RIP3/CaMKⅡ信号通路对重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响

目的:观察RIP3/CaMKⅡ信号通路对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的重症病毒性心肌炎小鼠心脏功能及生存曲线的影响,并探讨CaMKⅡ特异性抑制剂KN-93对心肌损伤的作用。方法:将60只雄性BALB/c小鼠分为正常对照组、CVB3组、CVB3+KN-93组和CVB3+KN-93+Ti(活性氧簇特异性抑制剂)组,以上小鼠腹腔及尾静脉注射药物连续7 d。采用双抗体夹心免疫法检测小鼠心肌细胞坏死标志物,心脏超声技术检测小鼠心脏结构和功能,绘制Kaplan-Meier生存曲线,观察KN-93对小鼠心肌的保护作用。结果:CVB3+KN-93组小鼠心肌细胞坏死较CVB3组显著减轻,心脏功能和生存曲线改善(P<0.01);CVB3+KN-93组小鼠心肌组织H2O2含量较CVB3组显著下降(P<0.01);加入Ti后,CVB3+KN-93+Ti组H2O2含量较CVB3+KN-93组轻度下降(P<0.05),但无论是心脏功能还是生存曲线均无显著差异。结论:RIP3/CaMKⅡ信号通路在CVB3诱导的急性重症病毒性心肌炎小鼠心肌细胞损伤中起到主导作用;KN-93能阻断这种作用并可能产生新的治疗方式,其效果可能是通过对CaMKⅡ的直接抑制和对活性氧簇的间接抑制而实现的。

CaMKⅡγ和CaMKⅡδ通过PI3K/Akt/Erk信号通路减轻小鼠神经元缺血再灌注损伤

目的观察钙/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(CaMKⅡ)的同工型CaMKⅡγ和CaMKⅡδ对鼠神经元细胞缺血缺氧再灌注损伤的影响,并探究其作用机制。方法分离胚胎期第18天胎鼠大脑用于提取原代神经元,在5%CO_(2)、37℃条件下培养,分为常规培养的对照组、空白对照组(si-NT)、CaMKⅡγ敲除组(si-CAMK2G)和CaMKⅡδ敲除组(si-CAMK2D)。研究组神经元转染处理后,更换为无糖培养基,并将其置于缺氧环境中模拟氧糖剥夺(OGD/R)条件,持续1 h,随后复原标准培养环境。通过对神经元裂解物行免疫蛋白印迹检测磷脂酰肌醇-3-激酶/细胞外信号调节激酶(PI3K/Akt/Erk)信号通路构件的表达量,并建立小鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型,通过对比假手术组(Sham)(n=25)和MCAO组(n=25)PI3K/Akt/Erk信号通路表达来进行验证。结果si-CAMK2G组的胎鼠神经元细胞在OGD/R 12、24、48、72 h的生存率明显低于si-NT组(P<0.01或0.001),并可逆转OGD/R介导的胎鼠神经元细胞CaMKⅡγ表达上调。si-CAMK2G组和si-CAMK2D组与si-NT组相比,PI3K/Akt/Erk信号通路表达受到明显抑制(P<0.01)。在MCAO模型中,MCAO组小鼠脑CaMKⅡδ和CaMKⅡγ的表达显著增加并激活了PI3K/Akt/Erk信号通路,CaMKⅡδ和CaMKⅡγ,Erk、磷酸化Erk、Akt和磷酸化Akt在MCAO造模成功再灌注后24、48、72和96 h的表达显著高于Sham组再灌注24 h(P<0.05,0.01或0.0001)。结论CaMKⅡγ和CaMKⅡδ在神经元细胞发生缺血缺氧损伤时的神经保护作用可能是通过PI3K/Akt/Erk信号通路介导的。

淫羊藿次苷Ⅱ调控PI3K/Akt信号通路对阿尔茨海默病小鼠学习记忆能力的影响

目的:研究淫羊藿次苷Ⅱ(ICSⅡ)对阿尔茨海默病(AD)模型小鼠学习和记忆能力的影响及其分子机制。方法:将7月龄APP/PS1双转基因小鼠随机分为模型组、ICSⅡ组和阳性对照药组,每日灌胃给药1次,连续30 d。用Morris水迷宫与筑巢实验检测小鼠学习记忆和生活能力;用免疫荧光化学法检测脑内β淀粉样蛋白(Aβ)沉积与细胞凋亡情况;用蛋白质免疫印迹法(Western blot)探究其抗凋亡作用与磷脂腺肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的相关性。结果:与模型组比较,ICSⅡ组小鼠的学习记忆及生活能力都明显提高(P<0.01),其海马与皮层的Aβ荧光强度和裂解的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)阳性细胞数均明显降低(P<0.05,P<0.01),说明ICSⅡ能抑制Aβ沉积、减少神经细胞凋亡,保护脑组织;同时ICSⅡ组小鼠海马PI3K蛋白质表达水平和p-Akt/Akt显著升高(P<0.05,P<0.01),而Bax/Bcl-2明显降低(P<0.01),说明ICSⅡ抗凋亡作用的机制与激活海马PI3K/Akt信号通路,降低促凋亡蛋白、提高抗凋亡蛋白的表达水平有关。结论:ICSⅡ对AD小鼠脑内神经细胞有明显的保护作用,能改善小鼠的认知功能,其机制可能与激活海马PI3K/Akt信号通路有关。

