柚皮素下调RIP1-RIP3-MLKL信号通路抑制多囊卵巢综合征大鼠卵巢颗粒细胞凋亡

目的基于受体相互作用蛋白激酶(receptor interacting protein kinase,RIP)1-RIP3-混合谱系激酶结构域样蛋白(mixed lineage kinase domain-like proteins,MLKL)介导的细胞坏死性凋亡途径,探究柚皮素对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、柚皮素组、RIP1抑制剂(Nec-1)组、RIP1-RIP3-MLKL坏死信号激活剂(Z-VAD-fmk)组、柚皮素+Z-VAD-fmk组,每组15只。ELISA法检测卵巢组织IL-1β、TNF-α水平;HE法观察卵巢形态;分离卵巢组织颗粒细胞,流式细胞术检测凋亡率及坏死率;免疫组化法检测卵巢组织磷酸化RIP1(p-RIP1)阳性表达;Western blot法检测RIP1-RIP3-MLKL途径相关蛋白表达。结果RIP1特异性抑制剂Nec-1和柚皮素可阻断RIP1磷酸化活化,抑制RIP1-RIP3-MLKL信号通路,并降低PCOS大鼠炎症水平,缓解卵巢颗粒细胞坏死及凋亡(P<0.05)。Z-VAD-fmk可促进RIP1-RIP3-MLKL途径活化,加重卵巢颗粒细胞凋亡,并部分减弱柚皮素的抗卵巢颗粒细胞凋亡作用(P<0.05)。结论柚皮素可能通过阻断RIP1-RIP3-MLKL介导的坏死性凋亡途径活化,抵抗PCOS大鼠卵巢颗粒细胞凋亡。

RIP1-RIP3-MLKL信号通路在急性冠状动脉综合征病人外周血单核细胞中的表达

目的:研究急性冠状动脉综合征(ACS)病人外周血单核细胞(PBMCs)上刺激受体相互作用蛋白1(RIP1)-RIP3-混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)信号通路的表达变化,并分析其可能机制。方法:选取初诊为ACS病人60例,其中不稳定型心绞痛(UAP)病人31例,急性心肌梗死(AMI)病人20例,对照组选取同期健康体检者19名。采集所有受试者外周静脉血,分别提取血浆和外周血单核细胞(PBMCs),酶联免疫吸附实验(ELISA)和比浊法分别检测血浆中白细胞介素(IL)-1和IL-18、MLKL的水平,运用Real Time-PCR检测MLKL的mRNA表达,免疫印迹法检测PBMCs中RIP1、RIP3和MLKL的蛋白表达。结果:3组受试者血浆IL-1、IL-18含量和MLKL含量差异均有统计学意义(P<0.01),PBMCs中RIP1和RIP3蛋白表达增加(P<0.05),MLKL的mRNA和蛋白表达亦增加(P<0.05)。与UAP组比较,AMI组病人外周血浆中IL-1、IL-18和MLKL进一步升高,RIP1和RIP3的蛋白表达的进一步增加(P<0.05),MLKL的mRNA和蛋白表达增高。结论:UAP和AMI病人体内存在不同程度的炎症活化,RIP1-RIP3-MLKL信号通路在PBMCs中的表达量随病情的严重程度逐渐增加,提示RIP1-RIP3-MLKL信号通路可能在ACS的不同类型发病中起重要作用。

基于CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路的黄芪-丹参配伍对缺氧/复氧诱导的H9C2细胞坏死性凋亡的影响

目的观察黄芪-丹参配伍对缺氧/复氧诱导的H9C2心肌细胞坏死性凋亡的影响,基于CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路探讨其作用机制。方法体外培养H9C2细胞,建立缺氧/复氧模型。将细胞分为对照组、模型组、黄芪丹参+激活剂(油酸)组、黄芪丹参组和抑制剂(KN-93磷酸盐)组,分别于相应培养基培养。试剂盒检测细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)水平,流式细胞术检测细胞凋亡,RT-qPCR和Western blot检测钙调蛋白激酶(CaMK)Ⅱδ、受体相互作用蛋白激酶(RIPK)1、RIPK3、混合系激酶区域样蛋白(MLKL)mRNA和蛋白表达。结果与对照组比较,模型组细胞上清液LDH水平显著升高(P<0.01),细胞凋亡率显著升高(P<0.01),CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA和蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,黄芪丹参组细胞上清液LDH水平显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著降低(P<0.01),CaMKⅡδ、RIPK1、RIPK3和MLKL mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01)。黄芪丹参作用与CaMKⅡδ抑制剂KN-93磷酸盐相当。结论黄芪-丹参配伍可减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤,抑制心肌细胞坏死性凋亡,其机制与下调CaMKⅡδ-RIPK1/RIPK3-MLKL通路有关。

