敲低维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)抑制全反式维甲酸诱导的NB4急性早幼粒白血病细胞的分化

目的探讨慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)敲低NB4急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)对全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化的影响及其机制。方法将含有人RIG-Ⅰ基因shRNA序列(RIG-Ⅰ-shRNA)及含绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒感染NB4细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)及Western blot法分别检测ATRA诱导前后NB4细胞RIG-Ⅰ mRNA和蛋白水平;流式细胞术观察慢病毒感染效率和RIG-Ⅰ-shRNA对ATRA诱导NB4细胞分化的影响;Western blot法检测敲低RIG-Ⅰ水平后,ATRA处理对蛋白激酶B308位苏氨酸(AKT-Thr308)磷酸化的调控效应。结果含RIG-Ⅰ-shRNA序列的慢病毒可成功感染NB4细胞,下调ATRA诱导的RIG-Ⅰ水平;敲低RIG-Ⅰ后,明显抑制ATRA诱导NB4细胞分化,同时上调AKT-Thr308磷酸化水平。结论敲低NB4细胞RIG-Ⅰ蛋白可上调AKT-Thr308磷酸化水平抑制ATRA诱导的急性早幼粒白血病细胞分化。

柯萨奇病毒A组16型的3C蛋白抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β的诱导

目的探讨柯萨奇病毒A组16型对RIG-Ⅰ介导的信号通路的影响。方法将带有IFN-β启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒pIFN-β-luc及内对照报告载体pRL-CMV转染细胞,之后用CA16感染细胞,24 h后检测报告基因活性。将CA16感染细胞,在感染6 h、12 h、24 h以及48 h后用Real-time PCR方法测定细胞中IFN-β的mRNA的表达水平。将pIFN-β-luc和pRL-CMV以及表达RIG-I的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒共转染细胞,24 h后检测报告基因活性。将带有绿色荧光蛋白GFP的IRF3质粒和表达RIG-I基因N端质粒以及表达CA16的3C蛋白共转染细胞,24 h后用荧光显微镜观察。将表达RIG-I的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒共转染细胞,24 h后用免疫共沉淀方法验证蛋白质间相互作用。结果 CA16感染细胞不能引起IFN-β表达的上调,CA16的3C蛋白抑制了RIG-I诱导的IFN-β的启动子活性以及IRF3的核迁移,CA16的3C蛋白与RIG-Ⅰ存在相互作用。结论 CA16的3C蛋白通过与RIG-Ⅰ相互作用从而抑制RIG-Ⅰ介导的IFN-β的诱导。

小鼠Rig-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

【目的】进一步研究小鼠维甲酸诱导基因Ⅰ(Rig-Ⅰ)蛋白的细胞信号传导、结构与功能。【方法】利用已经构建好的逆转录病毒载体MigRI-Rig-Ⅰ,用PCR方法扩增出小鼠Rig-Ⅰ基因氨基端100 bp长度的片断(Rig-Ⅰ-N),将此片段定向克隆到原核表达载体pGEX-4T2中,构建pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N,再将Rig-Ⅰ基因剩余部分克隆到已构建有Rig-Ⅰ-N部分片段的pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N中,构建融合表达载体pGEX-4T2-Rig-Ⅰ,将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,对表达产物GST-Rig-Ⅰ融合蛋白进行纯化,制备抗体,并对抗体效价进行ELISA检测及抗体特异性的Western blot分析。【结果】重组蛋白GST-Rig-Ⅰ能在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白GST-Rig-Ⅰ纯化和洗脱后分子质量为130 ku,纯度>90%,制备的抗体效价达到1∶625 000,并且能够识别在原核表达系统以及真核细胞内表达的小鼠Rig-Ⅰ蛋白。【结论】建立的表达系统能够表达重组蛋白GST-Rig-Ⅰ,制备的抗体具有良好的免疫特异性。

