RIPK2免疫调控及临床预后的生物信息学分析

目的探讨受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(RIPK2)参与免疫调控通路及临床预后的作用。方法通过TIMER、cBioPortal、Human Protein Atlas(HPA)和UALCAN和STRING等数据库对RIPK2在组织中的定位和表达,及其在肿瘤免疫浸润、免疫调控和生存预后中的作用进行分析。结果(1)RIPK2主要由激酶和CARD结构域构成,第18~298位氨基酸是其激酶结构,第435~526位氨基酸是CARD结构域;与正常组织细胞比较,RIPK2在大部分恶性肿瘤中高表达,其中在子宫内膜上皮癌和人黑色素瘤细胞系(hTERT-HME1)中表达最高。相比胶质瘤(GBM)和透明细胞癌(KIRC),在结肠癌(COAD)组织突变率和表达水平较高。(2)免疫组化和荧光染色结果显示,RIPK2定位在胞质,在不同肿瘤组织中RIPK2的表达和AIM2、CASP1、GSDMD、NLRP3、NOD1和NOD2蛋白表达呈正相关。(3)PPI网络图显示,RIPK2参与免疫调控,包括NOD样、NLRP3炎性小体、AIM2炎性小体和细胞焦亡相关通路。(4)RIPK2的表达与免疫渗漏和临床预后有关,在COAD和KIRC中,RIPK2的表达与CD_(8)^(+)、CD_(4)^(+)T细胞、Neutrophil细胞存在相关性。(5)生存分析曲线显示,RIPK2高表达与KIRC患者的预后生存相关,且高表达RIPK2的KIRC患者生存期缩短。结论RIPK2在COAD、GBM和KIRC等恶性肿瘤中高表达,参与调控免疫渗漏、预测肿瘤预后和生存分析,推测RIPK2可作为一个关键的候选基因,在免疫调控、指导临床预后和治疗恶性肿瘤中发挥重要作用。

LPS刺激对鸡HD11细胞RIPK2基因甲基化的影响及调控

为分析LPS刺激前后对RIPK2基因甲基化的影响,试验采用凝胶电泳、亚硫酸氢盐、双荧光素酶报告系统和qRT-PCR方法分析LPS刺激前后RIPK2基因的甲基化模式及甲基化相关试剂对鸡RIPK2启动子活性及表达水平影响。结果表明:LPS刺激后鸡RIPK2基因甲基化水平从53.8%下降至15.4%;5-氮杂胞苷显著性提高鸡RIPK2启动子活性,促进基因表达;而CpG甲基转移酶M. SssI显著性抑制鸡RIPK2启动子活性,抑制基因表达。研究结果对提高家禽免疫和控制过度性炎症反应具有十分重要的现实意义。

RIPK2:治疗炎症性疾病的新靶点

炎症是机体受到刺激后出现的一种保护性反应,然而,失调的炎症反应又会引发各种炎症性疾病。受体相互作用蛋白激酶2 (receptor interacting protein kinase 2, RIPK2)是核苷酸结合寡聚化结构域蛋白1和2 (nucleotide-binding oligomerization domain containing protein 1/2, NOD1/2)下游的信号转导分子,在NOD介导的炎症反应中起到了关键的调控作用。NOD-RIPK2信号通路与多种炎症性疾病存在联系,本文对RIPK2的结构功能、RIPK2与炎症性疾病的关系以及RIPK2抑制剂的研发进展进行综述,希望为炎症性疾病的治疗提供新的思路。

乌珠穆沁绵羊RIPK2基因多态性与生长性状的关联

【目的】基于前期绵羊肉用性状GWAS研究结果,旨在探讨RIPK2基因对乌珠穆沁绵羊生长性状的影响,找到该基因中与绵羊生长性状相关的分子标记,同时对GWAS结果进行验证。【方法】在343只乌珠穆沁绵羊试验群体中,选取其中30个个体的血液DNA样本,以相同浓度组成池DNA,设计引物对RIPK2基因外显子及其上下游1 000bp的调控区进行PCR扩增,PCR产物检测为目的条带后测序。使用DNAMAN和Chromas2软件对测序峰图进行分析,采用飞行质谱方法对检测到的SNP位点及前期GWAS得到的SNP位点进行基因型分型。使用Haploview软件对多态位点构建单倍型及连锁不平衡分析。使用SPSS（22.0）软件进行RIPK2基因SNP位点与生长性状间的关联分析。【结果】共发现了4个多态位点,A5536G的同义突变rs01位于第四外显子内,在该位点检测到三种基因型,AA基因型频率为0.42,AG基因型频率为0.45,GG基因型频率为0.13,优势等位基因为A,其频率为0.65;在第七外显子上检测到T8952C错义突变rs02,在该突变位点检测到3种基因型,其中TT基因型频率为0.82,TC基因型频率为0.16,CC基因型频率为0.02,T为优势等位基因,基因频率为0.9;在第十外显子检测到T2836C的突变rs05,在该位点检测到两种基因型TT和CC,没有检测到杂合子基因型,TT基因型频率为0.25,CC基因型频率为0.75;上游调控区发现一个G5181C的突变rs30,有3种基因型,其中GC基因型频率为0.50,CC基因型频率为0.18,GG基因型频率为0.32,G为优势等位基因,其频率为0.58;GWAS得到的SNP位点是T4456C,在本研究中被命名为rs34,在该位点有3种基因型,其中TT基因型频率为0.49,TC基因型频率为0.37,CC基因型频率为0.14,优势等位基因T的频率为0.68。χ^2适合性检验发现,除rs34位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P〉0.05）。rs02位点处于低度多态（PIC〈0.25）,

