型抗原,间接抗球蛋白试验确认RhD抗原阴性,并用吸收放散试验排除D放散型(Del);先后分别采用商品化试剂盒、序列特异性引物PCR(SSP-PCR)技术以及DNA序列分析技术,分析该名个体的RHD基因。结果血清学试验为Rh-dCcEe,吸收放散试验阴性;基因型检测为杂合型RHD+/RHD-;商品化试剂盒和SSP-PCR结果都显示该个体携带的RHD阳性基因与正常Rh阳性表型的基因一致。对该标本编码区全长序列分析结果显示:第1外显子的第78位核苷酸缺失1个碱基"C",至第112位氨基酸时形成终止密码子。结论经GenBank检索发现该例为1个新的无效RHD等位基因,并完成注册RHD78delC(GenBank GQ477180)。

发现RhD阴性无效等位基因1例

目的鉴定1例疑似新的RHD无效等位基因引起的RhD阴性个体的分子背景。方法采用血清学吸收放散试验以及序列特异性引物PCR(PCR-SSP)法检测RhD阴性样本,对1例真实D阴性且存在RHD基因全长编码序列的个体,通过基因测序法进行分析鉴定。结果该例样本血清学表型为RhCcdee,其RHD基因第615-616位存在CA两个碱基缺失(RHD615-616delCA),由于框移突变造成第316位氨基酸时形成终止密码子。该基因序列已提交至Genbank,登录号为GQ289585。结论使用基因序列分析法鉴定出1例新的RHD无效等位基因。

RHD711delC等位基因检测和频率计算

目的了解RHD711delC等位基因或RHD710delC在一般人群中的基因频率。方法对890 403名汉族无偿献血者,采用盐水法和间接抗人球蛋白试验（IAT）测定D抗原,PCR-SSP检测RHD711delC等位基因以及RHD合子型,应用遗传统计方法分析基因频率。结果 Rh（D）表型检测显示2 385人为Rh阴性,108人为D抗原弱阳性表型（包括弱D型和部分D型）,其余887 910人为Rh阳性。2 385名Rh阴性个体中检测到19人携带RHD711delC等位基因（0.80%）,均为RHD711delC/d杂合子；108名D抗原弱阳性个体中,未检出RHD711delC携带者；随机抽检960名Rh阳性样本,发现1人为RHD711delC/RHD＋。根据上述结果,计算RHD711delC在被检人群中的基因频率为0.000 530；根据RHD711delC在Rh阴性人群的检出率,推算其在一般人群中的基因频率为0.000 225。结论 RHD711delC等位基因在中国汉族人群中的等位基因频率在0.000 225～0.000 530之间。

用于研究RHD等位基因的有核红细胞体外表达系统的建立

目的建立用于研究RHD等位基因的有核红细胞体外表达系统。方法从Rh阴性献血者的外周血中分离单个核细胞,并从中进一步分离、培养有核红细胞,同时使用含有野生型RHD等位基因和绿色荧光蛋白的慢病毒表达质粒和包装质粒共转染HEK 293细胞包装慢病毒,收获包装病毒颗粒后感染体外培养的Rh D阴性有核红细胞,诱导有核红细胞分化,最后使用针对9种不同D抗原表位的15种单克隆抗体对红细胞Rh D抗原表位进行流式分析。结果用携带野生型RHD基因的慢病毒感染体外培养的Rh D阴性有核红细胞,成功表达了抗原表位完整的D抗原,Rh D阴性有核红细胞的感染效率为51. 7%。结论成功建立了用于研究RHD等位基因的有核红细胞体外表达系统,可进一步应用于弱D、部分D和D放散型相关的RHD突变型等位基因的体外表达研究。

黑龙江省汉族RhD阴性献血者RHD 711DelC等位基因频率调查

目的研究黑龙江省汉族RHD阴性献血者中RHD 711DelC等位基因分布频率。方法应用血清学及分子生物学方法,对经间接抗球蛋白试验确认为RhD阴性的献血者374例,进行红细胞RHD血型基因分型和RH基因变异体检测,并对无法确定RHD基因型别的特殊标本进行测序分析。结果374例阴性献血者共检出RHD 711DelC等位基因者11例(占2.94%),ccdEe型5例、CcdEe型5例、ccdee型1例。结论初步获得了黑龙江省汉族RHD阴性献血者中RHD 711DelC等位基因频率分布状况,RHD 711DelC等位基因的突变可能与E抗原有相关。