川陈皮素调节RIP1/RIP3/MLKL信号通路对慢性心力衰竭大鼠心肌坏死性凋亡的影响

目的探究川陈皮素(Nob)调节受体相互作用蛋白激酶1/受体相互作用蛋白激酶3/混合谱系激酶样结构域蛋白(RIP1/RIP3/MLKL)信号通路对慢性心力衰竭(CHF)大鼠心肌坏死性凋亡的影响及作用机制。方法于2022年9月—2023年3月在南方医科大学中心实验室进行实验。建立大鼠CHF模型,将造模成功的75只大鼠按随机数字表法分为模型组(CHF组)、川陈皮素低剂量组(Nob-L组,7.5 mg·kg-1·d^(-1)Nob)、川陈皮素中剂量组(Nob-M组,15 mg·kg-1·d^(-1)Nob)、川陈皮素高剂量组(Nob-H组,30 mg·kg-1·d^(-1)No b)和通路抑制剂Necrostatin-1组(Nec-1组,2.45 mg·kg-1·d^(-1)Nec-1),每组15只。另取15只大鼠作为假手术组(Sham组)只打开胸腔不进行结扎。干预28 d后,采用超声心动图检测左心室功能;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)水平;苏木精-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察心肌组织病理变化及纤维化情况;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)观察心肌组织凋亡情况;蛋白质印迹法(Western blot)检测心肌组织RIP1、RIP3、MLKL磷酸化水平及半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶(Caspase-8)蛋白表达。结果与Sham组比较,CHF组心肌组织部分细胞损伤坏死、结构紊乱、心肌细胞肿胀、有大量的炎性细胞浸润,心肌组织胶原蛋白沉积和纤维化增加,与CHF组比较,Nob-L组、Nob-M组、Nob-H组和Nec-1组心肌纤维排列逐渐规则、心肌细胞肿胀、坏死及炎性细胞浸润减少、胶原沉积和纤维化减少。与Sham组比较,CHF组左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、IL-1β、TNF-α和MDA水平、细胞凋亡率、p-RIP1/RIP1、p-RIP3/RIP3、p-MLKL/MLKL表达显著增加,左心室射血分数(LVEF)、左心室轴缩短分数(FS)、SOD和T-AOC水平、Caspase-8表达显著降低;与CHF组比较,Nob-L组、Nob-M组、Nob-H组、Nec-1组上述指标均改善(F/P=102.557/<0.001、117.684/<0.001、364.401/<0.001、268.087/<0.001、124.566/<0.001、229.003/<0.001、193.585/<0.001、182.164/<0.001、142.657/<0.001,140.900/<0.001、169.680/<0.001、103.485/<0.001、108.277/<0.001、200.435/<0.001),且Nob-L组、Nob-M组、Nob-H组的干预效果呈剂量依赖性(P<0.05)。结论Nob可能通过抑制RIP1/RIP3/MLKL信号通路的激活,减轻炎性反应及氧化应激,抑制CHF大鼠的心肌坏死性凋亡,对CHF大鼠发挥保护作用。

