胡黄连苷Ⅱ调节RIP1/RIP3/MLKL信号对地塞米松诱导成骨细胞凋亡的影响

目的探讨胡黄连苷Ⅱ调节受体相互作用蛋白激酶(RIP)1/RIP3/混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)信号对地塞米松(DEX)诱导成骨细胞凋亡的影响。方法体外培养hFOB 1.19细胞,随机分为对照组、DEX组、DEX+胡黄连苷Ⅱ组、DEX+RIP1过表达组、DEX+空载质粒组、DEX+胡黄连苷Ⅱ+RIP1过表达组,分组处理后检测各组细胞活力、凋亡率、活性氧(ROS)相对水平、乳酸脱氢酶(LDH)、白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及IL-6释放量、BCL-2及BAX相对表达、RIP1/RIP3/MLKL信号蛋白表达。结果与对照组相比,DEX组细胞活力、BCL-2相对表达降低(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达升高(P<0.05)。与DEX组相比,DEX+胡黄连苷Ⅱ组细胞活力、BCL-2相对表达升高(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达降低(P<0.05);DEX+RIP1过表达组细胞活力、BCL-2相对表达降低(P<0.05),凋亡率、ROS相对水平、LDH及IL-1β、TNF-α、IL-6释放量、细胞BAX及RIP1、RIP3、MLKL蛋白相对表达升高(P<0.05);DEX+空载质粒组细胞各指标差异无统计学意义(P>0.05);过表达RIP1可减弱胡黄连苷Ⅱ对DEX诱导的hFOB 1.19细胞的作用。结论胡黄连苷Ⅱ可通过下调RIP1/RIP3/MLKL通路而减轻炎症,从而抑制DEX诱导的成骨细胞凋亡。

柚皮素下调RIP1-RIP3-MLKL信号通路抑制多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞凋亡

目的基于受体相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase,RIP)1-RIP3-混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like proteins,MLKL)介导的细胞坏死性凋亡途径,探究柚皮素对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、柚皮素组、RIP1抑制剂(Nec-1)组、RIP1-RIP3-MLKL坏死信号激活剂(Z-VAD-fmk)组、柚皮素+Z-VAD-fmk组,每组15只。ELISA法检测卵巢组织IL-1β、TNF-α水平;HE法观察卵巢形态;分离卵巢组织颗粒细胞,流式细胞术检测凋亡率及坏死率;免疫组化法检测卵巢组织磷酸化RIP1(p-RIP1)阳性表达;Western blot法检测RIP1-RIP3-MLKL途径相关蛋白表达。结果RIP1特异性抑制剂Nec-1和柚皮素可阻断RIP1磷酸化活化,抑制RIP1-RIP3-MLKL信号通路,并降低PCOS大鼠炎症水平,缓解卵巢颗粒细胞坏死及凋亡(P<0.05)。Z-VAD-fmk可促进RIP1-RIP3-MLKL途径活化,加重卵巢颗粒细胞凋亡,并部分减弱柚皮素的抗卵巢颗粒细胞凋亡作用(P<0.05)。结论柚皮素可能通过阻断RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡途径活化,抵抗PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。