绿头鸭RIG-Ⅰ基因的分子特征及其在体内的表达分布

为揭示野生绿头鸭视黄酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid-inducible geneⅠ,RIG-Ⅰ)的分子特征及其在体内的表达分布规律,对野生绿头鸭RIG-Ⅰ(MdRIG-Ⅰ)基因的CDS序列进行了克隆和序列分析,并应用荧光定量PCR方法对RIG-Ⅰ基因在绿头鸭不同组织中的表达水平进行了测定。结果显示:MdRIG-Ⅰ基因的CDS序列全长2 802 bp,编码933个氨基酸,与哺乳动物和鱼类的RIG-Ⅰ基因同源率较低,为43.7%~46.7%与52.2%~54.9%;与鸟类的RIG-Ⅰ基因同源率较高,为78.7%~99.8%;与番鸭和绍兴麻鸭的RIG-Ⅰ基因同源率为98.3%和99.8%,有较强的种间特异性;MdRIG-Ⅰ基因mRNA在体内不同器官的表达量均高于SPF鸭(绍兴麻鸭),且不同组织表达量各不相同:在肝脏中表达水平最高,其次是肠,在心和脾表达呈中等水平,在肺和肾表达呈低等水平。研究结果揭示了RIG-Ⅰ通路在鸭科动物抗病毒中的作用及其分子机制,为水禽先天性免疫研究奠定良好的基础。

鸭RIG-Ⅰ蛋白C端helicase结构域和RD结构域的原核表达及其单克隆抗体的制备

利用PCR技术将鸭维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)helicase区和RD区部分编码序列分别进行扩增,并分别命名为c、d段;克隆到p ET30a原核表达载体,构建了重组原核表达质粒p ET30a-c和p ET30a-d,通过转化BL21(DE3)感受态菌、IPTG诱导、镍柱纯化表达蛋白,将纯化的c、d蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体(m Ab),采用ELISA、Western blot和间接免疫荧光试验对单克隆抗体进行鉴定分析。获得鼠抗鸭RIG-Ⅰ单克隆抗体有14株与原核分段表达的c、d蛋白有良好的反应性,其中3株与真核表达的RIG-Ⅰ蛋白有良好的反应性。制备的鼠抗鸭RIG-Ⅰ单克隆抗体为RIG-Ⅰ在抗病毒天然免疫信号转导途径的研究奠定了基础。

马岗鹅RIG-Ⅰ基因扩增及序列分析

为研究马岗鹅维甲酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)的基因序列特征,试验扩增了马岗鹅RIG-Ⅰ基因,分析了马岗鹅RIG-Ⅰ基因序列并表达了其蛋白。结果显示:马岗鹅RIG-Ⅰ基因cDNA的开放阅读框全长为2 805 bp,编码934个氨基酸,蛋白分子量约为106.63 ku;马岗鹅RIG-Ⅰ蛋白具有2个串联的N端半胱天冬酶募集结构域、DExD/H-box RNA解旋酶结构域和C端结构域;马岗鹅RIG-Ⅰ与其它鸟类亲缘关系较近,与哺乳动物亲缘关系次之,与鱼类亲缘关系较远;马岗鹅RIG-Ⅰ蛋白结构以α-螺旋为主(占比50.21%),无规则卷曲次之(占比37.69%),延伸链较少(占比12.10%);马岗鹅RIG-Ⅰ真核表达质粒成功表达了约106 ku的蛋白。研究成功鉴定了马岗鹅RIG-Ⅰ基因并表达其蛋白,为进一步制备该蛋白的特异性抗体和研究鹅RIG-Ⅰ在抗病毒天然免疫中的功能奠定了基础。

RIG-Ⅰ样受体信号传导通路与调控机制研究进展

视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)为RLRs受体家族的成员,是比较关键的细胞质内病原体识别受体,可识别细胞内的单链、双链等RNA病毒成分,被激活的RIG-Ⅰ受体及其CARD在TRIM25的作用下连接泛素链使其寡聚化,通过与线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)相互作用,激活MAVS及下游转录因子IRF3和NF-κB,从而诱导Ⅰ型干扰素和炎性因子的表达,最终介导宿主的抗病毒免疫应答。鉴于RIG-Ⅰ持续激活可导致炎性因子对自身细胞的损伤,因此RIG-Ⅰ样受体信号通路受到宿主严格的调控。而某些病毒为逃避宿主细胞的免疫应答,进化出多种机制靶向调节RIG-Ⅰ及MAVS,从而阻断信号通路。论文从RIG-Ⅰ识别病毒机制、激活下游信号传导、宿主细胞对信号传导途径的调控以及病毒逃避机制等方面重点阐述RIG-Ⅰ所介导的天然免疫反应。