柴胡桂枝干姜汤通过RIP1/RIP3/MLKL通路抑制坏死性凋亡改善大鼠非酒精性脂肪肝

【目的】探讨柴胡桂枝干姜汤对非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠的治疗作用及机制。【方法】实验设正常组,模型组,中药(柴胡桂枝干姜汤)低、高剂量组及GSK872[受体相互作用蛋白激酶(RIP)3抑制剂]组等5组。除正常组,其余各组大鼠分别采用高脂饲料饲喂法构建NAFLD模型。治疗结束后,采用原位末端转移酶标记(TUNEL)法观察肝细胞凋亡情况,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测中血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST),血脂[总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)]水平及肝组织中炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)水平,Western Blot法检测肝组织中RIP1、RIP3、混合谱系激酶结构域样蛋白(MLKL)磷酸化水平。【结果】与正常组比较,模型组大鼠肝细胞凋亡指数升高,血清中ALT、AST及TC、TG、LDL-C水平显著升高,HDL-C水平显著降低,肝组织中TNF-α、IL-1β含量及RIP1、RIP3、MLKL磷酸化表达水平均显著升高(P<0.05);与模型组比较,中药低、高剂量组及GSK872组大鼠肝细胞凋亡指数降低,血清中ALT、AST及TC、TG、LDL-C水平显著降低,HDL-C水平显著升高,肝组织中TNF-α、IL-1β含量及RIP1、RIP3、MLKL磷酸化表达水平均显著降低(P<0.05);中药低、高剂量组上述各指标与GSK872组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。【结论】柴胡桂枝干姜汤可以有效改善大鼠NAFLD,其机制可能与抑制RIP1/RIP3/MLKL信号通路活化,进而抑制坏死性凋亡有关。

川陈皮素调节RIP1/RIP3/MLKL信号通路对慢性心力衰竭大鼠心肌坏死性凋亡的影响

目的探究川陈皮素(Nob)调节受体相互作用蛋白激酶1/受体相互作用蛋白激酶3/混合谱系激酶样结构域蛋白(RIP1/RIP3/MLKL)信号通路对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌坏死性凋亡的影响及作用机制。方法于2022年9月—2023年3月在南方医科大学中心实验室进行实验。建立大鼠CHF模型,将造模成功的75只大鼠按随机数字表法分为模型组(CHF组)、川陈皮素低剂量组(Nob-L组,7.5 mg·kg-1·d^(-1)Nob)、川陈皮素中剂量组(Nob-M组,15 mg·kg-1·d^(-1)Nob)、川陈皮素高剂量组(Nob-H组,30 mg·kg-1·d^(-1)No b)和通路抑制剂Necrostatin-1组(Nec-1组,2.45 mg·kg-1·d^(-1)Nec-1),每组15只。另取15只大鼠作为假手术组(Sham组)只打开胸腔不进行结扎。干预28 d后,采用超声心动图检测左心室功能;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)水平;苏木精-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察心肌组织病理变化及纤维化情况;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)观察心肌组织凋亡情况;蛋白质印迹法(Western blot)检测心肌组织RIP1、RIP3、MLKL磷酸化水平及半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase-8)蛋白表达。结果与Sham组比较,CHF组心肌组织部分细胞损伤坏死、结构紊乱、心肌细胞肿胀、有大量的炎性细胞浸润,心肌组织胶原蛋白沉积和纤维化增加,与CHF组比较,Nob-L组、Nob-M组、Nob-H组和Nec-1组心肌纤维排列逐渐规则、心肌细胞肿胀、坏死及炎性细胞浸润减少、胶原沉积和纤维化减少。与Sham组比较,CHF组左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、IL-1β、TNF-α和MDA水平、细胞凋亡率、p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL表达显著增加,左心室射血分数(LVEF)、左心室轴缩短分数(FS)、SOD和T-AOC水平、Caspase-8表达显著降低;与CHF组比较,Nob-L组、Nob-M组、Nob-H组、Nec-1组上述指标均改善(F/P=102.557/<0.001、117.684/<0.001、364.401/<0.001、268.087/<0.001、124.566/<0.001、229.003/<0.001、193.585/<0.001、182.164/<0.001、142.657/<0.001,140.900/<0.001、169.680/<0.001、103.485/<0.001、108.277/<0.001、200.435/<0.001),且Nob-L组、Nob-M组、Nob-H组的干预效果呈剂量依赖性(P<0.05)。结论Nob可能通过抑制RIP1/RIP3/MLKL信号通路的激活,减轻炎性反应及氧化应激,抑制CHF大鼠的心肌坏死性凋亡,对CHF大鼠发挥保护作用。