柴胡桂枝干姜汤通过RIP1/RIP3/MLKL通路抑制坏死性凋亡改善大鼠非酒精性脂肪肝

【目的】探讨柴胡桂枝干姜汤对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠的治疗作用及机制。【方法】实验设正常组,模型组,中药(柴胡桂枝干姜汤)低、高剂量组及GSK872[受体相互作用蛋白激酶(RIP)3抑制剂]组等5组。除正常组,其余各组大鼠分别采用高脂饲料饲喂法构建NAFLD模型。治疗结束后,采用原位末端转移酶标记(TUNEL)法观察肝细胞凋亡情况,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测中血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),血脂[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)]水平及肝组织中炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)水平,Western Blot法检测肝组织中RIP1、RIP3、混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)磷酸化水平。【结果】与正常组比较,模型组大鼠肝细胞凋亡指数升高,血清中ALT、AST及TC、TG、LDL-C水平显著升高,HDL-C水平显著降低,肝组织中TNF-α、IL-1β含量及RIP1、RIP3、MLKL磷酸化表达水平均显著升高(P<0.05);与模型组比较,中药低、高剂量组及GSK872组大鼠肝细胞凋亡指数降低,血清中ALT、AST及TC、TG、LDL-C水平显著降低,HDL-C水平显著升高,肝组织中TNF-α、IL-1β含量及RIP1、RIP3、MLKL磷酸化表达水平均显著降低(P<0.05);中药低、高剂量组上述各指标与GSK872组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】柴胡桂枝干姜汤可以有效改善大鼠NAFLD,其机制可能与抑制RIP1/RIP3/MLKL信号通路活化,进而抑制坏死性凋亡有关。

川陈皮素调节RIP1/RIP3/MLKL信号通路对慢性心力衰竭大鼠心肌坏死性凋亡的影响

目的探究川陈皮素(Nob)调节受体相互作用蛋白激酶1/受体相互作用蛋白激酶3/混合谱系激酶样结构域蛋白(RIP1/RIP3/MLKL)信号通路对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌坏死性凋亡的影响及作用机制。方法于2022年9月—2023年3月在南方医科大学中心实验室进行实验。建立大鼠CHF模型,将造模成功的75只大鼠按随机数字表法分为模型组(CHF组)、川陈皮素低剂量组(Nob-L组,7.5 mg·kg-1·d^(-1)Nob)、川陈皮素中剂量组(Nob-M组,15 mg·kg-1·d^(-1)Nob)、川陈皮素高剂量组(Nob-H组,30 mg·kg-1·d^(-1)No b)和通路抑制剂Necrostatin-1组(Nec-1组,2.45 mg·kg-1·d^(-1)Nec-1),每组15只。另取15只大鼠作为假手术组(Sham组)只打开胸腔不进行结扎。干预28 d后,采用超声心动图检测左心室功能;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)水平;苏木精-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察心肌组织病理变化及纤维化情况;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)观察心肌组织凋亡情况;蛋白质印迹法(Western blot)检测心肌组织RIP1、RIP3、MLKL磷酸化水平及半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase-8)蛋白表达。结果与Sham组比较,CHF组心肌组织部分细胞损伤坏死、结构紊乱、心肌细胞肿胀、有大量的炎性细胞浸润,心肌组织胶原蛋白沉积和纤维化增加,与CHF组比较,Nob-L组、Nob-M组、Nob-H组和Nec-1组心肌纤维排列逐渐规则、心肌细胞肿胀、坏死及炎性细胞浸润减少、胶原沉积和纤维化减少。与Sham组比较,CHF组左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、IL-1β、TNF-α和MDA水平、细胞凋亡率、p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL表达显著增加,左心室射血分数(LVEF)、左心室轴缩短分数(FS)、SOD和T-AOC水平、Caspase-8表达显著降低;与CHF组比较,Nob-L组、Nob-M组、Nob-H组、Nec-1组上述指标均改善(F/P=102.557/<0.001、117.684/<0.001、364.401/<0.001、268.087/<0.001、124.566/<0.001、229.003/<0.001、193.585/<0.001、182.164/<0.001、142.657/<0.001,140.900/<0.001、169.680/<0.001、103.485/<0.001、108.277/<0.001、200.435/<0.001),且Nob-L组、Nob-M组、Nob-H组的干预效果呈剂量依赖性(P<0.05)。结论Nob可能通过抑制RIP1/RIP3/MLKL信号通路的激活,减轻炎性反应及氧化应激,抑制CHF大鼠的心肌坏死性凋亡,对CHF大鼠发挥保护作用。

