马岗鹅RIG-Ⅰ基因扩增及序列分析

为研究马岗鹅维甲酸诱导基因Ⅰ(Retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)的基因序列特征,试验扩增了马岗鹅RIG-Ⅰ基因,分析了马岗鹅RIG-Ⅰ基因序列并表达了其蛋白。结果显示:马岗鹅RIG-Ⅰ基因cDNA的开放阅读框全长为2 805 bp,编码934个氨基酸,蛋白分子量约为106.63 ku;马岗鹅RIG-Ⅰ蛋白具有2个串联的N端半胱天冬酶募集结构域、DExD/H-box RNA解旋酶结构域和C端结构域;马岗鹅RIG-Ⅰ与其它鸟类亲缘关系较近,与哺乳动物亲缘关系次之,与鱼类亲缘关系较远;马岗鹅RIG-Ⅰ蛋白结构以α-螺旋为主(占比50.21%),无规则卷曲次之(占比37.69%),延伸链较少(占比12.10%);马岗鹅RIG-Ⅰ真核表达质粒成功表达了约106 ku的蛋白。研究成功鉴定了马岗鹅RIG-Ⅰ基因并表达其蛋白,为进一步制备该蛋白的特异性抗体和研究鹅RIG-Ⅰ在抗病毒天然免疫中的功能奠定了基础。

敲低维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)抑制全反式维甲酸诱导的NB4急性早幼粒白血病细胞的分化

目的探讨慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)敲低NB4急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)对全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化的影响及其机制。方法将含有人RIG-Ⅰ基因shRNA序列(RIG-Ⅰ-shRNA)及含绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒感染NB4细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)及Western blot法分别检测ATRA诱导前后NB4细胞RIG-Ⅰ mRNA和蛋白水平;流式细胞术观察慢病毒感染效率和RIG-Ⅰ-shRNA对ATRA诱导NB4细胞分化的影响;Western blot法检测敲低RIG-Ⅰ水平后,ATRA处理对蛋白激酶B308位苏氨酸(AKT-Thr308)磷酸化的调控效应。结果含RIG-Ⅰ-shRNA序列的慢病毒可成功感染NB4细胞,下调ATRA诱导的RIG-Ⅰ水平;敲低RIG-Ⅰ后,明显抑制ATRA诱导NB4细胞分化,同时上调AKT-Thr308磷酸化水平。结论敲低NB4细胞RIG-Ⅰ蛋白可上调AKT-Thr308磷酸化水平抑制ATRA诱导的急性早幼粒白血病细胞分化。

小鼠Rig-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

【目的】进一步研究小鼠维甲酸诱导基因Ⅰ(Rig-Ⅰ)蛋白的细胞信号传导、结构与功能。【方法】利用已经构建好的逆转录病毒载体MigRI-Rig-Ⅰ,用PCR方法扩增出小鼠Rig-Ⅰ基因氨基端100 bp长度的片断(Rig-Ⅰ-N),将此片段定向克隆到原核表达载体pGEX-4T2中,构建pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N,再将Rig-Ⅰ基因剩余部分克隆到已构建有Rig-Ⅰ-N部分片段的pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N中,构建融合表达载体pGEX-4T2-Rig-Ⅰ,将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,对表达产物GST-Rig-Ⅰ融合蛋白进行纯化,制备抗体,并对抗体效价进行ELISA检测及抗体特异性的Western blot分析。【结果】重组蛋白GST-Rig-Ⅰ能在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白GST-Rig-Ⅰ纯化和洗脱后分子质量为130 ku,纯度>90%,制备的抗体效价达到1∶625 000,并且能够识别在原核表达系统以及真核细胞内表达的小鼠Rig-Ⅰ蛋白。【结论】建立的表达系统能够表达重组蛋白GST-Rig-Ⅰ,制备的抗体具有良好的免疫特异性。

视黄酸诱导基因-Ⅰ在家禽天然免疫应答中作用的研究进展

家禽的天然免疫应答在抵抗病毒感染的过程中起着关键性作用,视黄酸诱导基因-Ⅰ(retinoic acid inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ)作为细胞质内一类识别病毒双链RNA的模式识别受体,与天然免疫应答密切相关。它可通过RNA配体结合病原相关分子模式监测细胞质中的病毒RNA,此过程激活了RIG-Ⅰ及下游线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS),最终导致干扰素调节因子(IRF3/7)和核因子κB(NF-κB)活化,诱导产生Ⅰ型干扰素等免疫细胞因子,进而使细胞做出相应的抗病毒天然免疫反应。但由于鸡体内缺乏RIG-Ⅰ基因,目前大多将鸭源或鹅源RIG-Ⅰ基因转染鸡成纤维母细胞(DF-1)研究RIG-Ⅰ基因在鸡感染禽类病毒时是否具有免疫功能。文章介绍了RIG-Ⅰ在家禽体内的表达及其介导的抗病毒天然免疫信号通路,并简述了RIG-Ⅰ在家禽体内抗病毒作用的研究概况,为抑制家禽病毒的感染和免疫系统研究,以及研制新型抗病毒疫苗或免疫佐剂等提供参考。

RIG-I介导的TLR非依赖性模式识别

天然免疫在机体抗病毒感染的过程中发挥重要作用。近年来,识别和感受病原体的一系列模式识别受体受到广泛关注,TLR(Toll-like receptor)便是这一领域中的热点,随着研究的深入,一类TLR非依赖性模式识别受体,逐渐活跃在天然免疫识别的舞台,这其中,解旋酶(helicase)家族中的重要成员——维甲酸诱导基因I(retinoic acid-inducedgeneI,RIG-I),主要识别并直接结合到某些5'端磷酸化RNA病毒,通过蛋白质-蛋白质接触方式,与其受体MAVS(mitochondrial antiviral signaling protein)也称作VISA(virus induced signaling adaptor)、IPS-1(IFN-promoter stimulating factor)或Cardif结合,活化TBK1和IKKe,激活转录因子NF-kB、IRF-3,引起I型干扰素分泌上调,发挥抗病毒效应。RIG-I途径除了在天然免疫中发挥抗病毒作用以外,也是一些病毒逃逸机体免疫的靶点,如HCV、HAV、GB病毒等。