LRRC23激活RIG-Ⅰ信号通路对流感病毒复制的影响

目的探讨LRRC23(leucine rich repeat containing 23)激活RIG-Ⅰ信号通路对流感病毒复制的影响。方法通过在A549细胞中过表达和敲低LRRC23,探讨其对流感病毒复制的影响。将pcLRRC23质粒和siLRRC23(small interfering LRRC23)分别转染A549细胞,24 h后感染A/京防/1/86(H1N1),空斑试验和ELISA法分别检测细胞上清中流感病毒滴度和HA蛋白表达水平;qRT-PCR和Western blot法分别检测LRRC23、RIG-Ⅰ、MAVS、流感病毒M1基因及HA蛋白的表达水平;免疫荧光和免疫共沉淀试验(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测LRRC23与RIG-Ⅰ的相互作用;双荧光素酶报告基因分析试验检测IFN-β-luc和NF-κB-luc活性。结果过表达LRRC23可显著降低流感病毒A549细胞上清中流感病毒滴度,抑制HA蛋白的表达。过表达LRRC23通过激活RIG-Ⅰ-MAVS信号通路,增强流感病毒刺激的IFN-β和NF-κB激活,抑制流感病毒M1基因和HA蛋白的表达。相反,敲低LRRC23可增加流感病毒感染A549细胞上清中HA蛋白的表达;上调流感病毒M1基因相对表达量,下调RIG-ⅠmRNA和MAVS mRNA相对表达量。结论LRRC23通过激活RIG-Ⅰ信号通路抑制流感病毒复制,在抗病毒天然免疫中发挥重要作用。

内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制研究

[目的]探讨内毒素血症Rig-Ⅰ表达调控的机制。[方法](1)DNA-pull down、2D-DIGE结合生物质谱技术筛选分离、鉴定对照和内毒素血症小鼠肝组织核蛋白与Rig-Ⅰ基因启动子结合的差异蛋白质;(2)q PCR和细胞免疫荧光检测LPS刺激RAW264.7细胞hnRNP A3 mRNA表达及细胞内定位。[结果](1)筛选鉴定得到hnRNP A3等7种与内毒素血症Rig-Ⅰ基因启动子结合的蛋白质;(2)LPS刺激下hnRNP A3 mRNA显著升高(P<0.01),且具有明显的细胞核定位。[结论]共有7种蛋白质参与内毒素血症Rig-Ⅰ基因表达调控,为进一步Rig-Ⅰ表达调控的研究奠定了良好基础。

金荞麦水提物通过调控RIG-Ⅰ信号通路与细胞自噬抑制甲型流感病毒H1N1的复制

目的:探讨金荞麦水提物体外抗甲型流感病毒H1N1的效果及其作用机制。方法:考察金荞麦水提物抗H1N1感染犬肾(Madin-Darby canine kidney,MDCK)细胞的活性及作用方式;转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)分析金荞麦水提物处理后感染细胞的基因差异表达,筛选与抗病毒相关的信号通路;蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测LC3Ⅱ的表达水平,荧光显微镜观察自噬流,分析金荞麦水提物对感染细胞自噬水平的影响。结果:金荞麦水提物具有良好的抑制细胞内H1N1复制的活性,细胞对MDCK 1.25 mg/mL抑制率为51.02%,5 mg/mL抑制率为98.22%。与模型对照组比较,金荞麦水提物处理感染细胞后,引起2682个基因差异表达。KEGG通路富集分析表明,差异表达基因富集在RIG-Ⅰ和细胞自噬信号通路。金荞麦水提物1.25、2.5、5 mg/mL处理的感染细胞中,LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著低于模型对照组(P<0.01),且出现自噬溶酶体。结论:金荞麦水提物具有显著体外抗H1N1的活性,其作用机制与对宿主细胞RIG-Ⅰ信号通路的调控,以及抑制感染诱导的细胞自噬相关。

