rhTNF-α在体外对人正常精子线粒体和质膜的影响

目的:观察rhTNF-a在体外对人正常精子线粒体功能和质膜完整性的影响。方法:40例健康自愿者正常精液,Peroll梯度离心将精子密度调整为10×106/mL,分别与终浓度0 pg/mL(对照组)、30 pg/mL、60 pg/mL、90 pg/mL、270 pg/mL的rhTNF-a孵育。在0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h时间段取样,用终浓度为10 mg/mL 的Rh123和PI双染色精子,流式细胞仪检测精子线粒体膜电位及质膜完整性的变化。结果:与对照组相比较,60 pg/mL、90 pg/mL、270 pg/mL各组线粒体功能良好的精子明显减少,这种变化趋势与TNF-a浓度和孵育时间呈正相关(P <0.01)。30 pg/mL组的精子线粒体功能与对照组相比无统计学差异(P >0.05);30 pg/mL、60 pg/mL、90 pg/mL、270 pg/mL各组的PI和Rh123双染色均阳性的精子数较对照组多,且与rhTNF-a的浓度和孵育时间呈正相关(P <0.01)。结论: rhTNF-a对人精子线粒体功能有一定的影响,提示有可能干扰精子的能量代谢,降低精子受精能力,并有可能通过线粒体凋亡途径,促进精子凋亡;同时影响精子质膜的完整性。

重组人肿瘤坏死因子(rhTNF-α)国家标准品的研制

目的:建立符合WHO重组细胞因子要求,用于rhTNF质量控制的国家标准品.方法:用NIBSC提供的国际标准品为标准,采用L929细胞体外活性测定系统,按统一方案组织了4家实验室,对这批rhTNF-α国家标准品(批号960508)的效价进行协作标定.结果:经统计学分析,均数的95%可信区间为3289～4266IU/支,单次测定的95%标准值范围为1735～8087IU/支.这批国家标准品效价确定为3500IU/支.4种不同温度存放27个月的样品,效价测定结果表明其效价稳定.结论:这批rhTNF-α经统一协作,质量可靠,效价稳定,可用作国家标准品使用.

rhTNF-α生物活性测定方法的改进及其对人白血病早幼粒细胞HL-60作用机理研究

目的:通过对rhTNF-α生物活性方法的改进,建立了较规范的活性测定方法,避免了人为判定的误差,提高了测定精确性.方法:本研究应用L929鼠结缔组织来源纤维母细胞系,参照国际标准品测定rhTNF-α效价.分别用Northern Dot Blot杂交检测及DNA电泳等方法,观察不同效价rhTNF-α对HL-60人白血病早幼粒细胞生长的影响.结果:rhTNF-α对HL-60细胞的生长抑制作用与时间、剂量正相关,核酸水平检测初步发现c-myc基因表达量降低,且rhTNF-α对DNA有损伤作用.结论:rhT-NF-α的测定可用自动分析的方法进行.rhTNF-α抑制HL-60细胞生长,其机理不同于阿霉素.

rhTNFα D11a对S180肉瘤的体内抗肿瘤作用

ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ是利用基因工程技术制备的一种新型ＴＮＦ。体外在极低浓度下对多种人源性和鼠源性肿瘤细胞均有明显的细胞毒作用，与原型ｒｈＴＮＦα相比，其活性高１０倍以上；在小鼠和猴子体内进行的急性毒性和慢性毒性试验表明：其毒性比原型ｒｈＴＮＦα低约７倍。本文研究了ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤作用，结果表明：瘤内注射１×１０４Ｕ的ｒｈＴＮＦαＤ１１ａ，７０％的动物肿瘤完全消失，其余动物肿瘤极显著减小，且发生组织重度坏死；注射１×１０３Ｕ，１０％的动物肿瘤完全消失，９０％的肿瘤不同程度地减小，肿瘤组织坏死程度以轻、中度为主；注射１×１０２Ｕ的动物肿瘤无明显减小，但生长率均显著低于对照组。

重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNFα)工程菌高密度发酵研究

报道了 rh TNFα重组菌发酵条件及高密度、高表达发酵的研究。首先研究了营养成份对其生长和表达的影响 ,确定了半合成发酵培养基 ;筛选出了 rh TNFα生长和表达的最适宿主菌 E.coli YK5 37;研究了影响高表达的几个关键因素 ,建立了该类型重组菌的诱导表达条件。结果表明限制发酵过程中乙酸积累、控制在指数生长期进行诱导、持续诱导时间不超过 5 h是实现高密度、高表达发酵的关键条件。采用半经验补料流加公式 ,在 NBS Bio Flo30 0 0型 5 L 发酵罐中利用恒溶氧 -补料培养批技术 ,限制甘油浓度在 5 g/ L,可使 E.coli YK5 37/ p SB- TR最终菌体密度和 rh TNFα的产量分别达到 A6 0 0 12 6和 8.4g/ L。

