癫痫大鼠脑内Rho激酶2表达变化分析

目的对癫痫大鼠脑内Rho激酶2表达变化进行分析和探讨。方法运用随机抽样的方法选择体重在180~220 g的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,随机将其分为观察组和对照组两组,其中对照组10只,观察组50只,实验组根据不同的取材时间分为6 h、1 d、3 d、5 d、7 d五个亚组,每个亚组10只,并对其采用腹腔注射法注射氯化锂进行癫痫模型制作,造模成功后分别在6 h、1 d、3 d、5 d、7 d进行断头取脑,对照组给予相同剂量生理盐水腹腔注射,观察两组大鼠脑内Rho激酶2表达变化情况。结果与对照组相比,观察组大鼠海马组织中Rho激酶2的表达水平在6 h组开始升高,在3 d组达到高峰,5 d组和7 d组表现为下降,其中3 d组和5 d组与对照组的相对光密度值相比差异具有显著性（P〈0.05）;与对照组相比,观察组大鼠颞叶脑组织中Rho激酶2表达水平在癫痫发作3 d组和5 d组明显升高,7 d组有开始下降,3 d、5 d和7 d组与对照组的相对光密度值相比差异具有显著性（P〈0.05）。结论正常大鼠与与癫痫大鼠在脑内颞叶区和海马区都有Rho激酶2的表达,在癫痫大鼠中的Rho激酶2表达水平从癫痫发作后6 h组开始,经历先升高再降低的变化过程。

法舒地尔对大鼠脊髓损伤Rho/ROCK2激酶及铁死亡的影响

目的研究法舒地尔(fasudil hydrochloride,Fasudil)对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)Rho亚家族蛋白A/相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(Rho/ROCK2)及铁死亡的影响。方法前瞻性研究将12周龄SD成年雄性大鼠36只(225.2~245.5g)按随机数字表法分为三组:Sham组(假手术),SCI组(脊髓损伤),Fasudil组[SCI+法舒地尔10mg/(kg·d)腹腔注射(Rho/ROCK2激酶抑制剂)],各12只。脊髓撞击法制备成年大鼠SCI模型,通过Basso-Beattie-Bresnahan locomotor scale(BBB)评分检测大鼠的运动功能,试剂盒检测脊髓组织中Fe^(2+)及反应性活性氧(ROS)含量,免疫印迹法检测脊髓组织中Rho/ROCK2及铁死亡相关蛋白xCT、GPX4的表达水平。结果与Sham组比较,SCI后大鼠BBB评分显著降低(P<0.05),Fe^(2+)含量(176.7%±31.5%vs.84.2%±11.2%)及ROS含量(162.2%±28.0%vs.95.8%±12.0%)显著增加(P<0.001),SCI后大鼠脊髓组织Rho/ROCK2(0.85±0.13)vs.(0.28±0.039)表达增多,xCT(0.39±0.041)vs.(0.92±0.092)及GPX4(0.36±0.049)vs.(0.84±0.21)表达水平明显减少(P均<0.001);对比SCI组,Fasudil组大鼠BBB评分增多(P<0.05),Fe 2+(127.8±33.1)%及ROS(123.8±27.6)%含量减少(P<0.05),脊髓组织Rho/ROCK2(0.65±0.17)表达减少,xCT(0.64±0.03)及GPX4(0.55±0.11)表达水平增多(P均<0.05)。结论法舒地尔减少了SCI大鼠脊髓组织中RHO/ROCK2激酶,抑制了脊髓组织中的铁死亡,进而改善SCI大鼠的运动功能。

Rho激酶2在急性期癫痫大鼠脑内表达变化的研究

目的观察Rho激酶2(ROCK2)在癫痫大鼠脑内的表达情况及其抑制剂法舒地尔对癫痫大鼠脑电图的影响。方法 75只SD大鼠随机分入正常对照组、6h组、1d组、3d组、5d组、7d组、空白组、癫痫组和法舒地尔组。腹腔注射氯化锂-匹鲁卡品建立癫痫模型。通过免疫组织化学和Western blot方法,比较各组大鼠颞叶、海马区ROCK2表达的差异;对空白组、癫痫组及法舒地尔组大鼠进行脑电监测,分析脑电图变化。结果在海马组织中,3d组、5d组ROCK2的表达水平较对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);在颞叶脑组织中,3d组、5d组、7d组ROCK2的表达水平较对照组均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光结果显示正常组大鼠与实验组大鼠的海马组织中ROCK2(绿色)与NeuN(红色)在神经元中共表达;颞叶脑组织中ROCK2(绿色)与GFAP(红色)在星形胶质细胞中共表达。脑电监测结果显示空白组大鼠脑电正常。癫痫组大鼠在给予匹鲁卡品约28min后出现痫样放电波形。与癫痫组大鼠相比,法舒地尔组大鼠出现痫样波形的潜伏时间明显延长,频率明显降慢、幅度明显降低(P<0.05))。结论癫痫发作将上调大鼠颞叶和海马区ROCK2的表达,ROCK2抑制剂法舒地尔具有一定的抗癫痫作用。