TRIM25、RIG-Ⅰ在肝癌组织中的表达及其与患者预后的关系

目的探讨TRIM25、RIG-Ⅰ在肝癌组织中的表达及二者与患者预后的关系。方法回顾性分析2017年1月至2018年1月南京医科大学附属淮安第一医院收治的82例肝癌患者资料,收集癌组织和癌旁组织(距肿瘤边缘>5 cm)标本。采用免疫组织化学法检测癌组织和癌旁组织TRIM25、RIG-Ⅰ蛋白表达情况。分析患者癌组织TRIM25、RIG-Ⅰ表达与临床病理特征的关系,采用Kaplan-Meier法分析癌组织TRIM25、RIG-Ⅰ不同表达状态患者总生存(OS)。结果癌组织TRIM25阳性率高于癌旁组织[68.29%(56/82)比21.95%(18/82),P<0.001],癌组织RIG-Ⅰ阳性率低于癌旁组织[31.71%(26/82)比74.39%(61/82),P<0.001]。低分化患者癌组织TRIM25阳性率高于高中分化患者(P<0.05),而RIG-Ⅰ阳性率低于高中分化患者(P<0.05);肝外转移患者癌组织TRIM25阳性率高于未肝外转移患者(P<0.05),而RIG-Ⅰ阳性率低于未肝外转移患者(P<0.05);临床分期Ⅲ~Ⅳ期患者癌组织TRIM25阳性率高于Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05),而RIG-Ⅰ阳性率低于Ⅰ~Ⅱ期患者(P<0.05)。中位随访27个月(4~48个月),共2例患者失访;至2022年1月随访结束,全组生存率为43.75%(35/80),癌组织TRIM25阳性和阴性患者生存率分别33.33%(18/54)和65.38%(17/26),癌组织RIG-Ⅰ阳性和阴性患者生存率分别64.00%(16/25)和34.55%(19/55)。Kaplan-Meier法分析显示,癌组织TRIM25阴性患者OS优于阳性患者,癌组织RIG-Ⅰ阳性患者OS优于阴性患者,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论肝癌组织TRIM25表达升高,RIG-Ⅰ表达降低。肝癌组织TRIM25、RIG-Ⅰ表达与预后相关。

RIG-Ⅰ在抗病毒固有免疫中的功能和机制研究进展

RIG-Ⅰ是维甲酸诱导基因Ⅰ样受体家族(Retinoic-acid-inducible geneⅠ-like receptors,RLRs)的成员之一,在抗病毒固有免疫应答中发挥重要作用。作为细胞质中的一种RNA解旋酶,RIG-Ⅰ可通过其RNA结合结构域与PAMPs结合,识别非自身病毒RNA,触发自身以及下游信号分子的活化,最终诱导IFN-Ⅰ、炎性细胞因子、趋化因子等产生,激活抗病毒免疫应答。本文综述了RIG-Ⅰ在抗病毒识别中的结构特性及在多种RNA病毒与DNA病毒感染中的抗病毒免疫作用或病毒免疫逃逸作用的研究进展,以期为深入研究RIG-Ⅰ抗病毒免疫调控机制及病毒免疫逃逸机制,进而为发现新的抗病毒靶点、研制新型抗病毒药物和疫苗提供理论参考。

猪维甲酸诱导基因Ⅰ的克隆及其在诱导Ⅰ型干扰素中的作用

本研究旨在探讨猪维甲酸诱导基因Ⅰ（RIG-Ⅰ）的结构特征及其在I型干扰素信号通路中的作用。从猪外周血单核细胞中克隆猪RIG-Ⅰ全长cDNA,进一步构建猪RIG-Ⅰ全长及不同区域缺失突变体的真核表达载体,通过IFN-βⅠ、RF3和NF-κB的荧光素酶报告系统分析猪RIG-Ⅰ在诱导I型干扰素中的作用。结果表明,猪RIG-Ⅰ开放读码框全长为2 832 bp,编码943个氨基酸,与鸭嘴兽、大鼠、小鼠、猴、黑猩猩、人、马和牛RIG-Ⅰ相应序列的同源性为53.2%~83.2%。猪RIG-Ⅰ超表达能显著激活转录因子IRF3和NF-κB,并诱导IFN-β的产生。缺失猪RIG-Ⅰ的CARD区不仅不能激活下游信号,而且还负调控poly（Ⅰ：C）诱导IFN-β的能力。结果提示RIG-Ⅰ是猪天然免疫系统中的一个模式识别受体,在I型干扰素诱导的信号通路中具有重要作用。