rhTNFα加rhIL-2诱导小鼠CNE3细胞凋亡和抑制增殖的体内实验研究

目的：研究重组人肿瘤坏死因子（rhTNF－α）对鼻咽癌细胞敏感性、重组人白细胞介素－2（rhIL－2）协同抗瘤效应及抗瘤机理。方法：利用我室建立的鼻咽癌细胞株（CNE3）制成的裸鼠鼻咽癌模型，rhTNFα通过与rhIL－2配伍瘤内注射以观察移植瘤超微结构及免疫组织化学的改变，探讨其作用机理。结果：鼻咽癌裸鼠移植瘤经治疗后出现坏死、体积缩小、甚至消失；超微结构观察凋亡细胞缩皱，核内异染色质边集；免疫组化研究发现：rhTNF－α有下调（突变型）p53和增殖细胞核抗原（PCNA）蛋白表达，其可能与rhTNF－α的抗癌机理有关；rhIL－2能增强rhTNF－α的抗瘤作用。结论：rhIL－2增强rhTNF－α的抗瘤机理可能与IL－2诱导癌细胞表达TNF受体作用有关，该研究为临床在鼻咽镜下进行TNF局部治疗提供实验依据。

表达载体pRSET C重组rhTNF-β的表达及其纯化

将hTNFβN端缺失23个氨基酸的基因,克隆在表达载体pRSETC的6个组氨酸序列和肠激酶酶切位点序列的下游。以重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,rhTNFβ获得了高表达,表达量占细菌总蛋白的26%。其表达产物大部分以可溶性形式存在。菌体裂解上清经0.45μm滤膜过滤后,用固定化金属配体亲和柱层析,纯度可达95%左右;经肠激酶酶切后,具有TNFβ的细胞毒活性,此活性为9.8×109U/g。

重组人肿瘤坏死因子α(rhTNFα)衍生物的纯化及检定

采用热处理、盐析和离子交换层析技术对新型人肿瘤坏死因子α衍生物 (命名为hTNFD)蛋白进行了纯化 ,纯化后的纯度大于 96 % ,回收率为 43.8% ,纯化倍数为 6 .4倍。经L92 9细胞测活结果表明 ,hTNFD的比活可达 1.0 1× 10 1 0 U mg ,比原型TNFα活性提高 46 5倍 ,整个纯化工艺简单、稳定 ,易于放大 ,显示出较好的临床应用前景 ,

rhTNF瘤内注射致膀胱癌的超微结构改变

FNF是迄今所知抗肿瘤作用最强的细胞因子,体内外实验均表明TNF对多数肿瘤具有杀伤或细胞抑制(cytostasis)作用。但因其剂量依赖性毒副作用,加之生物半衰期短,全身应用难以在局部达到有效浓度而限制了临床应用。增加应用剂量常引起寒战、高热、低血压、甚至发生恶液质等严重副作用。目前对TNF的研究侧重于分子修饰,改变应用策略等方面,以提高疗效,减少不良反应。

rhIL-1α和rhTNF-α对人成纤维滑膜细胞PGE_2受体和Gαs的影响及芍药苷的作用

目的探讨rhIL-1α和rhTNF-α对人成纤维样滑膜细胞(FLS)PGE2受体(EP2)及Gαs表达的影响及芍药苷(Pae)的作用。方法体外培养人FLS,使用不同浓度的rhIL-1α和rhTNF-α刺激人FLS,观察EP2及Gαs蛋白表达的情况,观察Pae对其的影响。采用免疫荧光标记法结合激光共聚焦显微镜分析技术检测人FLS的EP2表达,Western blot检测Gαs表达。结果 rhIL-1α(0.1、1、10μg/L)和rhTNF-α(0.2、2、20μg/L)明显降低人FLS EP2和Gαs表达,Pae(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)可上调人FLS的EP2和Gαs表达。结论 Pae恢复rhIL-1α和rhTNF-α刺激后EP2和Gαs的表达可能是其抑制滑膜细胞增殖和亢进分泌功能的分子机制之一。

FCA包裹rhTNF对结肠癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的：探讨增强ＴＮＦ抗结肠癌作用的方法。方法：建立人结肠癌裸小鼠移植瘤模型，观察ＦＣＡ包裹ｒｈＴＮＦ对移植瘤体积、瘤重及抑瘤率等变化的影响。结果： ＦＣＡ包裹ｒｈＴＮＦ对人结肠腺癌裸小鼠移植瘤体积、瘤重、生长及抑瘤率等抑制作用均较ｒｈＴＮＦ明显增强；对裸小鼠体重及全身情况的影响较单用ｔｈＴＮＦ明显减轻。结论：ＦＣＡ增强ｒｈＴＮＦ的抗结肠癌作用、减轻ｒｈＴＮＦ的副作用，可能与ＦＣＡ包裹后使ｒｈＴＮＦ在肿瘤灶内持续缓慢释放、半衰期延长有关。