RHD等位基因37bp和RHC等位基因109bp插入序列检测

目的研究RHD等位基因37bp插入序列和RHC等位基因109bp插入序列是否存在多态性。方法应用PCR—SSP技术检测82例汉族RhD阳性样本，206例汉族和70例维族RhD阴性样本RHD等位基因37bp插入序列和RHC等位基因109bp插入序列。结果上述样本均检测不到RHD基因37bp插入序列，即无RHDψ假基因。82例汉族RhD阳性样本中有76例样本有RhC抗原，其中3例（3．95％）检测不到109bp插入片段；206例RhD阴性汉族样本中有75例样本有RhC抗原，其中4例（5-33％）检测不到109bp插入片段；70例RhD阴性维族样本中，无RhCC表型，3例RhCc样本均检测到109bp插入片段；其余204例Rhcc表型样本均未检测到109bp插入序列。结论中国人RHC等位基因109bp插入序列存在多态性，尚不能肯定中国人是否不存存RHDψ假基因。

汉族和维吾尔族D_(el)型基因型及其常见等位基因差异的研究

目的比较中国汉族和维吾尔族(维族)人群D_(el)型基因结构和遗传特点,了解二者D_(el)型常见突变类型及其基因组合情况。方法采用微柱凝胶法检测随机非血缘关系的中国222名汉族人和55名维族人的Rh D血型,Rh D(-)者用改良间接抗球蛋白试验(IAT)确认;单克隆抗体鉴定Rh表型;吸收放散微柱凝胶法检测D_(el)型;PCRSSP方法检测RHD上游、下游和杂合Rhesus盒;PCR扩增RHD第9外显子,测序验证;PCR-SSP检测RHD基因1227位点,测序验证。结果 222例随机非血缘关系汉族血清学Rh D(-)标本和55例随机非血缘关系维族血清学Rh D(-)标本分别检出43例和1例D_(el)型;汉族Rh D(-)标本中,RHD基因型为RHD-/RHD-和RHD+/RHD-、RHD+/RHD+者的比例分别为70.72%(157/222)和27.03%(60/222)、2.25%(5/222);维族Rh D(-)标本中,只有1例RHD基因型为RHD+/RHD+,其余98.18%(1/54)标本为RHD-/RHD-;汉族和维族Rh D(-)个体RHD基因型总体分布存在差异(P<0.05);汉族和维族Rh D(-)个体的RHD-/RHD-基因型呈明显差异(P<0.05);43例随机非血缘关系的汉族D_(el)型标本RHD基因1227位点检测:1例1227G、3例1227G/A和39例1227A,结合Rhesus box检测结果,基因组合情况分别为RHD1227G/-、RHD1227G/A、RHD1227A/-和RHD1227A/A。1例维族D_(el)型标本等位基因组合为RHD1227A/A。所有RHD-/RHD-纯合子样本均未检测到RHD基因1227位点。吸收放散试验为D_(el)型者93.02%(40/43)、等位基因为RHD1227A或A/G个体均携带C抗原。结论中国汉族和维族D_(el)型人群RHD基因型绝大部分是RHD+/RHD-杂合子,都存在RHD;中国汉族和维族D_(el)型等位基因以RHD1227A为主,且与C抗原相关联。

黑龙江省汉族RhD阴性献血者RHD 711D^(el)C等位基因频率调查

目的研究黑龙江省汉族RHD阴性献血者中RHD711DelC等位基因分布频率。方法应用血清学及分子生物学方法,对间接抗人球蛋白试验确认为RhD阴性的献血者374例,进行红细胞RhD血型基因分型和RH基因变异体检测,并对无法确定RHD基因型别的样本进行测序分析。结果 374例阴性献血者共检出RHD711DelC等位基因11例(占2.94%),ccdEe型5例、CcdEe型5例、ccdee型1例。结论黑龙江省汉族RHD阴性献血者中RHD711DelC等位基因频率约为2.94%,RHD711DelC等位基因的突变可能与E抗原有相关。

熔解曲线分析法用于RHD 1227G>A基因分型的实验研究

目的建立用于RHD 1227G〉A基因分型的熔解曲线分析法。方法设计合成RHD 1227G〉A等位基因特异性引物和公共引物,并在2条等位基因特异性引物5＇端加上不同长度的GC序列。在实时PCR反应后,进行熔解曲线分析,依据PCR产物熔解温度的差异,对RHD 1227G〉A基因分型。将建立的熔解曲线分析法与常规的PCRSSP法比较。对于2种方法检测结果不符的标本,进行RHD基因第9外显子测序,确定该标本为RHD 1227G〉A基因型。结果应用熔解曲线分析法对84例标本进行基因分型,其中RHD 1227A＋/G-32例,1227A-/G＋22例,1227A＋/G＋6例,1227A-/G-24例。发现2例标本熔解曲线法检测的基因型为1227A＋/G-,而PCR-SSP法检测结果为1227A＋/G＋。经基因测序证实这2例标本结果是1227A＋/G-。结论用于RHD 1227G〉A基因分型的熔解曲线法具有操作简单、快速、准确等优点,优于常规的PCR-SSP法。