氰戊菊酯过度激活Ca^(2+)/CaM/CaMKⅡ信号通路诱发线粒体损伤干扰TM3细胞睾酮合成

目的利用胞内Ca^(2+)螯合剂BAPTA-AM和CaM阻断剂TFP探讨Ca^(2+)/CaM/CaMKⅡ信号通路在氰戊菊酯(Fen)诱发小鼠睾丸间质细胞(TM3细胞)线粒体损伤和睾酮合成障碍中的作用。方法TM3细胞实验分为对照组、Fen暴露组(25μmol/L Fen)、Fen+BAPTA-AM组(25μmol/L Fen+5 mmol/L BAPTA-AM)、Fen+TFP组(25μmol/L Fen+10μmol/L TFP),Fen暴露时长为24 h。采用ELISA法检测TM3细胞的睾酮和环磷酸腺苷(cAMP)水平,化学比色法检测TM3细胞的ATP水平,Flou-4/AM探针测定细胞内Ca^(2+)水平,JC-1染色法测定TM3细胞的线粒体膜电位(MMP)改变,蛋白免疫印迹法检测CYP11A1、3β-HSD、StAR、CaM、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、Bax和Bcl-2的蛋白表达水平。结果Fen暴露组TM3细胞的T、ATP和cAMP含量下降,MMP水平降低,睾酮合成的相关蛋白和酶CYP11A1、3β-HSD、StAR表达减少(P<0.01);同时,TM3细胞胞内的Ca^(2+)水平显著上升(P<0.01),CaM、p-CaMKⅡ/CaMKⅡ、Bax蛋白表达升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达下降(P<0.01)。Fen+BAPTA-AM组和Fen+TFP组TM3细胞的睾酮、ATP和cAMP含量上升,MMP水平升高(P<0.01),睾酮合成相关的蛋白和酶CYP11A1、3β-HSD、StAR表达增加(P<0.01),CaM、p-CaMKⅡ/CaMKⅡ及Bax蛋白表达下降,Bcl-2蛋白表达增加(P<0.01)。结论Fen诱发的TM3细胞mPTP开放以及睾酮合成障碍可能与Fen暴露后TM3细胞胞内Ca^(2+)超载、CaM和p-CaMKⅡ表达上调引起的Ca^(2+)/CaM/CaMKⅡ信号通路过度激活有关。

金莲花总黄酮下调miR-215-5p抑制PI3K/AKT信号通路影响AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖和迁移

目的 探讨金莲花总黄酮对血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞(CFs)增殖、迁移的影响和潜在机制。方法 不同浓度(0.2、0.4、0.8 mmol/L)的金莲花总黄酮作用于AngⅡ诱导CFs。细胞计数试剂盒检测细胞活力确定金莲花总黄酮使用浓度。Transwell实验、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测细胞迁移、miR-215-5p表达水平。Western印迹检测磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)的磷酸化水平。将miR-215-5p模拟物、抑制物分别转染CFs,检测上调或下调miR-215-5p对AngⅡ诱导的CFs增殖和迁移的影响。结果 金莲花总黄酮作用于AngⅡ诱导的CFs后,细胞活力、迁移能力、miR-215-5p、磷酸化(p)-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低(P<0.05)。上调miR-215-5p表达后,AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力显著升高(P<0.05)。下调miR-215-5p表达后,AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力显著降低(P<0.05)。上调miR-215-5p表达能够显著降低金莲花总黄酮对AngⅡ诱导的CFs活力、迁移能力及PI3K/AKT信号通路的影响(P<0.05)。结论 金莲花总黄酮能够降低AngⅡ诱导的CFs增殖和迁移,其机制可能与下调miR-215-5p表达和抑制PI3K/AKT信号通路有关。

肾气丸对肾间质纤维化大鼠肾组织TGF-β1/Smad3信号通路及AngⅡ表达的影响

目的探讨肾气丸对肾间质纤维化大鼠肾组织转化生长因子(TGF)-β1/果蝇抗生物皮肤生长因子蛋白家族(Smad)3信号及血管紧张素(Ang)Ⅱ表达的影响。方法SD大鼠分为正常组、模型组、实验组、过表达组,其中模型组、实验组、过表达组每日以250 mg/kg的腺嘌呤生理盐水混悬液进行灌胃处理造模,每日1次,连续12 d后,更换为每两日1次,连续12 d,造模周期共24 d,正常组以等剂量的生理盐水进行灌胃;实验组每日尾静脉注射5×10^(9) pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC,并且以10 g/kg的肾气丸进行灌胃处理;过表达组每日尾静脉注射5×10^(9) pfu/ml pc DNA3.1-TGF-β1,并且以10 g/kg的肾气丸进行灌胃处理;模型组和正常组每日尾静脉注射5×10^(9) pfu/ml的pcDNA3.1-TGF-β1-NC并以生理盐水进行灌胃处理。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组大鼠血清血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的含量,免疫组化检测各组α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)的表达,Western印迹法检测肾组织中AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达水平。结果与正常组相比,模型组、实验组、过表达组血清中Scr和BUN的含量、α-SMA和ColⅣ的阳性细胞比例及AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达明显升高(均P<0.05);与模型组相比,实验组、过表达组血清中Scr和BUN的含量、α-SMA和ColⅣ的阳性细胞比例及AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达明显降低(均P<0.05);与实验组相比,过表达组血清中Scr和BUN的含量、α-SMA和ColⅣ的阳性细胞比例及AngⅡ、TGF-β1、p-Smad3的表达明显升高(均P<0.05)。结论肾气丸能减轻肾间质纤维化大鼠肾组织的病理损伤,改善其肾功能,这与抑制TGF-β1/Smad3信号的激活有关。