RIP1、MLKL蛋白在未分化甲状腺癌中的表达及临床意义

目的探讨受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)、混合系激酶区域样蛋白(MLKL)在未分化甲状腺癌(ATC)中的表达及其临床意义。方法选取48例ATC患者为研究对象,检测手术标本组织中RIP1、MLKL的表达,收集患者临床病理参数并随访,统计分析RIP1、MLKL在ATC组织标本中的表达模式及对患者预后的影响。培养人未分化型甲状腺癌THJ-11T、THJ-16T、THJ-21T、ASH-3、BHT101细胞系、分化型甲状腺癌细胞系CAL-62、PDTC-1、正常人甲状腺细胞系Nthy-ori 3-1、HTORI-3,利用Western blot法及RT-PCR检测细胞系中RIP1、MLKL的蛋白mRNA的表达水平。结果(1)RT-PCR及Western blot检测显示,与正常人甲状腺细胞系及分化型甲状腺癌细胞系相比,未分化甲状腺癌细胞系中RIP1、MLKL蛋白和mRNA相对表达水平明显更高。(2)48例ATC患者中,14例起源于乳头状甲状腺癌(PTC),34例起源于滤泡状甲状腺癌(FTC)。肿瘤细胞表现出明显的多形性。形态学特征包括梭形细胞为主的肉瘤样及鳞状细胞样。(3)免疫组化染色显示,RIP1表达主要定位于ATC细胞膜。48例ATCs中有24例(50.0%)RIP1染色阳性。组织中含有混合岛状或低分化癌成分。MLKL阳性细胞核表达清晰,48例ATC患者中有29例(60.4%)患者MLKL染色阳性。(4)Kaplan-Meier生存分析显示,RIP1和MLKL过度表达会缩短ATC患者的无病生存期(DFS)(P<0.05),但对患者的总体生存率(OS)无明显影响(P>0.05)。Cox多因素分析显示,RIP1高表达、MLKL高表达、N分期、M分期均是影响ATC患者DFS的独立性危险因素(P<0.05)。结论RIP1、MLKL高表达与ATC的发生及DFS密切相关,或可作为ATC潜在的治疗靶点及预后预测的生物学标记物。

胞外酸化经ASIC1/RIP1途径抑制TFEB介导的巨噬细胞脂噬

目的 探讨胞外酸化对巨噬细胞脂噬的影响及其作用机制。方法 采用RAW264.7巨噬细胞,以pH 6.5培养液与25 mg/L氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)共孵育24 h构建胞外酸化诱导的泡沫细胞模型。分别以ASIC1特异性阻断剂PcTx-1和RIP1抑制剂Nec-1干预胞外酸化诱导的RAW264.7巨噬细胞24 h,油红O染色检测细胞内脂质蓄积;蛋白质印迹(Western blot)检测总ASIC1、膜ASIC1、p-RIP1 Ser166、p-TFEB Ser142、LC3和p62蛋白的表达;激光共聚焦显微镜观察脂滴(Bodipy示踪)与自噬标志物LC3II和LAMP1共定位;透射电镜观察细胞内脂滴和脂噬泡的数量变化;胆固醇荧光试剂盒检测ABCA1介导的胆固醇流出。结果 与pH 7.4组相比较,pH 6.5胞外酸化组胞内的脂质蓄积和细胞质膜上的ASIC1蛋白表达显著增加,p-RIP1Ser166、p-TFEB Ser142水平升高,LC3II蛋白减少和p62蛋白增加,脂滴与LC3II和LAMP1的共定位都分别减少,细胞内的脂滴数量显著增加,自噬体和脂噬泡的数量则明显减少,ABCA1介导的巨噬细胞内胆固醇流出显著减少。然而,胞外酸化对RAW264.7巨噬细胞的上述效应能被ASIC1特异性阻断剂PcTx-1和RIP1抑制剂Nec-1所取消。结论 胞外酸化经激活ASIC1/RIP1途径促进TFEB磷酸化抑制巨噬细胞脂噬,ASIC1可能是防治动脉粥样硬化等脂质蓄积疾病的新靶点。

