敲低鞘氨醇激酶1增强人结肠癌RKO细胞对顺铂的敏感性

目的探讨沉默结肠癌RKO细胞鞘氨醇激酶1(SphK1)基因对顺铂(DDP)敏感性的影响及作用机制。方法构建靶向SphK1基因的慢病毒载体并感染RKO细胞后,实时定量PCR检测SphK1的mRNA水平,Western blot法检测SphK1蛋白水平。然后将RKO细胞分为SphK1低表达组(sh SphK1组)、阴性感染对照组(sh Control组)和空白对照组。培养24、48、72 h,MTT法检测细胞增殖活性;(0、2、4、8、16、32)μg/m L DDP处理细胞后,MTT法再次检测细胞增殖活性,TUNEL检测细胞凋亡,Western blot法检测KI-67抗原(ki67)、Bcl-2、胱天蛋白酶9(caspase-9)和caspase-3蛋白的水平。结果敲低SphK1基因能抑制RKO细胞的增殖,促进细胞凋亡。DDP呈时间和浓度依赖性抑制各组细胞的增殖,与对照组和sh Control组相比,敲低SphK1的细胞增殖能力显著降低;DDP呈剂量依赖性诱导细胞凋亡,且敲低SphK1的细胞凋亡率明显高于对照组和sh Control组。此外,敲低SphK1后,抑制ki67和Bcl-2的表达,增加caspase-9和caspase-3的表达,经DDP处理后,ki67和Bcl-2蛋白的表达水平明显下降,caspase-9和caspase-3蛋白的表达水平显著增加。结论敲低SphK1基因降低Bcl-2水平、增加caspase-9、caspase-3水平,抑制RKO结肠癌细胞增殖并促进其凋亡,并增强RKO细胞对DDP的敏感性。

TAGLN真核表达载体pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAG-LN-mut及稳定转染细胞株的构建

目的:构建携tagln基因的真核表达载体,建立稳定转染该质粒的人结肠癌细胞株RKO并鉴定.方法:通过Gateway克隆技术,使用pOTB7-TAGLN-mut与pDONR221进行BP重组反应产生入门克隆,再与pcDNA6.2/EmGFP-BsdV5-DEST空载体进行LR重组反应,生成目的质粒pcDNA6.2/EmGFP-Bsd/V5-TAGLN-mut通过测序验证目的质粒的插入序列.将携带tagln的真核表达载体和对照质粒稳定转染至人结肠癌细胞株RKO.通过实时荧光定量PCR和免疫印迹检测tagln的mRNA和蛋白表达水平.通过细胞侵袭实验了解transgelin在结肠癌细胞RKO中的作用.结果:携带tagln的真核表达载体测序分析显示插入序列及位点正确;实时荧光定量PCR及免疫印迹结果显示,稳定转染重组目的质粒的细胞株(RKO-TAGLN细胞)中tagln的表达水平与转染对照质粒的细胞株(RKO-CTRL细胞)及野生型RKO细胞相比明显上调,差异具有统计学意义(mRNA相对表达水平分别为45.58±12.79、1.32±0.43和1,P<0.01;蛋白质灰度定量值为1.69±0.04、0.29±0.05和0.29±0.04,P<0.01).细胞侵袭实验提示,RKO-TAGLN细胞较RKO-CTRL细胞的侵袭能力提高(161.76%±61.18%,P<0.01).结论:成功构建携tagln基因的真核表达载体并建立过表达transgelin的稳定细胞株和对照细胞株,为研究transgelin在结肠癌中的作用奠定基础.