人源H7N9流感病毒促进Ⅰ型干扰素产生机制的研究

为阐明不同来源H7N9流感病毒诱导Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)产生水平差异及其机制,本研究选取人源流感病毒A/Anhui/1/2013(AH/1)株和禽源流感病毒A/Pigeon/Shanghai/S1421/2013(PG/S1421)株作为模式病毒株,利用C57BL/6小鼠进行致病性试验。结果显示,AH/1株感染可以致小鼠发病死亡,而PG/S1421株则不会致小鼠发病。采用间接免疫荧光试验和流式细胞试验分别对两株病毒在A549细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中的感染效率进行检测,结果显示两株病毒在两种细胞中的感染效率无显著差异。将该两株病毒分别感染小鼠腹腔巨噬细胞,在感染后不同时间点收集培养上清,并裂解细胞收取细胞总蛋白。采用ELISA方法对细胞培养上清IFN-Ⅰ含量进行测定。结果显示,感染后不同时间,AH/1株和PG/S1421株均可以诱导IFN-Ⅰ产生,但相较于PG/S1421株,AH/1株感染可以诱导细胞产生更多的IFN-Ⅰ;利用western blot对细胞总蛋白中IFN-Ⅰ产生信号通路的上游感受器分子视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)的表达水平进行检测。结果显示,在PG/S1421株感染细胞的12 h内,胞内RIG-Ⅰ分子的表达量无显著变化,而AH/1株感染后,胞内RIG-Ⅰ分子的表达量增加,并且表达量随时间延长而上升。以上试验结果表明,AH/1株感染可以通过上调RIG-Ⅰ表达进而诱导宿主细胞产生更多IFN-Ⅰ。本研究阐明了人源H7N9流感病毒促进IFN-Ⅰ产生的初步机制,为进一步解析人源H7N9流感病毒促进IFN-Ⅰ产生的精细分子机制以及免疫逃逸机制奠定了基础,为H7N9流感防控提供参考依据。

家禽视黄酸诱导基因-Ⅰ研究进展

天然免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线,视黄酸诱导基因-Ⅰ(RIG-Ⅰ)是细胞质内识别病毒双链RNA的一类模式识别受体,能够识别细胞质中的病毒RNA,诱导宿主细胞产生Ⅰ型干扰素等细胞因子,进而产生相应的抗病毒天然免疫反应。目前对人、小鼠、猪等哺乳动物细胞中RIG-Ⅰ介导的抗病毒天然免疫反应的研究较为深入,对家禽RIG-Ⅰ的相关研究还处于起步阶段。近年来,鸭和鹅的RIG-Ⅰ相继被研究。鸭和鹅RIG-Ⅰ的发现、结构特点、组织表达及其抗流感病毒和其他禽类病毒作用方面的研究都有了新的进展,将为禽类抗病毒和免疫系统研究提供参考。

视黄酸诱导基因-Ⅰ在家禽天然免疫应答中作用的研究进展

家禽的天然免疫应答在抵抗病毒感染的过程中起着关键性作用,视黄酸诱导基因-Ⅰ(retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)作为细胞质内一类识别病毒双链RNA的模式识别受体,与天然免疫应答密切相关。它可通过RNA配体结合病原相关分子模式监测细胞质中的病毒RNA,此过程激活了RIG-Ⅰ及下游线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS),最终导致干扰素调节因子(IRF3/7)和核因子κB(NF-κB)活化,诱导产生Ⅰ型干扰素等免疫细胞因子,进而使细胞做出相应的抗病毒天然免疫反应。但由于鸡体内缺乏RIG-Ⅰ基因,目前大多将鸭源或鹅源RIG-Ⅰ基因转染鸡成纤维母细胞(DF-1)研究RIG-Ⅰ基因在鸡感染禽类病毒时是否具有免疫功能。文章介绍了RIG-Ⅰ在家禽体内的表达及其介导的抗病毒天然免疫信号通路,并简述了RIG-Ⅰ在家禽体内抗病毒作用的研究概况,为抑制家禽病毒的感染和免疫系统研究,以及研制新型抗病毒疫苗或免疫佐剂等提供参考。