麦冬皂苷D’通过RIP1/MLKL诱导前列腺癌PC3细胞程序性坏死

目的研究天然皂苷类化合物麦冬皂苷D’(Ophiopogonin D’,OPD’)对雄激素非依赖的前列腺癌PC3细胞的抗肿瘤效应及其机制。方法不同浓度的OPD’处理前列腺癌PC3细胞后,MTT实验检测细胞生长能力,流式细胞术检测Annexin V-Fitc和PI双染,Western blot检测程序性坏死相关蛋白——受体相互作用蛋白1(receptor interacting protein-1,RIP1)、混合谱系激酶结构区域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like,MLKL)的表达,结晶紫染色、透射电镜观察细胞形态学的改变。结果OPD’抑制PC3细胞生长活性,24 h IC50值为(6.25±0.31)μmol/L。5μmol/L OPD’处理24 h诱导PC3细胞凋亡和坏死,5μmol/L OPD’处理6 h PC3细胞在晚期凋亡/坏死象限呈明显的时间依赖关系(r=0.728,P<0.001)。OPD’诱导PC3细胞Caspase非依赖性死亡,且其死亡能被程序性坏死(necroptosis)特异性抑制剂necrostatin-1(Nec-1)所抑制(P=0.047),表明OPD’诱导PC3细胞程序性坏死。OPD’下调Cleaved-RIP1、上调RIP1的表达;上调p-MLKL四聚体的表达,并呈明显的时间依赖关系(r=0.907,P=0.005)。形态学上OPD’诱导PC3细胞坏死样改变。结论 OPD’抑制前列腺癌细胞生长具有明显的抗肿瘤效应,而诱导其通过RIP1/MLKL通路发生程序性坏死可能是其发挥抗肿瘤效应的机制之一。

siRNA沉默RIP1可增强奥沙利铂诱导口腔癌细胞的凋亡

目的探讨siRNA沉默受体相互作用蛋白激酶1(RIP1)增强奥沙利铂(L-OHP)诱导口腔癌细胞凋亡的作用,以期为口腔癌的临床治疗提供新的靶点。方法 MTT法检测不同浓度(0、0.25、0.5、1、2、4μmol/L)L-OHP对口腔癌细胞KB的增殖抑制作用;Western blotting检测L-OHP(1μmol/L)处理口腔癌细胞KB不同时间(0、6、16、24 h)RIP1的表达及siRNA转染沉默RIP1口腔癌细胞KB中RIP1的表达;PI/Annexin V双染法检测L-OHP(1μmol/L)对siRNA转染沉默RIP1后口腔癌细胞KB凋亡的影响,同时将未转染和转染空质粒口腔癌细胞KB作为空白和阴性对照。结果 1μmol/L L-OHP作用于口腔癌细胞KB 24、48、72 h细胞存活率分别为67.66%、55.17%和41.34%,但24 h细胞凋亡率仅为9.6%。用L-OHP刺激口腔癌细胞KB RIP1的表达随时间延长不断上升,而siRNA转染沉默RIP1后,RIP1表达明显下降。siRNA转染沉默RIP1后,细胞的凋亡率为9.4%,沉默RIP1并合用L-OHP进行刺激,细胞的凋亡率为29.1%,明显高于单用L-OHP组。结论抑制RIP1的表达可以增强奥沙利铂诱导口腔癌细胞的凋亡,为口腔癌的临床治疗提供了新的靶点。