血清Rho激酶2与脑梗死后神经功能的关系

目的研究脑梗死后血清Rho激酶2（ROCK2）的浓度与神经功能之间的关系。方法选取2010年7月-2012年7月住院的存在肢体瘫痪的脑梗死患者60例,在发病的第1、3、7、14天分别进行神经功能缺损评分,并在相同时间采血样检测血清ROCK2浓度,分析二者之间的关系。结果在发病的第1、3、7、14天,患者血清ROCK2浓度与神经功能缺损评分无明显相关性（r=-0.037、-0.056、-0.056、-0.113,P〉0.05）。从脑梗死第1~14天整个病程来看,血清ROCK2浓度与神经功能缺损评分也无明显相关性（r=0.006,P〉0.05）。结论在脑梗死发病最初的2周内,血清ROCK2浓度与神经功能缺损评分均无明显相关性。

2种Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶对经皮冠状动脉介入治疗无复流的预测价值

目的探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(ROCK)1和ROCK2对急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者经皮冠状动脉介入治疗(PCI)无复流的预测价值。方法选取168例接受PCI的STEMI患者作为研究对象,根据是否发生无复流分为无复流组和血流正常组,并分别根据ROCK1、ROCK2表达情况分为高表达组和低表达组。使用酶联免疫吸附试剂盒检测患者血清ROCK1、ROCK2水平,分析无复流组与血流正常组的血清ROCK1、ROCK2水平差异,分析STEMI患者PCI无复流的危险因素,并分析ROCK1、ROCK2对STEMI患者PCI无复流的预测价值。结果168例STEMI患者中,46例发生无复流,发生率为27.38%。无复流组的Killip分级、发病至入院时间、未使用预防性无复流药物者占比、血清ROCK1水平、血清ROCK2水平高于或长于血流正常组,差异有统计学意义(P<0.05)。ROCK1高表达组的无复流发生率高于ROCK1低表达组,ROCK2高表达组的无复流发生率高于ROCK2低表达组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素Logsitic回归分析显示,Killip分级为Ⅲ~Ⅳ级、发病至入院时间较长、未使用预防性无复流药物、血清ROCK1水平较高、血清ROCK2水平较高均为STEMI患者PCI无复流的独立危险因素(P<0.05)。受试者工作特征曲线显示,ROCK1、ROCK2对STEMI患者PCI无复流的预测价值较高,且两者联用后预测价值提升,曲线下面积为0.789(95%CI:0.711~0.867)。结论血清ROCK1、ROCK2水平较高是STEMI患者PCI无复流的危险因素,两者联合检测对PCI无复流具有较高的预测价值。

Rho激酶抑制剂法舒地尔作用BTBD7-ROCK2信号通路抑制肝细胞癌侵袭运动

目的:观察Rho激酶抑制剂法舒地尔(Fasudil)对人高侵袭潜能HCC细胞株3(human high metastatic liver cancer cells 3,HCCLM3)侵袭转移的影响,并且探讨其作用的机制。方法:应用100 mol/L Fasudil作用于HCCLM3细胞,采用肌动蛋白微丝荧光染色和侵袭小室实验观察HCCLM3细胞的运动侵袭能力。HCCLM3细胞经过处理后分为阴性对照组、Fasudil作用组、BTBD7干扰组,通过Western印迹检测BTB/POZ结构域蛋白7(BR-C,ttk and bab/pox virus domain containing 7,BTBD7)、Ras同系物家族成员C(ras homolog family member C,Rho C)、Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶2(Rhoassociated,coiled-coil containing protein kinase 2,ROCK2)、MMP2和MMP9蛋白表达水平,酶谱分析法检测MMP2和MMP9活性水平。BTBD7干扰组作为阳性对照。结果:Fasudil处理后HCCLM3侵袭运动能力下降,BTBD7,Rho C,ROCK2蛋白表达下调,MMP2和MMP9活性降低,与阴性对照组比较差异有统计学意义(均P<0.01)。结论:Fasudil具有干预BTBD7-ROCK2信号通路、抑制HCC侵袭转移的重要作用。