冷冻切除联合rhTNF-α在恶性脑胶质瘤中的应用价值探讨

目的探讨冷冻切除联合rhTNF-α在恶性脑胶质瘤中的临床应用价值。方法选择颅内胶质瘤患者90例,随机分为两组,每组45例。对照组使用冷冻治疗,观察组在对照组的基础上联合使用rhTNF-α,比较两组患者治疗后新增语言、运动及记忆力障碍比例,治疗不良反应及治疗前及治疗后6个月肿瘤体积的变化。结果观察组治疗后新增语言、运动及记忆力障碍的比例均显著低于对照组(P<0.05),观察组发生发热和头痛的比例显著低于对照组(P<0.05)。治疗6个月后,两组肿瘤体积均较治疗前显著缩小(P<0.05),且观察组小于对照组(P<0.05),观察组2年生存率高于对照组。结论冷冻治疗联合使用rhTNF-α治疗脑胶质瘤,在减少单纯冷冻治疗不良反应的同时,提高治疗效果延长患者生存时间,值得临床推广。

联合应用rhTNF和环磷酰胺治疗胶质瘤大鼠的效果及其机制

目的:探讨联合应用rhTNF和环磷酰胺治疗胶质瘤大鼠的效果及其可能机制。方法:制备胶质瘤大鼠模型,动态监测经颈总动脉给予rhTNF后的血肿瘤屏障开放程度。给予rhTNF 120 min再给予CTX后,ELISA法测定胶质瘤组织内CTX的含量。观察分别给予rhTNF、CTX和rhTNF(120 min)+CTX的胶质瘤大鼠的生存时间。结果:给胶质瘤大鼠注射rhTNF后,血肿瘤屏障开放程度增加,于120 min达最大后开始减小。给予rhTNF 120 min再给予CTX后,胶质瘤组织内CTX含量明显高于单独给予CTX组。与其他组相比,rhTNF(120 min)+CTX能明显延长胶质瘤大鼠的生存时间。结论:胶质瘤大鼠给予rhTNF 120 min时血肿瘤屏障开放程度最大,此时进入胶质瘤组织的CTX含量最多。

冷冻联合rhTNF-α对C6大鼠脑胶质瘤细胞的凋亡诱导和增殖抑制作用

目的探讨冷冻联合rhTNF-α对C6大鼠脑胶质瘤细胞凋亡的影响及对肿瘤生长的抑制作用。方法建立大鼠脑胶质瘤模型,待肿瘤长至第15天,随机将荷瘤鼠分为4组:G1、G2、G3、G4分别为盐水组、冷冻治疗组、rhTNF-α治疗照组及联合治疗组,同时分别行相应的治疗。于治疗后第15天取材,以TUNEL法与流式细胞仪联合检测肿瘤细胞的凋亡,采用免疫组化观察PCNA的表达,计算抑瘤率。结果联合治疗组肿瘤细胞凋亡情况与其他各组相比有显著差异(P<0.01),PCNA的表达明显减少(P<0.01),且该组对肿瘤生长的抑制率(60.38%)明显大于冷冻组(42.69%)和TNF-α组(21.68%),且大于理论抑瘤率(55.11%)。结论冷冻和rhTNF-α对C6大鼠脑胶质瘤细胞的生长均有抑制作用,同时可诱导其凋亡,两者联用抗肿瘤作用进一步加强,具有协同作用,可能成为胶质瘤治疗的一种新策略。

rhTNF联合环磷酰胺对胶质瘤的靶向作用

目的:探讨重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)联合环磷酰胺(CTX)对胶质瘤的靶向作用,并阐明其作用机制。方法:构建C6胶质瘤大鼠模型,将大鼠分为rhTNF组(n=10)、CTX组(n=10)及rhTNF-Dex-CTX组(n=10)。免疫荧光法观察肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)在胶质瘤组织中的表达;利用125I-rhTNF,通过放射配基结合受体分析法检测大鼠脑组织和胶质瘤组织中rhTNF水平;ELISA法检测大鼠脑组织和胶质瘤组织中CTX水平;观察rhTNF、CTX及rhTNF-Dex-CTX偶联物对胶质瘤大鼠生存时间的影响。结果:TNFR1在胶质瘤细胞中的表达明显高于肿瘤血管内皮细胞。rhTNF在胶质瘤组织中与TNFR1的结合量明显高于正常脑组织(P<0.01)。CTX组大鼠脑组织和胶质瘤组织中CTX水平均较低;与CTX组和大鼠正常脑组织比较,rhTNF-Dex-CTX组大鼠胶质瘤组织内CTX的水平明显升高(P<0.01)。与CTX组和rhTNF组比较,rhTNF-Dex-CTX组大鼠的生存时间明显延长(P<0.01)。结论:rhTNF-Dex-CTX可能是通过TNFR1增强CTX对胶质瘤的靶向作用。