生肌散抑制RIP1/RIP3/MLKL通路介导大鼠压疮形成实验研究

目的:探讨生肌散在治疗大鼠压疮中的相关作用机制。方法:将60只SPF雄性SD大鼠随机分成对照组、模型组、治疗组,每组各20只。模型组制作Ⅲ期大鼠压疮模型,成模后,创面外敷0.9%氯化钠溶液纱布,2次/d,共7 d;对照组仅同部位埋入磁铁不予磁性加压,其余处理同模型组;治疗组成模后,创面外敷生肌散2 mg,2次/d,共7 d,其余处理同模型组。创面处理7 d后,比较各组大鼠局部皮肤组织病理学改变、受体相互作用蛋白激酶-1(RIP1)、受体相互作用蛋白激酶-3(RIP3)和混合系列激酶样结构域(MLKL)的表达、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、炎症介质白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的差异。结果:肉眼及光镜观察可见,治疗组大鼠压疮组织病理学改变均较模型组明显改善;与对照组比较,模型组RIP1、RIP3和MLKL表达、MDA及IL-1β、TNF-α含量均明显增高(均P<0.05);与模型组比较,治疗组RIP1、RIP3和MLKL表达、MDA及IL-1β、TNF-α含量均明显减少(均P<0.05)。结论:生肌散可通过抑制RIP1/RIP3/MLKL通路介导的程序性细胞坏死,减轻脂质过氧化与炎症反应的发生发展,促进大鼠压疮创面的愈合。

颅内动脉瘤患者血清hsa-miR-513b-5p水平及作用机制研究

目的探讨血清hsa-miR-513b-5p在颅内动脉瘤患者中的表达水平及其可能的作用机制。方法收集颅内动脉瘤患者(颅内动脉瘤组)和无颅内动脉瘤的志愿者(对照组)各100例,采用定量逆转录PCR(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)技术测定血清hsa-miR-513b-5p、肿瘤坏死因子(TNF-α)、MMP2、MMP3、MMP9(基质金属蛋白酶,MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂4(TIMP4)水平。采用hsa-miR-513b-5p模拟物和抑制剂转染人血管平滑肌细胞(human aortic smooth muscle cells,HASMC),检测细胞增殖、凋亡和坏死变化。通过双荧光素酶报告基因分析hsa-miR-513b-5p的作用靶点COL1A1,并分析影响颅内动脉瘤形成的信号通路。结果颅内动脉瘤组患者高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、TNF-α、MMP2、MMP3、MMP9水平高于对照组(P<0.05),而低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、N末端B型利钠肽原(NT-proBNP)、血浆总同型半胱氨酸(Hcy)和TIMP4水平降低(P<0.05)。与对照组相比,颅内动脉瘤组患者血清hsa-miR-513b-5p表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。经has-miR-513b-5p模拟物转染的HASMC,与模拟物对照组比较,其细胞增殖能力降低,而凋亡和坏死水平增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。经has-miR-513b-5p抑制剂转染的HASMC,与抑制剂对照组比较,其细胞增殖能力增强,而凋亡和坏死水平下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶检测结果显示has-miR-513b-5p可靶向抑制COL1A1表达,并上调RIP1-RIP3-MLKL和MMPs信号通路,抑制HASMC增殖和细胞外基质合成。结论血清hsa-miR-513b-5p在颅内动脉瘤患者中表达水平下降,并参与调节血管平滑肌细胞增殖和细胞外基质合成影响动脉瘤形成。