RIP1增强顺铂诱导食管癌细胞的凋亡

目的探讨受体相互作用蛋白1(RIP1)增强顺铂(DDP)诱导食管癌细胞凋亡的敏感性。方法单溶液细胞增殖分析(MTS)法检测不同浓度DDP对食管癌细胞株KYSE510、KYSE410的增殖抑制作用;Annexin V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测RIP1、半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)、PARP的蛋白表达。结果 DDP诱导食管癌细胞凋亡具有剂量和时间相关性。凋亡率随剂量增加和时间延长升高,RIP1蛋白的表达升高,DDP联合RIP1特异性抑制剂处理食管癌细胞后,较敏感的KYSE510凋亡率明显减少。结论 RIP1可能参与了DDP诱导食管癌细胞凋亡的作用。

RIP1/RIP3-MLKL-信号通路与慢性心力衰竭的发生、发展及预后相关

目的通过检测正常人与慢性心力衰竭(HF)患者血浆中受体相互作用的蛋白激酶RIP1、RIP3和混合谱系激酶结构域样蛋白MLKL的表达水平,探讨程序性坏死信号通路RIP1/RIP3-MLKL在HF过程中的表达规律及临床意义。方法入选2020年2月~2020年10月在我院接受治疗的慢性HF患者(NYHAⅡ~Ⅳ级)。正常对照组(n=21),Ⅱ级(n=20),Ⅲ级(n=33),Ⅳ级(n=43)。采集所有患者的空腹静脉血,ELISA法和Western blotting分别检测RIP1/RIP3-MLKL表达水平和通路蛋白表达情况,同时对心功能Ⅳ级患者进行为期5个月的临床随访,评估临床预后指标。结果与正常对照组相比,心功能Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级组RIP1、RIP3、MLKL表达量均增加(P<0.01);与II级组相比,心功能Ⅲ、Ⅳ级组RIP1、RIP3、MLKL表达量均增加(P<0.01);与Ⅲ级组相比,心功能Ⅳ级组RIP1、MLKL表达量增加(P<0.05)。WB检测RIP1/RIP3-MLKL通路中各蛋白表达量,均存在上调趋势。经pearson相关性分析,HF患者RIP1/RIP3-MLKL表达量与Scr、AST、LVEDD、NT-ProBNP呈正相关(r=0.375、0.231、0.238、0.339、0.299、0.373、0.228、0.256、0.253、0.184、0.189、0.187,P<0.05),与LVEF呈负相关(r=-0.268、-0.234、-0.322,P<0.05)。此外对临床随访结果运用独立样本t检验分析,发现在心功能Ⅳ级患者中RIP1/RIP3-MLKL表达量更高组临床预后指标更差。结论RIP1-RIP3-MLKL信号通路在HF患者中表达明显增加,与HF严重程度呈正相关;慢性HF的发生、发展及预后可能与RIP1/RIP3-MLKL信号通路的激活与表达有关。

Rip1-Tag2;PSGL-1^(-/-)小鼠模型的构建

目的构建Rip1-Tag2;PSGL-1-/-小鼠模型。方法将Rip1-Tag2小鼠与P-选择素糖蛋白配体敲除(PSGL-1 KO)小鼠杂交,剪尾提DNA后用PCR法检测小鼠的基因型。结果 Rip1-Tag2小鼠与PSGL-1KO小鼠杂交3代后,Rip1-Tag2;PSGL-1-/-小鼠模型构建成功。结论将Rip1-Tag2小鼠与PSGL-1 KO小鼠杂交3代后成功建立了Rip1-Tag2;PSGL-1-/-小鼠模型,并进行繁育。