丹参酮ⅡA通过PI3K/AKT/ERK信号通路对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响

目的:探讨丹参酮ⅡA通过磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/细胞外调节激酶(ERK)信号通路对脑胶质瘤细胞增殖、凋亡、侵袭及迁移的影响。方法:取对数生长期的U251细胞,并分为空白组(未处理的U251细胞)、对照组(0.1%DMSO)、丹参酮ⅡA组(20μmol/L丹参酮ⅡA)、IGF-1组(100 ng/ml PI3K/AKT/ERK通路激活剂IGF-1)、丹参酮ⅡA+IGF-1组(20μmol/L丹参酮ⅡA与100 ng/ml IGF-1同时处理),倒置显微镜观察各组细胞形态;CCK-8法检测各组细胞增殖;流式细胞术检测各组细胞凋亡;Transwell实验检测各组细胞侵袭与迁移;Western blot检测各组细胞中细胞周期素D1(CyclinD1)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9及PI3K/AKT/ERK通路相关蛋白的表达。结果:与空白组、对照组比较,丹参酮ⅡA组U251细胞数量减少,细胞皱缩,出现大量细胞碎片,而IGF-1组U251细胞数量增多,细胞形态未发生改变;与丹参酮ⅡA组比较,丹参酮ⅡA+IGF-1组细胞数量增多,细胞贴壁性变强。与空白组、对照组比较,丹参酮ⅡA组U251细胞OD450值(24 h、48 h)、侵袭细胞数目、迁移细胞数目、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著降低,细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.05),而IGF-1组U251细胞OD450值(24 h、48 h)、侵袭细胞数目、迁移细胞数目、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与丹参酮ⅡA组比较,丹参酮ⅡA+IGF-1组U251细胞OD450值(24 h、48 h)、侵袭细胞数目、迁移细胞数目、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平显著升高,细胞凋亡率、Bax蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。结论:丹参酮ⅡA通过抑制PI3K/AKT/ERK通路抑制U251细胞增殖、侵袭、迁移,并诱导其凋亡。

丹参酮ⅡA激活JAK2/STAT3信号通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的:观察丹参酮IIA对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及相关信号传导通路相关机制。方法:通过大鼠心肌细胞体外培养并建立缺血再灌注模型及体内大鼠心肌缺血再灌注模型,分别从细胞水平及动物整体水平进行研究。SD乳鼠心肌细胞体外培养建立缺血再灌注模型24 h后分别加入不同浓度丹参酮IIA通过流式细胞术检测细胞凋亡率;另外加入丹参酮IIA,AG490,丹参酮IIA及AG490,通过westernblot方法检测JAK2,PJAK2,STAT3,P-STAT3蛋白表达。40只SD大鼠分为缺血再灌注组,生理盐水对照组,丹参酮ⅡA处理组,丹参酮ⅡA+AG490组,按照TUNEL试剂盒方法检测心肌凋亡。通过westernblot方法检测JAK2,P-JAK2,STAT3,P-STAT3蛋白表达。结果:无论细胞水平还是动物整体水平,加入丹参酮IIA均能减少心肌细胞凋亡;丹参酮IIA组P-JAK2、STAT3蛋白表达较缺血再灌注组明显上升,而丹参酮ⅡA+AG490组的P-JAK2、STAT3蛋白表达较丹参酮ⅡA组明显下调。结论:丹参酮ⅡA可降低缺血再灌注引起的大鼠心肌细胞凋亡,其保护机制可能与JAK2/STAT3信号通路有关。

ABI家族成员3结合蛋白在血管紧张素Ⅱ诱导内皮祖细胞功能障碍中的作用及机制研究

目的探讨ABI家族成员3结合蛋白(ABI family member 3-binding protein,ABI3BP)在血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导内皮祖细胞功能障碍中的作用及机制。方法为探讨ABI3BP在AngⅡ诱导内皮祖细胞功能障碍中的作用,将细胞分为4组,sh-NC组[转染阴性对照短发夹RNA(LV-scramble-shRNA)+磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)]、sh-ABI3BP组[转染ABI3BP shRNA(LV-ABI3BP-shRNA)+PBS]、sh-NC+AngⅡ组(LV-scramble-shRNA+AngⅡ)和sh-ABI3BP+AngⅡ组(LV-ABI3BP-shRNA+AngⅡ)。采用Transwell实验检测细胞迁移能力,黏附实验检测细胞黏附能力,Matrigel检测细胞成管能力,原位末端标记法检测细胞凋亡。Western blot检测整合素β1-黏着斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)-P53信号通路变化情况。结果与sh-NC组比较,sh-NC+AngⅡ组迁移细胞数量、黏附细胞数量、小管形成数量显著降低,细胞凋亡率、整合素β1、磷酸化FAK(p-FAK)/FAK及P53蛋白表达显著增高,差异有统计学意义(P<0.05)。与sh-NC+AngⅡ组比较,sh-ABI3BP+AngⅡ组迁移细胞数量[(88.67±8.33)个vs(62.33±7.37)个]、黏附细胞数量[(104.33±6.03)个vs(68.33±10.05)个]、小管形成数量[(36.33±3.21)个vs(19.33±3.06)个]显著增高,细胞凋亡率、整合素β1、p-FAK/FAK及P53蛋白表达水平显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论AngⅡ可上调ABI3BP表达,敲低ABI3BP基因表达可改善AngⅡ诱导的内皮祖细胞功能障碍,其机制可能与抑制整合素β1-FAK-P53信号通路有关。