基于RIP1/RIP3/NLRP3信号通路探讨祛瘀生新方治疗溃疡性结肠炎小鼠的作用机制

目的:研究祛瘀生新方对溃疡性结肠炎(UC)小鼠的治疗效果以及对RIP1/RIP3/NLRP3信号通路的调节作用。方法:将36只小鼠随机分为实验组(祛瘀生新组)、模型组、阳性对照组(美莎拉嗪组)、空白组、中药拆方1组(生新组)、中药拆方2组(祛瘀组),6只/组,采用3.5%葡聚糖硫酸钠盐(DSS)溶液自由饮水法制备UC小鼠模型,7 d后进行相应药物干预,每天称重小鼠,评估DAI积分,灌胃7 d后处死小鼠取结肠组织并测量长度。对结肠进行苏木精-伊红染色观察各组小鼠结肠组织形态变化及病理学评分情况。采用RT-qPCR、ELISA检测并比较各组小鼠结肠中RIP1、RIP3、NLRP3、IL-1βmRNA及其蛋白表达水平。结果:干预前非空白组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05);祛瘀生新组、模型组、美莎拉嗪组、生新组、祛瘀组小鼠结肠长度明显短于空白组(P<0.05);中药组、美莎拉嗪组、空白组与祛瘀组DAI评分低于模型组(P<0.05);各组病理评分均低于模型组(P<0.05);各组RIP1、RIP3、IL-1βmRNA明显低于模型组(P<0.05);其中祛瘀组NLRP3 mRNA与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05);祛瘀生新组与美莎拉嗪组RIP1、RIP3、NLRP3、IL-1βmRNA水平比较,差异无统计学意义(P>0.05);祛瘀组IL-1βmRNA低于生新组(P<0.05);生新组NLRP3 mRNA低于祛瘀组(P<0.05)。各组RIP1、NLRP3、IL-1β与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01);而祛瘀生新组RIP3、IL-1β与空白组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:祛瘀生新方对UC有一定的治疗作用,其中祛瘀中药和生新中药需要配合使用方能达到更好效果,可能是通过RIP1/RIP3/NLRP3通路抑制RIP1、RIP3、NLRP3、IL-1β的表达控制炎症而起作用。

紫草素诱导非小细胞肺癌A549细胞程序性坏死的实验研究

目的探讨紫草素(SHI)通过调节受体相互作用蛋白1(RIP1)/受体相互作用蛋白3(RIP3)/混合系激酶区域样蛋白(MLKL)轴诱导非小细胞肺癌A549细胞程序性坏死的作用机制。方法体外培养A549细胞,MTT法检测SHI对细胞增殖活性的影响;AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡和死亡;Western blotting法检测细胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表达。DCFH-DA探针检测A549细胞中活性氧(ROS)生成水平。结果SHI作用24h后,A549细胞的半数抑制浓度(IC 50)为(19.62±1.53)μmol/L。与空白组比较,SHI组细胞凋亡率、死亡率均显著增加(P<0.05);此外caspase-3和caspase-8荧光活性增加也显著增加(P<0.05)。Western blotting结果显示,SHI组A549细胞RIP1蛋白、RIP3蛋白、p-MLKL/MLKL比值均升高;而经Nec-1预先干预后,RIP1蛋白、RIP3蛋白、p-MLKL/MLKL比值则降低(P<0.05)。另外,与空白组比较,SHI组DCFH-DA相对荧光强度升高(4.53±0.44)倍,而经SHI+NAC组相对荧光强度降低为空白组的(2.17±0.25)倍(P<0.05)。结论紫草素可通过RIP1/RIP3/MLKL通路诱导A549细胞发生程序性坏死,进而抑制细胞增殖活力,具有明显的抗肿瘤效应。

大承气汤干预重症急性胰腺炎并发肝损伤的作用机制

目的探讨大承气汤对重症急性胰腺炎并发肝损伤小鼠的影响。方法 40只小鼠随机分为正常组、模型组及大承气汤低、中、高剂量组(5、10、20 g/kg),每组8只。采用雨蛙素(50μg/kg)联合脂多糖(7.5 mg/kg)腹腔注射造模,并于造模前30 min及造模后3、6 h用不同剂量的大承气汤灌胃3次,造模后10 h收集样本。ELISA法检测各组血清淀粉酶、TNF-α、ALT、AST水平,HE染色观察各组小鼠胰腺及肝脏的病理改变,Western blot、RT-PCR法分别检测肝组织RIP1、RIP3、TNF-α、MCP1蛋白及mRNA表达。结果与模型组相比,大承气汤组血清学指标(淀粉酶、TNF-α、ALT、AST)及胰腺、肝损伤好转(P<0.01),RIP3、TNF-α、MCP1蛋白及mRNA表达降低(P<0.01)。结论大承气汤可减轻雨蛙素联合脂多糖引起的SAP并发肝损伤小鼠模型,其机制可能与抑制RIP3-MCP1信号通路、减轻炎性反应有关。