脂联素通过抑制RIP1/RIP3表达对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用

目的探讨脂联素对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用。方法选择30只雄性健康C57BL/6小鼠作为研究对象,其中10只小鼠作为对照组,20只小鼠采用链脲佐菌素(STZ)构建糖尿病肾病(DN)模型。Apn组DN小鼠单次腹腔注射2 mg/kg Apn,每天注射1次,持续6周。STZ处理后10周检测各组小鼠体质量(BW)、左肾质量(KW)、左肾质量/体质量(KW/BW)、平均肾小球体积(MGV),检测肌酐清除率(Ccr)、24 h尿蛋白。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测小鼠肾脏组织TNF-α、IL-6的水平。采用苏木精-伊红(HE)染色观察和评定小鼠肾脏组织的病理变化。采用Western blot法检测小鼠肾脏组织中RIP1、RIP3蛋白的表达水平。结果18只小鼠成功构建DN模型,死亡2只。模型组和Apn组小鼠的BW低于对照组,KW、KW/BW以及MGV均高于对照组,且Apn组小鼠的BW比模型组高,KW、KW/BW以及MGV比模型组低,差异均有统计学意义(P<0.01)。模型组和Apn组小鼠的肾脏组织中的TNF-α、IL-6水平以及RIP1、RIP3蛋白的表达水平均明显高于对照组,且Apn组小鼠肾组织中TNF-α、IL-6水平以及RIP1、RIP3蛋白的表达水平均明显低于模型组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论脂联素可能通过RIP1/RIP3通路抑制细胞凋亡坏死,从而减轻糖尿病肾病肾组织的炎症反应和损伤,延缓肾组织的增生,保护肾脏组织。

抑制SHARPIN激活Rip1促进LNCaP-AI细胞坏死性凋亡

目的:探讨SHARPIN对去势抵抗性前列腺癌细胞LNCaP-AI坏死性凋亡关键因子Rip1的调控作用,以及对细胞坏死性凋亡的影响。方法:将LNCaP-AI细胞分为TNF-α+Z-VAD(caspase抑制剂)处理组与TNF-α+Z-VAD+Nec-1(Rip1抑制剂)处理组,应用MTS检测各组细胞的活力,研究坏死性凋亡机制在诱导LNCaP-AI细胞死亡中的作用。将LNCaP-AI细胞分为阴性对照组和SHARPIN干扰(si-SHARPIN)组,RT-qPCR验证抑制效率,通过免疫荧光等技术进一步探讨SHARPIN调控坏死性凋亡的具体分子机制。结果:与对照组相比,TNF-α+Z-VAD处理组的LNCaP-AI细胞活力下降28%(P<0.05),而TNF-α+Z-VAD+Nec-1处理组的细胞在Rip1被抑制后,细胞活力无明显改变。在LNCaP-AI细胞中,通过siRNA抑制SHARPIN表达后,Rip1表达水平上调,同时,LNCaP-AI细胞坏死性凋亡比例升高。结论:LNCaP-AI细胞可通过坏死性凋亡机制诱导死亡,下调SHARPIN可能通过激活Rip1增强LNCaP-AI细胞坏死性凋亡。

瞬时受体电位通道M7和程序性坏死标志物RIP1在大鼠肾脏缺血再灌注损伤中的表达及意义

目的观察大鼠缺血再灌注损伤模型中,瞬时受体电位通道M7(trallsient receptor potential melastatiIl related7,TRPM7)的表达变化及其与肾组织病理损伤、程序性坏死标志物RIP1、聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶-1(PARP-1)表达变化的关系,初步探讨TRPM7在肾脏缺血再灌注损伤细胞程序性坏死中的作用及其可能的机制。方法 55只雄性SD大鼠建立缺血再灌注模型后,于再灌注后24、48 h、5、7 d取动脉血检测大鼠血肌酐、尿素氮水平;肾组织标本HE染色观察肾组织病理损伤;免疫组化和Western blot检测肾组织TRPM7、PARP-1、RIP1定位及表达变化。结果对照组和假手术组相比,血肌酐尿素氮水平、肾脏组织形态无明显变化;与对照组、假手术组相比,缺血再灌注后大鼠血肌酐尿素氮水平明显升高,再灌注后24 h达到最高值,随后逐渐下降,7 d左右降至接近正常。HE染色显示肾组织在再灌注24、48 h均出现明显急性肾小管损伤,5 d时开始修复,至第7天基本修复。免疫组化及Western blot显示,TRPM7主要在肾小管上皮细胞表达,再灌注后TRPM7表达显著升高,其中24 h达高峰,随后逐渐下降。PARP-1、RIP1的表达变化有相似的趋势。相关性分析显示TRPM7表达变化与肾小管急性损伤评分呈正相关(r=0.71,P<0.05)。结论瞬时受体电位通道M7可能参与了肾脏缺血再灌注损伤,通过下游钙依赖的信号传导途径调控PARP-1、RIP1影响程序性坏死发挥作用。