RIG-I介导的TLR非依赖性模式识别

天然免疫在机体抗病毒感染的过程中发挥重要作用。近年来,识别和感受病原体的一系列模式识别受体受到广泛关注,TLR(Toll-like receptor)便是这一领域中的热点,随着研究的深入,一类TLR非依赖性模式识别受体,逐渐活跃在天然免疫识别的舞台,这其中,解旋酶(helicase)家族中的重要成员——维甲酸诱导基因I(retinoic acid-inducedgeneI,RIG-I),主要识别并直接结合到某些5'端磷酸化RNA病毒,通过蛋白质-蛋白质接触方式,与其受体MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)也称作VISA(virus induced signaling adaptor)、IPS-1(IFN-promoter stimulating factor)或Cardif结合,活化TBK1和IKKe,激活转录因子NF-kB、IRF-3,引起I型干扰素分泌上调,发挥抗病毒效应。RIG-I途径除了在天然免疫中发挥抗病毒作用以外,也是一些病毒逃逸机体免疫的靶点,如HCV、HAV、GB病毒等。

维甲酸诱导基因Ⅰ研究进展

维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ),能在多种细胞中被不同的刺激诱导表达,是RNA病毒致天然免疫的重要调控因子.概述其发现、诱导、结构、功能、机理及同源蛋白等的研究现状,并展望相关动向.

北京鸭RIG-I基因的克隆及其生物信息学分析

应用RT-PCR方法,从北京鸭组织中扩增维甲酸诱导基因I(rerinotic acid inducible gene I,RIG-I),用DNA Star等生物软件分析其所含的生物信息,并构建系统进化树。扩增出的北京鸭RIG-I基因(Gen Bank登录号:KM455977)全长2 802 bp,编码933个氨基酸。RIG-I具有RLR家族的典型特征,即N端含两个半胱天冬酶活化和募集结构域,C端包括RNA解旋酶,ATP结合结构域,RNA结合结构域和抑制结构域,RIG-I蛋白二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。序列比对和系统进化分析结果表明,RIG-I的序列在同种之间比较保守,与已报道的鸭RIG-I的同源性高达98%以上;但与鹅RIG-I同源性稍低,为95.9%;与人、鼠、草鱼的同源性较低,分别为62.3%,61.5%,61.2%;与猪的同源性最低,仅为54.4%。成功克隆了鸭的RIG-I基因,可为今后开展鸭的天然免疫研究及研发新型疫苗等奠定基础。

敲除RIG-I基因的PK-15细胞系的建立及RIG-I对猪圆环病毒2型感染的作用

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建敲除RIG-I基因的PK-15细胞,初步探究视黄酸诱导基因I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)对猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)感染的作用。本研究根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计了针对猪RIG-I基因的2条sgRNA,构建重组载体pUC19-RIG-I-sgRNA1和pUC19-RIG-I-sgRNA2,转染PK-15细胞,通过流式细胞仪分选单细胞、测序、Western blot检测RIG-I敲除情况。PCV2感染细胞后,通过荧光定量PCR分析RIG-I及其下游分子mRNA水平,IPMA方法及TaqMan定量PCR检测病毒增殖水平。结果显示,筛选出的1株RIG-I基因缺失37 bp的PK-15细胞,Western blot检测RIG-I蛋白不表达。PCV2感染正常PK-15细胞48 h和72 h后,RIG-I mRNA水平上调,表明PCV2可激活RIG-I。敲除RIG-I基因,可下调MAVS、STING、IRF3、IFN-β的mRNA水平,抑制PCV2在PK-15细胞中复制,初步表明RIG-I信号通路促进PCV2在PK-15细胞中复制。本研究为PCV2感染的天然免疫机制研究提供了良好的细胞模型。