腺病毒介导的RNAi对VaD大鼠脑内NgR/RhoA/ROCK2信号通路的影响

目的探讨基于腺相关病毒为载体构建的Nogo受体(NgR)抑制剂通过NgR/Ras基因家族成员(Rho)A/Rho相关激酶(ROCK)2信号通路改善血管性痴呆(VaD)大鼠学习记忆能力及轴突再生分子机制。方法将40只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、NgR干扰剂组(腺相关病毒)、阴性对照组(NgR空载体病毒),每组10只。采用双侧颈总动脉永久结扎术法制作VaD大鼠模型,模型成功后,将AAV9-NgR-shRNA通过脑立体定位术注射至大鼠海马组织,阴性对照组注入等量空载体腺相关病毒。4 w后,采用Morris水迷宫测定学习、记忆能力,采用实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)、Western印迹检测各组NgR/RhoA/ROCK2通路NgR、RhoA、ROCK2 mRNA及蛋白表达水平,电镜观察大鼠海马突触超微结构变化。结果术后1 w,模型组、阴性对照组潜伏期时间与跨越平台次数与NgR干扰组比较,差异无统计学意义(P>0.05),与假手术组比较有显著性差异(均P<0.05)。术后4 w,与模型组及阴性对照组比较,NgR干扰组潜伏期显著缩短,跨越平台次数显著增加,海马中NgR、RhoA、ROCK2 mRNA及其蛋白表达显著减少(均P<0.05),且海马组织内突触前后囊泡正常、细胞器更加完整;阴性对照组上述指标与模型组比较差异无统计学意义(均P>0.05)。结论NgR抑制剂可能通过抑制NgR/RhoA/ROCK2信号通路起到促进神经轴突再生,改善海马突触结构,减轻VaD大鼠认知功能障碍的作用。

ROCK2和KLF6在急性缺血性脑卒中的表达变化及其与病情程度和预后的相关性

目的探究Rho相关蛋白激酶2(ROCK2)和Krüppel样因子6(KLF6)在急性缺血性脑卒中(AIS)患者血清表达变化及其与病情程度和预后的相关性。方法选取2021年1月至2023年3月在我院确诊的117例AIS患者作为研究组,另选120例在我院同期体检健康者作为对照组。根据美国国立卫生院神经功能缺损(NIHSS)评分,将患者分为轻度(46例)、中度(40例)、重度(31例)组。根据改良Rankin量表将患者分为预后良好(74例)和预后不良(43例)组。酶联免疫吸附试验测定血清ROCK2和KLF6水平。Spearman分析ROCK2和KLF6水平与NIHSS评分的关系;多因素Logistic回归分析AIS患者预后不良的危险因素;受试者工作特征(ROC)曲线分析血清ROCK2和KLF6水平对AIS患者预后不良的预测价值。结果与对照组相比,研究组ROCK2和KLF6水平显著增加(P<0.05)。与轻度组相比,中度组和重度组ROCK2和KLF6水平及NIHSS评分显著增加(P<0.05),与中度组相比,重度组ROCK2和KLF6水平及NIHSS评分显著增加(P<0.05)。相关性分析结果显示,ROCK2和KLF6水平与NIHSS评分均呈正相关(r=0.605,0.632,P<0.001)。与预后良好组相比,预后不良组患者ROCK2和KLF6水平显著增加(P<0.05)。ROCK2、KLF6单独及联合预测AIS患者预后不良的曲线下面积(AUC)分别为0.886(95%CI 0.822~0.949)、0.850(95%CI 0.770~0.930)、0.954(95%CI 0.919~0.988)。预后良好组与预后不良组患者总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平及NIHSS评分比较差异具有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示TG水平、NIHSS评分、ROCK2和KLF6是AIS患者预后不良的独立危险因素(P<0.05)。结论AIS患者ROCK2和KLF6表达上调,其水平与病情程度及预后不良密切相关。