RIP1蛋白在紫草素诱导人结肠癌SW480细胞凋亡中的作用及机制研究

目的探讨紫草素(Shikonin,SK)对结肠癌SW480细胞RIP1蛋白的表达及其对细胞的增殖和凋亡的影响。方法 MTT法检测不同浓度SK(0、1、2、4、8μmol/L)作用SW480细胞24、48、72 h细胞的增殖抑制作用; DAPI染色观察探讨SK处理24 h对SW480细胞凋亡的影响; PI单染色法检测不同浓度SK(0、1、2、4、8μmol/L)作用SW480细胞24 h细胞凋亡率; Western blot法检测SK对SW480细胞RIP1蛋白表达的影响。结果 SK作用24 h,随SK浓度增加,细胞存活率降低(P<0.05)。DAPI荧光染色结果显示,随SK浓度(1、2、4、8μmol/L)增加,荧光染色后的细胞密度呈现减少趋势,细胞逐渐变圆形,细胞核呈固缩状态。1、2、4、8μmol/L SK作用于SW480细胞,凋亡率分别为(7.2±0.54)%、(13.6±1.23)%、(40.7±4.92)%和(84.3±5.43)%,与对照组[(5.3±1.02)%]比较差异有统计学意义(P<0.05)。SK作用SW480细胞24 h,RIP1(receptor-interacting kinase 1)蛋白表达呈增加趋势,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 SK可抑制结肠癌SW480细胞增殖,其诱导凋亡机制可能与RIP1蛋白表达上调有关。

Rip1-Tag2转基因小鼠模型的生物学特性

目的研究胰腺癌Rip1-Tag2小鼠饲养管理及生物学特性。方法 Rip1-Tag2转基因小鼠饲养于SPF级环境中,记录小鼠的繁育情况。通过计数血性胰岛及肿瘤的数目,并测量肿瘤的体积,观察Rip1-Tag2小鼠肿瘤发生发展情况。通过组织病理学切片,观察Rip1-Tag2小鼠胰腺癌的病理学变化。结果 Rip1-Tag2小鼠已经成功繁育10代,共产仔620只。Rip1-Tag2小鼠肿瘤发生发展具有明显的阶段性:约6周出现血性胰岛,约8周出现肿瘤,并随着小鼠周龄的增加,肿瘤的数目和体积逐渐增多和增大。结论 Rip1-Tag2小鼠已被成功保种和扩群,具有较强的繁殖和适应能力,可稳定自发胰腺肿瘤,可作为研究肿瘤发生发展的经典动物模型。

