农杆菌介导TCS及RIP基因转化草莓的研究

采用农杆菌介导法,将TCS基因和RIP基因导入草莓中,探讨影响草莓遗传转化的主要因素,建立了高效的草莓遗传转化体系。并经Km抗性筛选,获得了若干转基因植株,对这些植株进行了TCS基因和RIP基因的PCR检测和PCR-Southern杂交检测,结果显示,TCS基因及RIP基因已转入草莓植株的基因组中。

BCL、RIP细胞凋亡基因向小麦中的导入和赤霉病抗性鉴定

利用农杆菌介导法将BCL和RIP 2个与细胞凋亡有关的基因分别导人了小麦品种扬麦10号和Bobwhite，转化效率分别为1．60％和1．25％。Southern检测结果表明，细胞凋亡基因已稳定整合到小麦染色体上，多数植株为单拷贝整合。Northern检测结果表明，细胞凋亡基因能够在小麦遗传背景中高水平转录为RNA。转基因植株T1代分离比例为2．11～2．33：1，表明外源基因在后代中能够稳定遗传。BCL转基因植株和RIP转基因植株对赤霉病均表现出一定抗性，其中BCL-20、BCL-21、RIP-8、RIP-18等15个T1代植株的小穗发病率为5．6％～16．1％，可望进一步培育抗赤霉病小麦新材料。

玉米(Zea mays L.)两个广谱抗病基因rip和pal1的原位杂交定位

本文以玉米自交系黄早四为供试材料,采用cDNA为探针,对低拷贝小片段的rip和pall基因进行了定位.用生物素标记和相应的酶联级联放大检测系统,在第8和第3染色体长臂上检测到rip基因的杂交信号,信号与着丝粒百分距离分别为23.66±1.32和72.47±3.16.在第5和第4染色体长臂以及第2染色体短臂上检测到pal1基因位点,信号与着丝粒的百分距离分别为20.85±1.08、61.63±2.21和28.23±0.82.

核糖体失活蛋白(RIP)基因克隆及其表达载体的构建

以按玉米RIP基因(M83927)序列设计合成的特异性引物,用提取的玉米基因组DNA为模板,应用PCR技术扩增目的片段,测定并克隆玉米的RIP基因。序列分析表明,它们的核苷酸和氨基酸序列与GenBank中登录的CRIP(M83927)的同源性分别为99.90%和100%。RIP与植物表达载体pCAMBIA2301相连构建成为带有35S启动子和polyA终止子的植物表达载体p2301-RIP。

转chi+rip双价抗真菌病基因大豆遗传稳定性分析

外源基因在转基因植物中遗传和表达的稳定性直接关系到转基因材料的应用前景。研究以转chi+rip双价基因大豆株系G0431、G0433的T2、T3及T4连续世代为材料,通过PCR、Southern杂交、Real-time PCR进一步证明外源基因已经整合到大豆基因组中,并稳定遗传给后代;Real-time RT-PCR、Western杂交以及抗疫霉根腐病测定结果表明,外源抗真菌病双价基因在各个转基因世代已稳定表达。研究结果为该材料的育种应用打下了坚实基础。

Rip1-Tag2转基因小鼠模型的生物学特性

目的研究胰腺癌Rip1-Tag2小鼠饲养管理及生物学特性。方法 Rip1-Tag2转基因小鼠饲养于SPF级环境中,记录小鼠的繁育情况。通过计数血性胰岛及肿瘤的数目,并测量肿瘤的体积,观察Rip1-Tag2小鼠肿瘤发生发展情况。通过组织病理学切片,观察Rip1-Tag2小鼠胰腺癌的病理学变化。结果 Rip1-Tag2小鼠已经成功繁育10代,共产仔620只。Rip1-Tag2小鼠肿瘤发生发展具有明显的阶段性:约6周出现血性胰岛,约8周出现肿瘤,并随着小鼠周龄的增加,肿瘤的数目和体积逐渐增多和增大。结论 Rip1-Tag2小鼠已被成功保种和扩群,具有较强的繁殖和适应能力,可稳定自发胰腺肿瘤,可作为研究肿瘤发生发展的经典动物模型。

hrpZpsta和RIPs双价抗病基因转化大豆的研究

构建了含有hrpZpsta和RIPs的双价抗病基因植物表达载体,采用农杆菌介导法,以大豆子叶节为外植体,将双价抗病基因hrpZpsta和RIPs转入大豆品种吉农28中,以耐盐基因BADH作为筛选标记基因、筛选得到T1阳性植株18株;T1转基因植株PCR、Southern杂交及RT-PCR检测表明外源基因已成功整合到了大豆基因组中并可遗传给后代。

转RIPs基因甜菜抗褐斑病性鉴定及生理特性分析

甜菜是重要的糖料作物之一,甜菜生产中病害较多,使其产量和品质受到严重威胁。核糖体失活蛋白(R IPs)是1类具有抑制病菌生长增殖的蛋白质,对真菌、细菌、病毒等具有广谱抗性。本实验对第1代转R IPs基因甜菜进行抗褐斑病鉴定,对鉴定植株的某些生理特性进行研究,结果表明R IPs基因不但可以提高甜菜对褐斑病的抗性,而且对甜菜植株的生长和生理代谢没有产生负面影响。