芍药苷调控RhoA/ROCK2通路对阿尔茨海默病大鼠认知功能障碍的影响

目的探索芍药苷调控Ras同源基因家族成员(Rho)A/Rho相关的卷曲螺旋激酶(ROCK)2通路对阿尔茨海默病(AD)大鼠认知功能障碍的影响。方法取SD大鼠随机分为假手术组、模型组、芍药苷(20 mg/kg)组、Rhosin(RhoA抑制剂,40 mg/kg)组、芍药苷(20 mg/kg)+Rhosin(40 mg/kg)组,除假手术组外,向其余各组大鼠海马CA1区注入β-淀粉样蛋白(Aβ)_(1~42)多肽诱导建立AD模型,以药物分组干预后,通过Morris水迷宫实验测定各组大鼠逃避潜伏期,以评测其认知功能;通过苏木素-伊红(HE)染色检测各组大鼠海马组织病理形态变化;通过试剂盒检测海马组织超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量及血清致炎因子白细胞介素(IL)-6和干扰素(IFN)_(-γ)含量;通过Western印迹实验检测各组海马组织RhoA/ROCK2通路蛋白RhoA、ROCK2的表达水平。结果与假手术组相比,模型组神经元细胞结构萎缩,变性死亡,排列紊乱疏松,数目明显减少,海马组织呈现明显损伤,海马组织SOD含量显著降低(P<0.05),逃避潜伏期、海马组织ROS及MDA含量、血清IL-6和IFN_(-γ)含量、海马组织RhoA及ROCK2蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与模型组相比,药物干预组海马组织病理损伤均减轻,海马组织SOD含量均显著升高(P<0.05),逃避潜伏期、海马组织ROS及MDA含量、血清IL-6和IFN_(-γ)含量、海马组织RhoA及ROCK2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05);与芍药苷组、Rhosin组分别相比,芍药苷+Rhosin组大鼠海马组织病理损伤均减轻,海马组织SOD含量均显著升高(P<0.05),逃避潜伏期、海马组织ROS及MDA含量、血清IL-6和IFN_(-γ)含量、海马组织RhoA及ROCK2蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论芍药苷可能通过抑制RhoA/ROCK2通路激活,减弱AD大鼠氧化应激与炎症反应,缓解其海马组织病理损伤,提高大鼠学习记忆能力,改善其认知功能障碍。

经尿道膀胱肿瘤整块剜除术治疗非肌层浸润性膀胱癌疗效及对血清金属蛋白酶-9、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2、环氧合酶-2水平的影响

目的探讨经尿道膀胱肿瘤整块剜除术(ERBT)治疗非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)疗效及对血清金属蛋白酶-9(MMP-9)、Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(Rock-2)、环氧合酶-2(Cox-2)水平的影响。方法我院诊治的150例NMIBC患者,按照随机数表法分为研究组与对照组各75例,分别给予ERBT和经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)。比较两组围术期相关指标、手术前后血清MMP-9、Rock-2、Cox-2水平、术后并发症以及预后情况。结果研究组手术时间、膀胱冲洗时间、首次下地时间等围术期指标低于对照组(P<0.05);术前1 d及术后3 d两组间血清MMP-9、Rock-2、Cox-2水平比较,差异无统计学意义(P>0.05),术后3 d两组上述指标水平均降低(P<0.05);研究组术后并发症发生率及术后1年复发率均低于对照组(P<0.05)。结论ERBT可降低血清MMP-9、Rock-2、Cox-2水平,其治疗NMIBC的效果与TURBT相当,但该术式减少术后并发症,促进患者恢复,并降低术后复发风险,更具有优势。

特发性膜性肾病患者血清ROCK2、renalase水平及其诊断价值

目的探讨Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶2(ROCK2)、肾胺酶(renalase)在特发性膜性肾病(IMN)患者血清中的表达变化及其对IMN的诊断价值。方法选取2019年1月—2020年11月河北以岭医院肾病科收治IMN患者120例为IMN组,另选取同期医院进行健康体检的志愿者120例为健康对照组。酶联免疫吸附法(ELISA)检测受试者血清ROCK2、renalase水平,Pearson法分析ROCK2、renalase水平与部分临床指标的相关性;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清ROCK2、renalase及二者联合诊断IMN的价值。结果IMN组ROCK2、renalase水平均显著高于健康对照组(t/P=12.837/<0.001、11.066/<0.001)。Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期IMN患者血清ROCK2逐次升高(F/P=77.154/<0.001),而Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期血清renalase水平逐次升高,但Ⅳ期血清renalase水平低于Ⅲ期(F/P=163.042/<0.001)。Alb与血清ROCK2、renalase水平呈负相关(r/P=-0.302/0.009、-0.402/<0.001),PLA2R抗体、BUN、SCr、24 h尿蛋白与血清ROCK2、renalase水平均呈正相关(r/P=0.336/<0.001、0.264/0.011、0.315/0.007、0.320/<0.001,0.359/<0.001、0.284/0.010、0.420/<0.001、0.412/<0.001);ROC曲线显示:血清ROCK2、renalase及二者联合诊断IMN的AUC分别为0.908、0.907、0.965,二者联合优于各自单独预测效能(Z=3.597,3.755,P均<0.001)。结论ROCK2与renalase在IMN患者血清中均高表达,二者联合诊断IMN的价值较高。