rhTNFα与IL-2联合瘤内注射致鼻咽癌移植瘤超微结构的改变

应用 CNE- 3鼻咽癌细胞株作为靶细胞 ,建立鼻咽癌裸鼠移植瘤模型 ,探讨rh TNFα与 IL- 2联合瘤内注射对鼻咽癌裸鼠移植瘤形态学的影响。结果显示 :单独应用rh TNFα早期鼻咽癌细胞缩小 ,异染色质增多和出现凋亡小体 ,联合应用后癌细胞改变出现时间早、程度重 ,表现为内质网扩张 ,核固缩 ,核碎裂 ,癌细胞坏死及淋巴细胞反应。提示rh TNFα和 IL- 2有不同程度协同杀伤鼻咽癌细胞的作用 ,促使癌细胞趋向死亡。该研究为临床术前 rh

rhTNF-α联合IL-2对急性髓细胞白血病患者骨髓体外净化的研究

目的 探讨重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF -α)联合白细胞介素2(IL-2)对急性髓细胞白血病 (AML)骨髓体外净化的作用。 方法 rhTNF -α(1000u/ml)和IL-2(500u/ml)联合 ,对17例AML患者骨髓体外净化培养1～3d,用甲基纤维素半固体培养法测定粒 -巨噬细胞集落 (CFU -GM)、白血病祖细胞 (CFU -L)形成 ,并以免疫组化法测定CD33、CD38和CD34阳性表达率的变化。结果 (1)rhTNF-α对8例正常人和17例患者的CFU -GM均有明显的抑制作用 ,而与IL -2联合作用对CFU-GM则无明显影响 ;(2)单用rhTNF-α或IL-2与患者骨髓共同孵育1d和3d,CFU -L形成率均有所下降 ,但至孵育3d后 ,尚残余20%、6%的白血病克隆 ,不能完全根除CFU-L;而两者联合作用3d后 ,CFU -L抑制率达100% ;(3)17例AML患者骨髓经rhTNF-α、IL-2净化培养3d后 ,白血病细胞CD33、CD38和CD34阳性表达率发生了明显变化。 结论 (1)单用rhTNF -α或IL-2净化效果不理想 ;(2)rhTNF-α联合IL-2对CFU -L有选择性杀伤作用 ,而对正常CFU -GM无明显影响 ,净化效果较好 ;(3)白血病细胞CD33、CD38、CD34阳性率的变化可间接评价AML骨髓净化效果。

rhTNF-NB与rhIL-2联合应用治疗恶性胸腔积液的疗效观察

目的 比较rhTNF -NB与rhIL -2胸腔内联合注射 ,治疗恶性胸腔积液与单纯应用rhTNF -NB的疗效和毒副反应 ,寻求高效低毒治疗恶性胸腔积液的方法 ,以提高晚期癌症患者的生活质量。方法 对符合治疗条件的 5 0例恶性胸腔积液患者采用随机分组研究方法 ,观察联合应用 (方法 :先尽量抽取胸腔积液 ,先后将rhTNF -NB 2 0 0万单位用生理盐水 2 0ml稀释和rhIL -2 2 0万单位用生理盐水 2 0ml稀释注入胸腔。为减轻局部反应 ,可加 2 %利多卡因 10ml一并注入。每周 2次 ,2周为一疗程。如疗程中胸腔积液消失 ,即停止治疗。)与单独应用 (方法同上 ,每次仅注入rhTNF -NB 30 0万单位 )的临床疗效和毒副反应。结果 联合组有效率为92 0 % ,对照组为 44 0 % ,两组有显著性差异 (P <0 0 5 )。副作用有发热、寒战、恶心、呕吐、胸痛、乏力、血球变化及一过性肝肾损害等 ,两组无显著性差异。结论 rhTNF -NB与rhIL -2联合应用协同作用 ,疗效肯定 ,方法简单 。

pRL-hTNF/JM103工程菌发酵和rhTNFα表达的研究

为便于下游中试规模生产，采用温度敏感型启动子PRPL构建rhTNFα工程菌，并对影响工程菌发酵培养和表达的因素进行了初步研究。结果显示，采用RTB培养基，50℃热水快速升温，诱导培养4～4．5h，湿菌体收获率和表达量均达到较高水平；50L发酵罐连续发酵3批，14000r／min连续离心，菌体收获率湿重达16．gg／L培养物，rhTNFα表达量占菌体总蛋白的10.5％，活性达1．35×107U／mg蛋白。.