PI3K/Akt信号通路在慢性肾衰竭大鼠肾组织的表达及肾衰Ⅱ号方的干预作用

目的:研究肾衰Ⅱ号方对于5/6(ablation/infarction,A/I)肾切除法制备的慢性肾衰竭大鼠肾功能及PI3K/Akt信号通路表达的影响。方法:从SD雄性大鼠中随机抽取14只为假手术组(A组),其余采用5/6(ablation/infarction,A/I)肾切除法制备慢性肾衰竭大鼠模型,随机分为模型组(B组)、西药组(氯沙坦钾+福辛普利)(C组)、中药组(肾衰Ⅱ号方)。给予相应干预,60 d后检测大鼠肾功能[肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)]、内生肌酐清除率(Ccr)、血常规(Hb)、左肾重/体重,HE病理染色观察肾组织形态,Western blot法检测组织磷酸化Akt(p-Akt)、总Akt(pan Akt)蛋白表达。结果:(1)造模手术后,与A组比较,各手术组的BUN、Scr明显升高(P<0.01),Ccr明显降低(P<0.01),提示造模成功;(2)与B组比较,C、D组Scr均明显下降(P<0.01,P<0.01)、BUN水平下降(P<0.05,P<0.01),Ccr、Hb均明显升高(P<0.01,P<0.01),左肾重/体重降低(P<0.05);C组与D组比较,在降低Scr和BUN,改善Ccr和Hb,两种药物差异有统计学意义(P<0.05),而在左肾重/体重比值方面两组差别无统计学意义(P>0.05);干预前后比较,C组和D组治疗前后Scr、BUN、Ccr差异有统计学意义(P<0.05),且肾衰Ⅱ号方在降低Scr、BUN,改善Ccr方面优于氯沙坦钾合蒙诺(P<0.05)。(3)肾组织病理显示,两个治疗组病理变化明显减轻,优于模型组。(4)与B组比较,两治疗组皮质、髓质p-Akt/pan Akt比值明显降低(P<0.01,P<0.01);两组间降低p-Akt/pan Akt比值的作用差异有统计学意义(P<0.01),肾衰Ⅱ号方在下调p-Akt/pan Akt比值方面优于氯沙坦钾合蒙诺。结论:肾衰Ⅱ号方可以改善5/6肾切除慢性肾衰竭大鼠的肾脏功能,减轻肾间质纤维化,其作用机制可能是通过下调PI3K/Akt信号通路的表达实现。

电针对脑缺血再灌注大鼠脑缺血组织内VGLUT1表达及CaM/CaMKⅡ信号通路影响

目的选取“百会”“印堂”及双侧“足三里”穴进行电针干预,探讨电针对大脑中动脉栓塞(MCAO)模型大鼠脑缺血组织内VGLUT1表达的影响及对CaM/CaMKⅡ信号通路的影响。方法线栓法制备MCAO模型大鼠,依据神经功能评分标准,造模成功后的30只大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组和电针组,每组10只。造模成功后2 h,选取“百会”“印堂”及双侧“足三里”穴对电针组进行治疗,连续电针7 d。通过Morris水迷宫实验完成对大鼠学习和记忆能力的检测;HE染色法观察各组大鼠脑组织的形态学改变;免疫组化法检测各组大鼠脑缺血组织内VGLUT1表达水平;ELISA法检测各组大鼠脑缺血组织内CaM、CaMKⅡ表达水平。结果经电针治疗后,电针组大鼠神经功能评分较模型组显著降低(P<0.05);Morris水迷宫实验:与模型组相比,电针组大鼠穿过逃生平台的次数明显增多(P<0.01),其逃避潜伏期明显缩短(P<0.05);HE染色:模型组和电针组脑组织细胞均有不同程度的坏死或损伤,但电针组的组织形态学有明显改善;免疫组化法:与模型组比较,电针组大鼠脑缺血组织内VGLUT1表达水平明显升高(P<0.05)。ELISA法:与假手术组比较,模型组和电针组大鼠脑缺血组织内CaM、CaMKⅡ表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组比较,电针组大鼠脑缺血组织内CaM、CaMKⅡ表达水平明显降低(P<0.05)。结论电针“百会”“印堂”及双侧“足三里”穴能够明显改善脑缺血再灌注大鼠的学习和记忆能力,上调VGLUT1表达水平,增强突触传递效能,且能够抑制CaM/CaMKⅡ信号通路的活化,对脑组织产生一定的保护作用,对脑缺血再灌注损伤在临床上的治疗科学性提供了实验依据。