ROCK2在ARC中的表达及对晶状体上皮细胞的自噬及氧化损伤的影响

目的探讨Rho激酶2(ROCK2)在年龄相关性白内障(ARC)晶状体前囊膜中的表达及其对H_(2)O_(2)诱导的人晶状体上皮细胞自噬及氧化损伤的影响。方法收集2020年6月~2021年4月在我院行超声乳化白内障吸出术的ARC患者20例,获取晶状体前囊膜,并获取眼科标本库中无眼科疾病、眼球结构完整且晶状体透明的正常晶状体前囊膜。免疫组织化学染色和Western blot检测ROCK2蛋白表达;将人晶状体上皮细胞HLE-B3随机分为对照组、H_(2)O_(2)组、sh-NC+H_(2)O_(2)组和sh-ROCK2+H_(2)O_(2)组,转染sh-NC或sh-ROCK2至对应组细胞,并用H_(2)O_(2)处理细胞,实时荧光定量PCR和Western blot检测细胞转染效率,MTT法检测各处理组细胞增殖活性,透射电镜观察细胞内自噬现象,自噬双标腺病毒mRFP-GFP-LC3转染细胞后观察自噬溶酶体和自噬体水平,Western blot检测细胞中自噬相关蛋白表达情况,DCFH-DA法检测活性氧(ROS)水平,试剂盒测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性及丙二醛(MDA)含量。结果与正常组织比较,ARC中ROCK2表达增高(P<0.05);转染sh-ROCK2后成功下调了HLE-B3细胞中ROCK2表达水平(P<0.05);与对照组比较,H_(2)O_(2)处理细胞后,细胞增殖活性显著下降,自噬体明显增多,明显激活了自噬溶酶体和自噬体水平,Beclin-1蛋白相对表达量显著升高,LC3-II/LC3-Ⅰ比值显著上调,ROS水平显著上升,SOD和GSH-Px的活性均显著降低,MDA含量则显著升高(均P<0.05);与H_(2)O_(2)组比较,细胞转染sh-ROCK2后再用H_(2)O_(2)处理,细胞增殖活性显著提高,自噬体减少,自噬溶酶体和自噬体水平受到抑制,Beclin-1蛋白相对表达量显著降低,LC3-II/LC3-Ⅰ比值显著下调(均P<0.05),同时,细胞内ROS水平显著下降,SOD和GSH-Px的活性均显著升高,MDA含量显著降低(均P<0.05)。结论ROCK2在ARC晶状体前囊膜内高表达,下调其表达能够抑制H_(2)O_(2)诱导的人晶状体上皮细胞过度自噬,减少氧化损伤。

敲低ROCK2基因通过促进线粒体融合并抑制其分裂改善AD小鼠认知功能及减轻神经细胞凋亡

目的 探讨敲低Rho相关螺旋卷曲激酶2(ROCK2)基因对淀粉样前体蛋白/早老素1(APP/PS1)双转基因小鼠认知功能的影响及其机制。方法 APP/PS1双转基因小鼠随机分为AD模型组(AD组)、 ROCK2基因敲低组(shROCK2组)、 ROCK2基因敲低对照组(shNC组),同龄野生型C57BL/6小鼠作为野生型对照(WT组)。Morris水迷宫和Y迷宫实验测试小鼠认知功能,尼氏染色检测神经元形态,免疫荧光组织化学染色检测磷酸化动力蛋白相关蛋白1(p-Drp1)和线粒体融合蛋白1(Mfn1)的表达,Western blot法检测海马组织ROCK2、裂解型胱天蛋白酶3(c-caspase-3)、 B细胞淋巴瘤因子2(Bcl2)、 Bcl2相关蛋白X(BAX)、 p-Drp1、线粒体分裂蛋白1(Fis1)、视神经萎缩因子1(OPA1)、 Mfn1和Mfn2的蛋白表达。结果 与AD组小鼠相比,shROCK2组小鼠ROCK2表达明显减少;其认知功能明显改善,海马CA3和DG区神经元数量增加,尼氏体染色深;c-caspase-3和BAX表达降低,同时Bcl2表达升高;线粒体分裂相关蛋白p-Drp1和Fis1的表达减少,而线粒体融合相关蛋白OPA1、 Mfn1和Mfn2的表达增加。结论 敲低ROCK2可以显著改善APP/PS1小鼠的认知功能,并抑制神经细胞凋亡,其机制可能与促进线粒体融合并抑制其分裂有关。