RIP1-RIP3-MLKL信号通路在急性冠状动脉综合征病人外周血单核细胞中的表达

目的:研究急性冠状动脉综合征(ACS)病人外周血单核细胞(PBMCs)上刺激受体相互作用蛋白1(RIP1)-RIP3-混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)信号通路的表达变化,并分析其可能机制。方法:选取初诊为ACS病人60例,其中不稳定型心绞痛(UAP)病人31例,急性心肌梗死(AMI)病人20例,对照组选取同期健康体检者19名。采集所有受试者外周静脉血,分别提取血浆和外周血单核细胞(PBMCs),酶联免疫吸附实验(ELISA)和比浊法分别检测血浆中白细胞介素(IL)-1和IL-18、MLKL的水平,运用Real Time-PCR检测MLKL的mRNA表达,免疫印迹法检测PBMCs中RIP1、RIP3和MLKL的蛋白表达。结果:3组受试者血浆IL-1、IL-18含量和MLKL含量差异均有统计学意义(P<0.01),PBMCs中RIP1和RIP3蛋白表达增加(P<0.05),MLKL的mRNA和蛋白表达亦增加(P<0.05)。与UAP组比较,AMI组病人外周血浆中IL-1、IL-18和MLKL进一步升高,RIP1和RIP3的蛋白表达的进一步增加(P<0.05),MLKL的mRNA和蛋白表达增高。结论:UAP和AMI病人体内存在不同程度的炎症活化,RIP1-RIP3-MLKL信号通路在PBMCs中的表达量随病情的严重程度逐渐增加,提示RIP1-RIP3-MLKL信号通路可能在ACS的不同类型发病中起重要作用。

RIP1/RIP3通路在大鼠急性脑梗死中的作用

目的探讨程序性坏死信号通路受体相互作用蛋白-1/受体相互作用蛋白-3(RIP1/RIP3)通路在急性脑梗死中的表达和作用。方法将36只雄性Wistar大鼠随机分为3组,每组12只,分别为急性脑梗死组(采用改良Longa线栓法制作急性脑梗死大鼠模型,通过Zea longa 5分制评分法进行神经功能缺损评分并鉴定模型的成功)、对照组(对照组手术步骤同急性脑梗死组,但不插入线栓)和5-(1H-吲哚-3-基甲基)-3-甲基-2-硫酮-4-咪唑烷酮(Nec-1)组(在急性脑梗死模型建立后,按0.6 mg/kg腹腔注射RIP1特异性抑制剂Nec-1溶液,连续注射7 d)。所有大鼠均在7 d后断头取脑组织。采用Western blot分别检测海马RIP1和RIP3表达,ELISA法检测海马肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)表达。结果与对照组比较,急性脑梗死组中海马RIP1/RIP3表达明显增加,炎症因子TNF-α、IL-6分泌增加(P <0.05);Nec-1可显著降低急性脑梗死组海马RIP1和RIP3表达,抑制TNF-α、IL-6分泌,与急性脑梗死组比较,差异具有统计学意义(P <0.05)。结论 RIP1/RIP3通路参与调控急性脑梗死,其抑制剂Nec-1可通过下调RIP1/RIP3通路,抑制炎症,减轻神经元损伤。

缺氧/复氧通过激活程序性坏死RIP1/RIP3信号诱导心肌细胞坏死

目的:研究缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)刺激是否可通过激活程序性坏死信号通路诱导心肌细胞坏死。方法 :体外培养新生大鼠原代心肌细胞,采用缺氧2 h复氧4 h的方法复制心肌细胞损伤模型,碘化丙腚(propidium iodide,PI)染色检测心肌细胞坏死情况,Western blot和免疫共沉淀方法检测程序性坏死信号通路中受体相互作用蛋白1(receptor interacting protein-1,RIP1)、受体相互作用蛋白3(receptor interacting protein-3,RIP3)的蛋白表达水平和RIP1/RIP3复合物Ⅱ形成情况,以及RIP1、RIP3的泛素化水平。结果:与对照组相比,缺氧/复氧组心肌细胞坏死数量明显增多,RIP1、RIP3蛋白表达水平显著升高,RIP1/RIP3复合物Ⅱ的形成增多,且RIP1与RIP3的泛素化水平也有所增加。结论:缺氧复氧可诱导心肌细胞坏死,其机制可能与激活程序性坏死RIP1/RIP3信号通路有关。

受体相互作用蛋白激酶RIP1在细胞信号传导途径中作用的研究进展

受体相互作用蛋白1是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可以通过激活NF-κB、活化caspase-8、参与活性氧的产生等,在细胞凋亡、细胞存活及细胞程序性坏死等信号传导中起关键作用,其功能受泛素化、锌指蛋白及热休克蛋白等的调节。