瓜蒌薤白半夏汤通过调整氧化应激激活PI3K/Akt/eNOS通路发挥对Ⅱ型糖尿病合并急性心肌缺血的保护作用

以调整氧化应激状态、激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路为切入点,探讨瓜蒌薤白半夏汤(GXBD)保护Ⅱ型糖尿病合并急性心肌缺血(T2DM-AMI)的作用机制.将36只大鼠随机分为对照组(Ctrl组)、模型组(T2DM-AMI组)、处理组(GXBD组),每组12只.对T2DM-AMI组、GXBD组联合使用灌服高脂乳剂、腹腔注射链脲佐菌素、冠脉结扎3种方法制造T2DM-AMI大鼠模型.四唑红染色检测心肌梗死率,苏木精-伊红染色检测其病理损伤情况;酶联免疫吸附法检测血浆氧化损伤成分氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、晚期糖基化终产物(AGEs)、黄嘌呤氧化酶(XO)、髓过氧化物酶(MPO),血浆抗氧化成分一氧化氮(NO)、硫氧还蛋白(Trx)、硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的水平或活性,以及总活性氧(T-ROS)的水平和总抗氧化能力(T-AOC);蛋白免疫印迹法检测心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的表达及磷酸化水平,实时荧光定量PCR检测其中Pi3k、Akt和eNos基因的mRNA表达水平.结果显示T2DM-AMI大鼠心肌梗死严重,血浆中上述4种氧化损伤成分的水平或活性及T-ROS水平显著升高,3种抗氧化成分的水平或活性及T-AOC显著降低,心肌组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的表达及磷酸化水平显著下调,相应基因的mRNA表达水平同样显著下降,而GXBD干预可显著逆转这些病理性变化.综上,GXBD可能通过提高抗氧化能力、清除自由基、纠正异常的氧化应激状态、激活心肌组织中PI3K/Akt/eNOS信号通路,发挥对T2DM-AMI的保护作用.

RIP1-RIP3-MLKL信号通路在急性冠状动脉综合征病人外周血单核细胞中的表达

目的:研究急性冠状动脉综合征(ACS)病人外周血单核细胞(PBMCs)上刺激受体相互作用蛋白1(RIP1)-RIP3-混合谱系激酶结构域样假激酶(MLKL)信号通路的表达变化,并分析其可能机制。方法:选取初诊为ACS病人60例,其中不稳定型心绞痛(UAP)病人31例,急性心肌梗死(AMI)病人20例,对照组选取同期健康体检者19名。采集所有受试者外周静脉血,分别提取血浆和外周血单核细胞(PBMCs),酶联免疫吸附实验(ELISA)和比浊法分别检测血浆中白细胞介素(IL)-1和IL-18、MLKL的水平,运用Real Time-PCR检测MLKL的mRNA表达,免疫印迹法检测PBMCs中RIP1、RIP3和MLKL的蛋白表达。结果:3组受试者血浆IL-1、IL-18含量和MLKL含量差异均有统计学意义(P<0.01),PBMCs中RIP1和RIP3蛋白表达增加(P<0.05),MLKL的mRNA和蛋白表达亦增加(P<0.05)。与UAP组比较,AMI组病人外周血浆中IL-1、IL-18和MLKL进一步升高,RIP1和RIP3的蛋白表达的进一步增加(P<0.05),MLKL的mRNA和蛋白表达增高。结论:UAP和AMI病人体内存在不同程度的炎症活化,RIP1-RIP3-MLKL信号通路在PBMCs中的表达量随病情的严重程度逐渐增加,提示RIP1-RIP3-MLKL信号通路可能在ACS的不同类型发病中起重要作用。