ROCK2-shRNA转染对VaD大鼠海马神经元的保护作用

目的探讨不同滴度ROCK2-shRNA腺相关病毒(AAV9-ROCK2-shRNA)转染对血管性痴呆(VaD)大鼠海马神经元的保护作用。方法选取成年SPF级健康雄性SD大鼠40只,随机分为正常组、PBS对照组、低滴度组、中滴度组、高滴度组(n=8)。采用双侧颈总动脉永久性结扎法制备VaD模型,将AAV9-ROCK2-shRNA按原液(高滴度)、2倍(中滴度)、10倍(低滴度)稀释后,采用脑立体定位术注射至大鼠海马组织周围。于1周及4周后,进行Morris水迷宫测试大鼠学习和记忆能力变化,并于第4周行为学观察后取材,采用HE与尼氏染色观察神经元形态、分布及数量变化,免疫组化检测IL-1β阳性细胞数,荧光显微镜检测绿色荧光蛋白(GFP)的转染情况。结果与正常组比较,PBS对照组术后1周与4周逃避潜伏期延长、跨越平台次数显著减少,神经元损伤明显,尼氏小体显著减少,差异有统计学意义(均P<0.05);与PBS对照组比较,术后1周,低、中、高滴度组大鼠逃避潜伏期、跨越平台次数差异无统计学意义(均P>0.05);术后4周,低、中、高滴度组较PBS对照组逃避潜伏期时间缩短、跨越平台次数增加,神经元排列整齐、形态更规则,尼氏小体增多,IL-1β阳性细胞数明显减少(均P<0.05);与中滴度组比较,术后1周,低、高滴度组的潜伏期、跨越平台次数差异无统计学意义(均P>0.05);术后4周,低、高滴度组大鼠逃避潜伏期延长、跨越平台次数减少,海马神经元受损更严重,尼氏小体数减少,IL-1β阳性细胞数增多,GFP转染率显著降低(均P<0.05)。结论中滴度AAV9-ROCK2-shRNA能高效、稳定、低毒地转染大鼠海马组织,对VaD大鼠海马神经元保护作用最优。

基于齿状回神经元树突棘形态探讨ROCK2敲减改善APP/PS1小鼠认知功能的作用机制

目的:观察海马区敲减Rho相关激酶2(ROCK2)对阿尔茨海默病模型APPswe/PS1dE9(APP/PS1)转基因小鼠的干预效果,并探索其对海马齿状回区神经元树突棘形态的影响及潜在机制。方法:选用雄性8月龄的C57BL/6及APP/PS1小鼠,随机分为4组,分别为野生型(WT)组(8只)、APP/PS1小鼠生理盐水(NS)组(8只)、APP/PS1小鼠敲减对照(shRNA)组(12只)和APP/PS1小鼠ROCK2敲减(shROCK2)组(12只)。通过腺相关病毒共转染shRNA的方法,下调APP/PS1转基因小鼠双侧海马区神经元ROCK2蛋白表达,实现海马区局部神经元ROCK2敲减。利用水迷宫和Y迷宫实验检测小鼠的认知功能;免疫荧光染色和Western blot检测AD相关病理改变;激光共聚焦和Imairs软件观察并分析海马齿状回区神经元的树突棘形态变化;Western blot检测海马组织中突触相关蛋白的表达水平。结果:水迷宫实验中,与WT组的小鼠相比,NS和shRNA组小鼠到达平台的时间、到达平台的距离及第一次进入平台所在象限的时间均显著增加(P<0.05或P<0.01);敲减ROCK2可以显著降低APP/PS1小鼠到达平台的时间和距离及第一次进入平台象限的时间(P<0.05)。Y迷宫实验中,敲减ROCK2使APP/PS1小鼠在新异臂的时间占总时间的比例和自发交替率显著增加(P<0.01或P<0.05)。敲减ROCK2显著降低了APP/PS1小鼠脑组织中β-淀粉样蛋白和磷酸化τ蛋白水平(P<0.05或P<0.01)。shROCK2组小鼠海马齿状回神经元树突棘的长度和树突棘颈的平均长度较shRNA组显著增加(P<0.01),颈的平均直径显著减小(P<0.05)。与WT组相比,NC组及shRNA组小鼠海马区突触结合蛋白1(Syt1)、囊泡谷氨酸转运体1(VGLUT1)及突触后致密蛋白95(PSD95)的含量显著下调(P<0.01或P<0.05),shROCK2小鼠海马区的Syt1、VGLUT1和PSD95蛋白表达显著高于shRNA小鼠(P<0.05或P<0.01)。结论:海马齿状回区神经元ROCK2敲减可以显著改善APP/PS1小鼠的认知功能,调控海马齿状回区树突棘的形态,并有效抑制APP/PS1小鼠海马区兴奋性突触数量的减少。