转RIPs基因甜菜的分子检测和抗病性鉴定

对利用农杆菌介导法转化的经卡那霉素筛选的转核糖体失活蛋白(RIPs)基因甜菜植株进行PCR和RT-PCR检测,并对分子检测呈阳性的转基因甜菜植株接种甜菜褐斑病菌,接种20d后,发现75%植株具有抗病性。

抗真菌、抗渗透胁迫基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化的研究

本研究以黄瓜为试材,建立黄瓜植株再生体系和遗传转化体系;构建了分别由双35S组成型启动子、E12强组成型启动子和rd29A诱导型启动子调控的核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和DREB1A基因的多价基因植物表达载体;利用农杆菌介导入法将其导入黄瓜优良品种,获得了转pBDCR T0及T1代PCR阳性植株。T1代转基因植株的抗逆性实验表明,DREB1A基因的表达可以提高黄瓜的抗旱性。本研究为培育抗逆境及抗真菌病转基因植株探索途径,并为进一步揭示核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和DREB1A基因的分子机理提供了理论依据。

大麦核糖体失活蛋白基因与天花粉蛋白基因双价植物表达载体的构建

大麦核糖体失活蛋白(B-RIP)和天花粉蛋白(TCS)均具有广谱抗病毒作用,研究构建了分别由2×CaMV35S启动子调控的大麦核糖体失活基因(rip)和天花粉蛋白基因(tcs)双价植物表达载体pABTR,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ),适用于双子叶植物的遗传转化。并通过三亲本杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为通过农杆菌介导法将双价基因导入植物,培育理想的抗病毒转基因植物奠定基础。

单增李斯特菌vip基因缺失菌株的构建与筛选

单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是广泛存在于自然界及食物中的食源性致病菌,作为胞内寄生菌,它可以引起强烈的细胞免疫,是潜在的优良疫苗载体。vip是单增李斯特菌的毒力基因,与其侵袭能力密切相关。因此构建vip基因敲除株可为单增李斯特菌疫苗载体的研发打下重要基础。从单增李斯特菌EGDe基因组中扩增出vip基因上、下游序列,连接到穿梭载体p KSV7中得到敲除载体p KSV7-Δvip,将其以电穿孔的方式转入单增李斯特菌后,通过同源重组利用氯霉素和温度双重压力筛选得到vip基因的敲除突变株,并对敲除菌株的生长曲线进行分析发现vip敲除对细菌的生长没有显著影响,为进一步研究vip基因功能、单增李斯特的致病机制和疫苗载体的研发提供参考。

Rip1-Tag2;PSGL-1^(-/-)小鼠模型的构建

目的构建Rip1-Tag2;PSGL-1-/-小鼠模型。方法将Rip1-Tag2小鼠与P-选择素糖蛋白配体敲除(PSGL-1 KO)小鼠杂交,剪尾提DNA后用PCR法检测小鼠的基因型。结果 Rip1-Tag2小鼠与PSGL-1KO小鼠杂交3代后,Rip1-Tag2;PSGL-1-/-小鼠模型构建成功。结论将Rip1-Tag2小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交3代后成功建立了Rip1-Tag2;PSGL-1-/-小鼠模型,并进行繁育。

特异性小干扰RNA靶向沉默RIP1基因表达对人大肠癌Lovo细胞生物学行为的影响

目的探讨RNA干扰沉默RIP1基因表达对人大肠癌Lovo细胞生物学行为的影响。方法将人大肠癌Lovo细胞常规分为空白对照、阴性对照组和实验转染组。体外化学合成RIP1基因序列特异性小干扰RNA(siRNA),Hegene介导转染人大肠癌细胞株Lovo细胞;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测特异性siRNA对RIP1基因在mRNA水平上沉默效果;转染后采用噻唑蓝(MrI'r)比色法检测siRNA对细胞增殖的影响;流式细胞周期法检测siRNA对细胞周期的影响;Transwell试验体外检测细胞迁移和侵袭能力。结果成功转染RIP1 siRNA的大肠癌Lovo细胞,RT-PCR显示RIP1 mRNA和蛋白表达在相应的癌细胞中明显下降;与阴性对照组比较,细胞增殖明显抑制(P<0.05);G0～G1期细胞[(54.68±1.54)%]明显多于阴性对照组[(48.48±1.96)%]和空白对照组[(43.92±1.68)%];RNA干扰明显抑制Lovo细胞迁移力和侵袭力(21±2.731vs.43±2.064)。结论 RIP1 siRNA可有效抑制大肠癌Lovo细胞RIP1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞迁移和侵袭,RIP1siRNA能有效调控Lovo细胞恶性生物学行为。

玉米RIPs基因导入马铃薯Shepody及检测

本研究以马铃薯品种‘Shepody’脱毒试管苗的叶片为试验材料,通过根癌农杆菌介导法,将来自玉米源的RIPs基因导入马铃薯,获得了抗性再生植株14株,PCR检测10株呈阳性,Southern印记杂交表明RIPs基因已整合到马铃薯基因组中。由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的晚疫病是马铃薯生产的最重要病害,该研究获得的含RIPs基因的马铃薯品种‘Shepody’在晚疫病抗性上将有所提高。本研究为马铃薯抗病新品种选育提供理论参考。