丹参酮ⅡA通过NLRP3/Caspase-1信号通路对心肌成纤维细胞的保护作用

目的:探讨丹参酮ⅡA对心肌成纤维细胞损伤的保护作用及可能机制。方法:分离和培养大鼠心肌成纤维细胞(Cardiac Fibroblast,CFs)。以脂多糖(LPS)刺激CFs建立脓毒症心肌损伤体外模型,以不同浓度丹参酮ⅡA预处理CFs 30 min后,给予LPS刺激,设对照组,LPS模型组,LPS+不同浓度TSA(2μmol/L、10μmol/L、50μmol/L)组;采用蛋白质免疫印迹试验法(Western blotting)检测CFs的NLRP3和Caspase-1蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清中IL-1β和IL-18的含量。结果:LPS刺激24 h后,CFs的NLRP3蛋白的表达水平最高。LPS模型组NLRP3和Caspase-1蛋白的表达较对照组明显升高(P<0.01)。与LPS模型组比较,丹参酮ⅡA(10μmol/L、50μmol/L)处理组NLRP3和Caspase-1蛋白的表达均明显降低(P<0.05);丹参酮ⅡA处理组的IL-1β和IL-18水平均明显低于LPS模型组(P<0.05)。结论:丹参酮ⅡA能抑制LPS诱导的心肌成纤维细胞内NLRP3/Caspase-1炎症反应信号通路分子的表达,这可能是其保护心肌细胞的分子机制之一。

丹参酮ⅡA通过介导PI3K/Akt-eNOS信号通路改善野百合碱所致大鼠肺动脉高压

目的 探究丹参酮ⅡA治疗野百合碱所致大鼠肺动脉高压(PAH)的作用机制。方法 选取100只SD雄性大鼠,按随机数字表法分为5组(20只/组):模型组(MCT)、丹参酮ⅡA组(TⅡA)、丹参酮ⅡA+PI3K抑制剂组(TP)、PI3K抑制剂组(PI)、对照组。除对照组颈背部注射等体积生理盐水外,剩余大鼠均颈背部注射野百合碱(MCT)诱导肺动脉高压模型。2周后,丹参酮ⅡA组腹腔注射丹参酮ⅡA10 mg/kg进行治疗,丹参酮ⅡA+PI3K抑制剂组注射丹参酮ⅡA10 mg/kg+PI3K抑制剂1 mg/kg,PI3K抑制剂组注射PI3K抑制剂1 mg/kg,对照组和模型组均腹腔注射等体积生理盐水。治疗2周后,采用苏木精-伊红(HE)染色实验和α-SMA免疫荧光染色实验评估大鼠肺血管形态;Western blot实验评估大鼠肺组织中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB/Akt)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的磷酸化水平;ELISA法测定eNOS、NO水平。结果 HE染色实验和α-SMA免疫荧光染色证实丹参酮ⅡA能有效抑制PAH大鼠肺血管中膜厚度和血管肌化水平(P<0.01);Western blot实验结果显示丹参酮ⅡA能够显著提高PAH大鼠肺组织中PI3K、Akt和eNOS蛋白的磷酸化水平;ELISA实验结果显示模型组eNOS、NO水平降低(P<0.01)。结论 丹参酮ⅡA能够通过介导PI3K/Akt-eNOS信号通路改善野百合碱所致大鼠肺动脉高压。

丹参酮ⅡA对心力衰竭大鼠心室重构和PI3K/Akt信号通路的影响

目的观察丹参酮ⅡA对心力衰竭大鼠心室重构和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响,阐明丹参酮ⅡA对心力衰竭的可能作用机制。方法将48只Wistar大鼠采用随机数字表法分为正常对照组(A组)、模型组(B组)和丹参酮ⅡA治疗组(C组),各16只大鼠。采用皮下注射异丙肾上腺素建立心力衰竭大鼠模型。建模后C组大鼠腹腔注射丹参酮ⅡA干预28 d。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、脑钠肽(BNP)水平。测量左心室质量(LVM),计算左室质量指数(LVMI)、球型指数(SI)。苏木精-伊红(HE)染色和Masson染色观察心脏组织形态学变化和纤维化情况。蛋白免疫印迹法测定心肌组织Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)、PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平。结果与A组比较,B组大鼠血清AngⅡ、BNP水平、LVMI、LVM、心肌组织ColⅠ、ColⅢ、p-PI3K、p-Akt蛋白含量升高(P<0.05),心肌胶原容积比增加(P<0.05),SI降低(P<0.05);与B组比较,C组大鼠血清AngⅡ、BNP水平、LVMI、LVM、心肌组织ColⅠ、ColⅢ、p-PI3K、p-Akt蛋白含量、心肌胶原容积比降低(P<0.05),SI升高(P<0.05)。HE染色和Masson染色显示:A组心肌组织形态结构正常,B组心肌纤维化和心室重构明显,C组心肌纤维化和心室重构较B组减轻。结论丹参酮ⅡA对心力衰竭大鼠心室重构具有保护作用,可抑制PI3K/Akt信号通路激活。