RTN1-C基于Nogo-A/RhoA/ROCK2信号通路对脑卒中模型大鼠认知功能的干预作用

目的分析内质网膜相关蛋白(RTN1-C)基于髓鞘相关生长抑制因子(Nogo-A)/Rho激酶(RhoA)/Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)2信号通路对脑卒中模型大鼠认知功能的干预作用。方法选取清洁级健康雄性大鼠48只,随机选取12只为正常组,剩余36只建立脑卒中模型分为模型组(注射等体积生理盐水)、对照组(5μl慢病毒注射,为无意义序列)、RTN1-C干预组(5μl慢病毒注射)各12只。Morris水迷宫检测大鼠的认知功能,网屏测试实验检测四肢抓握能力、疲劳转棒实验检测协调能力、酶联免疫吸附试验检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)水平,计算大鼠血脑屏障通透性、脑梗死率、脑血流灌流量,显微镜观察大脑皮层完整神经元数目,Western印迹法检测Nogo-A、RhoA、ROCK2蛋白。结果与模型组、对照组相比,RTN1-C干预组潜伏期较短、四肢抓握能力评分较低、行走时间较长;血脑屏障通透性、脑梗死率较小,脑血流灌流量、大脑皮层完整神经元数目较大;SOD水平较高,MDA、ROS水平较低;Nogo-A、RhoA、ROCK2水平较低,均有统计学差异(均P<0.05)。结论RTN1-C可通过调控Nogo-A、RhoA、ROCK2蛋白和SOD、MDA、ROS水平,改善脑卒中大鼠脑损伤程度和应激反应,提高认知功能。

针康法对局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损及梗死灶周边区RhoA、ROCK-Ⅱ蛋白表达的影响

目的:探讨针康法对局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损及梗死灶周边区Rho A、ROCK-II蛋白表达的影响。方法:将90只清洁级SD雄性大鼠随机分为5组,即假手术组、模型组、针刺组、康复组及针康组,各组于3天、7天、14天时间点再分成3个亚组(n=6)。采用改良的Zea Longa线栓法制备局灶性脑梗死大鼠模型。假手术组与模型组大鼠不予任何治疗,针刺组给予头穴丛刺治疗,康复组给予运动康复训练,针康组给予头穴丛刺结合运动康复训练。术后3天、7天、14天采用改良大鼠神经功能缺损评分(m NSS)评估各组大鼠神经功能,免疫组化法检测大鼠梗死灶周边区Rho A、ROCK-Ⅱ蛋白的表达。结果:术后7天、14天,与模型组比较,各干预组大鼠神经功能缺损评分均明显降低(P<0.05);与针刺组、康复组比较,针康组大鼠评分有所降低(P<0.05)。术后各时间点,与模型组比较,各干预组梗死灶周边区Rho A、ROCK-Ⅱ阳性细胞数均明显减少(P<0.05);与针刺组、康复组比较,针康组大鼠梗死灶周边区Rho A、ROCK-Ⅱ阳性细胞数目有所减少(P<0.05)。结论:头穴丛刺疗法、运动康复训练、针康法均能有效改善局灶性脑梗死大鼠神经功能缺损,下调梗死灶周边区Rho A、ROCK-Ⅱ蛋白表达,且针康法优于单纯头穴丛刺或运动康复训练。