鸡RIPK2基因启动子核心区域及生物信息学分析

为了对前期高通量测序筛选出的抗禽致病性大肠杆菌鸡中高表达RIPK2基因进行结构和蛋白功能探析,试验通过PCR技术克隆鸡RIPK2起始密码子前3 201 bp的启动子区,构建系列启动子区缺失载体,转染HD11细胞,双荧光素酶试验检测启动子核心区域;5-Azadc、TSA或5-Azadc和TSA联合处理鸡RIPK2启动子;并结合生物信息学技术对鸡RIPK2蛋白的理化性质进行系统分析。结果显示:通过PCR技术成功克隆鸡RIPK2启动子区不同片段,单、双酶切测序结果准确;-2 300~+38 bp区域是鸡RIPK2基因启动子的基本活性区域,-2 300~-1 839 bp之间存在AP-1、CEBPA和NFκB等重要正调控元件。用5-Azadc、TSA以及5-Azadc和TSA联合分别处理鸡RIPK2启动子,均可提高其转录活性。生物信息学分析表明:鸡RIPK2蛋白在细胞核中表达;在生物进化进程中物种间保守性一般,禽类中保守性很高;存在自身磷酸化位点。试验结果为进一步研究鸡RIPK2基因转录调控机制和蛋白功能奠定了基础。

RIPK2介导自噬对高糖诱导的小鼠肾系膜细胞ROS、caspase-1及IL-1β表达的激活作用

目的观察受体结合丝氨酸/苏氨酸激酶2(RIPK2)介导自噬对高糖诱导的肾系膜细胞(GMCs)ROS、caspase-1及IL-1β表达的调控。方法体外培养正常小鼠GMCs,高糖作为刺激因子,设计siRNA靶向沉默RIPK2表达并构建自噬双荧光(mRFP-GFP-LC3)标记体系,激光共聚焦显微镜观察自噬流变化;DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平;Western blot及RT-PCR检测RIPK2、LC3Ⅱ/Ⅰ、caspase-1、IL-1β蛋白及mRNA表达;ELISA检测IL-1β的分泌。结果 1)高糖呈时间-浓度依赖性增加细胞内ROS水平,诱导caspase-1和IL-1β表达(P<0.05)。2)短期(0~12 h)高糖刺激可诱导RIPK2和LC3Ⅱ/Ⅰ表达(P<0.05),超过12 h后RIPK2和LC3Ⅱ/Ⅰ表达下调(P<0.05)。3)siRNA靶向沉默RIPK2下调LC3Ⅱ/Ⅰ表达和细胞自噬流形成,上调细胞内ROS、caspase-1及IL-1β表达(P<0.05)。结论 RIPK2介导自噬负性调控高糖诱导的ROS、caspase-1及IL-1β表达,可能是防治糖尿病肾脏疾病(DKD)的新思路。

核受体GCNF对H9C2心肌细胞的影响及作用机制

目的:研究人孤儿核受体生殖细胞核因子(hGCNF)对H9C2心肌细胞的影响并初探其机制。方法:通过感染Ad-hGCNF腺病毒使H9C2中的GCNF基因表达上调,利用间接免疫荧光化学技术确定其亚细胞定位,通过MTT法研究GCNF表达对细胞活力的影响,DAPI染色检测细胞凋亡水平,实时定量PCR及Western blot技术检测受体结合蛋白激酶2(RIPK2)和受体结合蛋白激酶3(RIPK3)的表达水平。结果:Ad-hGCNF腺病毒感染后,H9C2心肌细胞GCNF表达上调,亚细胞定位位于细胞核,细胞活力降低,凋亡水平显著增加,RIPK2和RIPK3表达水平均升高。结论:感染Ad-hGCNF腺病毒表达载体降低H9C2细胞活力,增加其凋亡水平,机制与RIPK2和RIPK3的表达上调有关。