RHD845A/1227A基因型个体家系调查分析

本研究对1例RHD845A/1227A基因型个体进行家系调查分析,并分析他们的遗传特性。通过盐水法和间接抗人球蛋白试验(IAT)检测RH(D)抗原,PCR-SSP法检测RHD1227A和RHD845A等位基因以及RHD合子型,基因测序方式分析RHD基因编码区序列。研究结果表明:血清学检测发现1例RH(D)抗原盐水法检测阴性、IAT法检测阳性样本,经RHD基因编码序列分析发现,RHD第845位与第1227位均出现G/A碱基杂合现象,推测该个体基因型可能为RHD845A/1227A。家系调查显示,先证者父亲为RHD阴性,母亲为RHD阳性。PCR-SSP检测结果显示,父亲携带RHD1227A等位基因,基因型为RHD1227A/RHD-;母亲携带RHD845A等位基因,基因型为RHD845A/RHD+,证明先证者分别从父亲和母亲遗传RHD1227A和RHD845A等位基因,基因型为RHD845A/1227A。结论:经过家系调查分析发现了1例罕见的RHD845A/1227A基因型个体。根据家系调查证明,RHD845A和RHD1227A等位基因分别由遗传获得,而非由个体基因变异形成。

采用熔解曲线法进行RHD c.1227G>A基因检测研究

目的:建立用于RHD c.1227G>A基因检测的熔解曲线分析方法。方法:根据RHD c.1227G>A基因位点设计并合成序列特异性引物,在荧光定量PCR反应后对产物进行熔解曲线分析,根据熔解曲线峰值的差异进行基因检测结果判断,并与常规序列特异性引物PCR(PCR-sequence specific primer,PCR-SSP)RHD c.1227G>A基因分型方法进行比较;对与血清学结果不一致的标本进行测序分析。结果:在87例血清学初筛为RhD阴性表型的标本中,采用熔解曲线分析法,检测出16例含有RHD c.1227G>A,占比18.4%;与常规PCR-SSP分型结果一致。对1例与血清学吸收放散结果不一致的标本进行RHD exon 9测序分析,证实均为1227A纯合子。熔解曲线分析法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和总符合率均为100%,约登指数为1.0。结论:成功建立用于红细胞RHD c.1227G>A基因分型的熔解曲线分析方法,可以高效、快速地进行RHD c.1227G>A基因检测研究。

弱D15型等位基因检测和频率分析

目的以往较多文献报道弱D15型等位基因RHD845A的检测方法和检出率,但少有报道该等位基因在整体人群中的基因频率。方法 890 403例汉族无偿献血者,通过盐水法和间接抗人球蛋白试验(IAT)测定D抗原;PCR-SSP检测RHD845A等位基因和RHD845G,以及RHD合子型;遗传统计方法分析基因频率。结果 Rh(D)表型检测显示,2 385例为Rh阴性;108例为D抗原弱阳性表型(包括弱D型和部分D型);其余887 910例为Rh阳性。检测960例Rh阴性DNA样本,未发现RHD845A携带者;108例D抗原弱阳性中,检出64例携带RHD845A等位基因(59.3%),合子型测定62例为RHD+/RHD-杂合型;2例为RHD+/RHD+纯合子。为确认纯合子个体是否为RHD845A纯合子,进一步检测RHD845G,结果均为阳性,显示2例为RHD845A/RHD+基因型,而非RHD845A纯合子。同时,抽检960例Rh阳性样本,结果检出1例为RHD845A/RHD+基因型。根据上述结果,计算受检者RHD845A等位基因频率为0.000555。结论汉族D抗原弱阳性表型中,>50%为弱D15型。由于样本量较大,可以认为弱D15型RHD845A等位基因在我国汉族整体人群中的等位基因频率约为0.000555。

等位基因特异性PCR技术在DEL表型基因分型中的应用

目的:建立DEL表型的基因分型方法,用于快速鉴定DEL表型。方法:用RHBox基因分型方法鉴定标本的基因型,用血清学方法确定标本的DEL表型。根据RHD1227A等位基因序列设计等位基因特异性-聚合酶链反应(allele specific-polymerase chain reaction,AS-PCR),用于DEL表型基因分型,结果同血清学的方法作比较,探讨临床应用的可行性。结果:28例RHBox基因分型为RHD-/RHD-的标本,血清学方法、基因分型方法DEL表型鉴定结果均为阴性;在25例RHBox基因分型为RHD+/RHD-或RHD+/RHD+的标本中,用血清学方法检出的11例DEL表型标本,基因分型方法均扩增到867 bp的1227A等位基因条带;1例血清学方法阴性,而基因分型方法检测为阳性,后经测序分析证实RHD1227A为阳性,分析此例标本可能为血清学方法漏检。这说明在鉴定DEL表型的方法中基因分型方法比血清学有更高的灵敏度。结论:AS-PCR方法可用于临床筛选Rh阴性人群中的DEL表型。