狼疮性肾炎患者血清LRG1、ROCK2表达与自身免疫抗体及疾病活动的相关性分析

目的:探究狼疮性肾炎(LN)患者血清富亮氨酸α-2糖蛋白-1(LRG1)、Rho激酶2(ROCK2)表达与自身免疫抗体及疾病活动的相关性。方法:选取2018年04月—2020年05月于深圳市龙华区人民医院收治的系统性红斑狼疮(SLE)患者167例为研究对象,其中LN患者74例,非LN患者93例。利用酶联免疫吸附法检测血清LRG1、ROCK2水平;使用自身抗体检测试剂盒对血清抗C1q抗体、抗Sm抗体及抗rRNP抗体进行定性检测;利用贝克曼5800型全自动生化分析仪检测患者24 h蛋白尿水平、血清尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)等肾功能指标。根据世界卫生组织狼疮性肾炎病理学分类将LN患者分为Ⅰ~Ⅱ型12例,Ⅲ~Ⅳ型46例,Ⅴ型16例,比较各组患者血清LRG1、ROCK2水平及肾功能指标、抗C1q抗体、抗Sm抗体、抗rRNP抗体阳性表达情况及系统性红斑狼疮疾病活动度(SLEDAI)评分,并分析其相关性,受试者工作特征曲线(ROC)曲线分析血清LRG1、ROCK2对LN患者的诊断价值。结果:LN组患者血清LRG1、ROCK2水平、24 h蛋白尿、BUN、Scr及血清抗C1q抗体、抗Sm抗体、抗rRNP抗体阳性表达率均显著高于非LN组患者(P<0.05);Ⅰ~Ⅱ型、Ⅲ~Ⅳ型、Ⅴ型LN患者血清LRG1、ROCK2水平、抗C1q抗体、抗Sm抗体、抗rRNP抗体阳性表达率及SLEDAI评分均依次升高(P<0.05);Spearman相关性分析显示,LN患者血清LRG1、ROCK2水平与抗C1q抗体、抗Sm抗体、抗rRNP抗体阳性表达率、SLEDAI评分及24 h蛋白尿、BUN、Scr均呈正相关(P<0.05);ROC结果显示,血清LRG1、ROCK2诊断LN的曲线下面积(AUC)分别为0.804、0.770,二者联合诊断LN的AUC为0.867。结论:LN患者血清LRG1、ROCK2表达上调,与自身抗体阳性表达情况、SLEDAI评分及肾功能指标相关,可能作为诊断LN的潜在生物指标。

Rock2对细胞周期检查点Cdc25A的调节作用

目的:探讨肝癌细胞中Rho相关含卷曲螺旋蛋白激酶2(Rock2)对细胞周期检查点细胞分裂周期蛋白25A(Cdc25A)的调节作用。方法:Western blotting检测51对肝癌及癌旁组织中Rock2与Cdc25A的蛋白表达情况。构建并筛选shRock2干扰质粒,稳定转染到人肝细胞癌Huh-7和HepG2细胞中,Western blotting检测Cdc25A蛋白表达变化;针对Rock2干扰序列,利用PCR定点突变技术进行碱基突变,构建Rock2突变质粒从而"恢复"Rock2表达,分析Cdc25A蛋白表达变化并用MTT法检测肝癌细胞增殖的改变。Western blotting检测Rock2稳定低表达的肝癌细胞中检查点激酶1(Chk1)和检查点激酶2(Chk2)蛋白的变化,免疫共沉淀及免疫荧光分析Rock2与Cdc25A的相互作用。结果:Rock2与Cdc25A蛋白在肝癌组织中较癌旁组织呈现高表达,而且两者呈正相关。肝癌细胞中稳定低表达Rock2后,Cdc25A蛋白表达明显下降;"恢复"Rock2表达后,Cdc25A蛋白表达增加而且肝癌细胞也出现增殖加快现象。Rock2低表达对Chk1和Chk2蛋白变化无明显影响。免疫共沉淀表明Rock2与Cdc25A直接相互作用,免疫荧光检测表明Rock2与Cdc25A存在共定位。结论:Rock2对细胞周期检查点Cdc25A起直接的正向调控作用,而且不依赖于Chk1/Chk2,可能为肝癌基因表达调控研究提供新的靶基因。