miR-214调控FGF9的表达参与结核分枝杆菌感染肺泡Ⅱ型细胞中PI3K/AKT信号通路的免疫调控作用研究

目的探究miR-214对结核分枝杆菌感染肺泡Ⅱ型细胞中免疫调控的作用机制。方法培养肺泡Ⅱ型细胞系A549,分别使用结核分枝杆菌疫苗株BCG和结核分枝杆菌标准株H37Rv感染A549细胞。对A549细胞进行分组,并进行H37Rv感染。qRT-PCR检测各组细胞中miR-214和FGF9的表达情况,Western blot检测各组细胞中FGF9蛋白的表达。ELISA检测细胞中免疫相关因子SP-A、SP-D、TLR2和TLR4,炎症因子IL-10、TNF-α、TNF-γ、IL-1β和IL-8的含量。Western blot检测PI3K/AKT信号通路成员PI3K、AKT、p-AKT的表达。结果和BCG相比,H37Rv感染后的A549细胞中miR-214表达升高,FGF9表达降低。和NC mimic+oe-NC组相比,miR-214 mimic+oe-NC组细胞SP-A、SP-D、IL-10含量显著降低,TLR2、TLR4、TNF-α、TNF-γ、IL-1β、IL-8含量显著升高,PI3K、AKT/p-AKT表达显著升高。NC mimic+oe-FGF9组SP-A、SP-D、IL-10含量显著升高,TLR2、TLR4、TNF-α、TNF-γ、IL-1β、IL-8含量显著降低,PI3K、AKT/p-AKT表达显著升高降低。和miR-214 mimic+oe-NC组相比,miR-214 mimic+oe-FGF9组SP-A、SP-D、IL-10含量显著升高,TLR2、TLR4、TNF-α、TNF-γ、IL-1β、IL-8含量显著降低,PI3K、AKT/p-AKT表达显著降低。结论 miR-214通过抑制FGF9的表达,进而激活PI3K/AKT信号通路,导致结核分枝杆菌感染肺泡Ⅱ型细胞过度免疫反应,从而导致炎症发展。

靛玉红衍生物PHⅡ-7通过PXR-CYP3A5/ABCB1信号通路对他克莫司转运及代谢的调节及其作用机制研究

目的探究靛玉红衍生物PHⅡ-7通过激活PXR-CYP3A5/ABCB1信号通路进而影响他克莫司(FK506)转运与代谢的机制。方法本研究以五味子甲素(Sch-A)为阳性对照,大鼠体内实验研究PHⅡ-7对FK506药动学的影响;MTT法检测PHⅡ-7、Sch-A对HepG2和LS174T细胞的IC50值;RT-qPCR和Western blot检测PHⅡ-7、Sch-A对PXR/CYP3A4/3A5/ABCB1信号通路转录和蛋白水平的影响。结果与Sch-A组比较,PHⅡ-7组AUC0-t、CL明显增加(P<0.05);HepG2和LS174T细胞PHⅡ-7的IC50分别为(17.82±1.33)μmol·L^-1和(7.17±0.37)μmol·L^-1,Sch-A的IC50分别为(40.38±4.1)μmol·L^-1和(44.1±1.94)μmol·L^-1;HepG2和LS174T细胞经PHⅡ-7和Sch-A处理后,PXR、CYP3A4/3A5和ABCB1的mRNA和蛋白表达均明显降低(P<0.05),且呈剂量与时间依赖性。结论 PHⅡ-7可通过PXR-CYP3A5/ABCB1信号通路调节FK506的转运与代谢,进而增强FK506的体内疗效。

胡黄连苷Ⅱ通过抑制cyto C/caspase-9/caspase-3通路发挥神经保护作用

目的研究胡黄连苷Ⅱ对大鼠脑缺血/再灌注过程中cyto C/caspase-9/caspase-3信号通路的影响及其神经保护作用机制。方法环孢素(Cs A)和苍术苷(Atr)分别作为cyto C阳性对照和阴性对照,改良Longa法制备缺血2 h再灌注24 h大鼠脑缺血/再灌注(I/R)模型。再灌注24 h后,TTC染色观察脑梗死体积;免疫组织化学和Western blot检测cyto C、caspase-9、caspase-3表达水平。结果模型组大鼠脑缺血/再灌注后TTC显示染色脑梗死体积明显增加;免疫组织化学和Western blot显示cyto C、caspase-9、caspase-3表达水平较假手术组明显增多(P<0.05)。治疗组大鼠TTC显示脑梗死体积缩小;免疫组化和Western blot显示cyto C、caspase-9、caspase-3表达水平与模型组相比明显降低(P<0.05)。与Atr组相比,Atr+胡黄连苷Ⅱ组大鼠脑梗死体积缩小,免疫组化和Western blot显示cyto C、caspase-9、caspase-3表达水平减弱(P<0.05)。结论胡黄连苷II抑制缺血/再灌注损伤大脑神经凋亡的机制可能与下调cyto C/caspase-9/caspase-3信号通路蛋白有关。