ZNF205通过靶向RIG-I正调控RLR抗病毒信号通路

目的探究ZNF205(zinc finger protein 205)对RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)介导的RLR(RIG-I like receptors,RLRs)抗病毒信号通路的影响。方法采用免疫共沉淀、免疫印迹、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、双荧光素酶报告基因实验、实时荧光定量PCR、病毒空斑等实验探索ZNF205在RLRs信号通路中的作用。结果ZNF205与RIG-I相互作用。过表达ZNF205促进了SeV诱导的IRF3(interferon regulatory factor 3)的二聚化,也增强了RIG-I-N(aa1-284)介导或SeV诱导的IFN-β(interferon beta)启动子的活性,同时还增强了SeV诱导的IFN-β的转录。病毒空斑实验结果显示过表达ZNF205能够抑制病毒的复制。研究结果还表明,ZNF205促进RIG-I的泛素化修饰以及RIG-I的K63泛素化修饰。结论ZNF205在RLR抗病毒先天免疫信号通路中起正调控作用。

ZWINT在RLR抗病毒先天免疫信号通路中的作用

目的探究ZWINT(ZW10 interacting kinetochore protein)对TBK1(TANK-binding kinase 1)或仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的RLR(RIG-I like receptor)抗病毒先天免疫信号通路的影响。方法应用免疫共沉淀的方法检测ZWINT与RLR信号通路分子TBK1、VISA、RIG-I之间的相互作用;用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证ZWINT对TBK1或SeV诱导的IRF3二聚化的作用;利用双荧光素酶报告基因实验检测TBK1或SeV介导下ZWINT对干扰素启动子IFN-β的激活效果;通过实时荧光定量PCR实验检测ZWINT对SeV诱导的IFN-β转录的影响。结果 ZWINT与TBK1、VISA和RIG-I都有相互作用,过表达ZWINT增强了TBK1或SeV诱导的IRF3的二聚化水平以及IFN-β启动子的活性,此外,过表达ZWINT也加强了SeV诱导的IFN-β的转录。结论ZWINT是RLR抗病毒先天免疫信号通路中的正调控因子。

DUT通过靶向RIG-I正调控RLR介导的抗病毒信号通路

目的探究DUT(deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase, dUTPase)对RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)介导的RLR(RIG-I-like receptors)抗病毒先天免疫的研究。方法采用免疫共沉淀的方法检测DUT与RIG-I之间的相互作用以及DUT对RIG-I介导的泛素化修饰的影响;应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证DUT对RIG-I或仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的IRF3二聚化的作用;利用双荧光素酶报告基因实验检测RIG-I或SeV介导的DUT对干扰素启动子IFN-β的激活效果;通过实时荧光定量PCR实验检测DUT对SeV诱导的IFN-β转录的影响。结果 DUT与RIG-I相互作用,过表达DUT促进RIG-I或SeV诱导的IRF3的二聚化水平以及IFN-β启动子的活性。此外,过表达DUT也加强了SeV诱导的IFN-β启动子的转录水平,研究结果还表明DUT促进RIG-I泛素化修饰及RIG-I K63泛素化修饰,并且通过与RIG-I之间的相互作用增强RNF135、MEX3C、TRIM4介导的RIG-I K63泛素化修饰。结论 DUT是RIG-I介导的针对RNA病毒天然免疫应答的正调节因子。

USP26负性调控RLR信号通路对肠道病毒71型复制的影响

目的研究泛素特异性蛋白酶26(ubiquitin-specific protease 26,USP26)通过调控RLR信号通路影响肠道病毒71型(EV71)感染的机制和功能,深入了解EV71感染及其逃逸免疫防御关系,为临床治疗EV71感染提供依据。方法利用RT-PCR和Western blot分别检测EV71感染横纹肌肉瘤细胞(RD)0、2、4、8、12、24 h后的USP26 mRNA、VP1 mRNA及其蛋白质的表达水平;在RD细胞中设置转染USP26-siRNA(实验组)和转染阴性对照siRNA(对照组),再用EV71感染RD细胞,收集感染8、12和24 h时的mRNA样本,RT-PCR检测VP1 mRNA的表达情况;收集感染8 h时的蛋白质样本,Western blot检测细胞中MDA5、p-IRF3、IRF3蛋白的表达水平并计算p-IRF3/IRF3的相对比值;利用空斑试验检测病毒滴度水平。结果Western blot和RT-PCR结果表明,EV71感染过程中USP26的表达上调(P<0.05);RD细胞转染后实验组EV71中VP1 mRNA的表达水平明显低于同一时间的对照组(P<0.05),感染8 h实验组中MDA5蛋白和p-IRF3蛋白的表达水平均显著高于对照组(P<0.05);两组IRF3总蛋白的表达水平差异无统计学意义;空斑试验中实验组EV71的病毒滴度显著低于对照组(P<0.05)。结论USP26可通过负性调控RLR信号通路参与抗病毒免疫反应,敲减USP26可抑制EV71在细胞中的复制。

干扰素诱生及其抗病毒信号通路研究进展

固有性免疫应答是宿主快速抵抗微生物病原体的重要机制，其主要依赖表达于免疫细胞的模式识别受体（pattern rec-ognition receptor，PRR）识别诸如病毒双链RNA（dsRNA）、单链RNA（ssRNA）、非甲基化寡聚核苷酸基序（CpG）、病毒蛋白等病原相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），启动细胞内级联性信号转导途径，

解表清里方干预甲型H1N1流行性感冒小鼠的抗病毒作用机制

目的:探讨解表清里方对甲型H1N1流行性感冒小鼠的抗病毒作用机制。方法:用随机数字法将36只7周龄雌性BalB/c小鼠随机分为空白组、模型组、西药组及解表清里方高剂量组、中剂量组、低剂量组,每组6只。空白组给予等量生理盐水滴鼻,其余组小鼠给予甲型流感病毒液于左侧鼻孔滴鼻,每只50μL。造模2 h后,西药组给予0.037 5 g/(kg·d)磷酸奥司他韦灌胃;解表清里方高剂量组、中剂量组、低剂量组分别给予6.05 g/(kg·d)、3.02 g/(kg·d)、1.51 g/(kg·d)解表清里方灌胃。空白组及模型组同时给予生理盐水0.2 mL灌胃,均1次/d,连续5 d。对比各组肺指数、胸腺指数和脾脏指数,肺组织病理变化,肺组织中乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达,肺悬液中病毒基因及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、糖原合酶激酶3β(GSK-3β)mRNA表达,肺组织中PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表达。结果:动物实验结果显示,与模型组相比,西药组和中药高剂量组能降低小鼠肺指数(P<0.05),其他组别能降低肺指数、升高胸腺指数和脾脏指数,但差异无统计学意义(P>0.05);解表清里方高、中剂量组能减轻小鼠肺部病变程度,西药组、解表清里方高、中剂量组能降低小鼠肺组织中M、NS2病毒基因复制水平(P<0.01或P<0.05);西药组和解表清里方高剂量组能降低小鼠肺组织中mTOR表达水平;西药组、解表清里方高剂量和中剂量组均能显著下调PI3K、AKT和GSK-3β蛋白和mRNA的表达水平(P<0.01或P<0.05)解表清里方低剂量组在各个方面与模型组相差不显著。结论:解表清里方甲型H1N1流感小鼠有抗病毒作用,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT/GSK-3β信号通路中关键蛋白PI3K、AKT、GSK-3β、mTOR表达有关。

小RNA病毒调控宿主cGAS-STING信号通路的机制研究

天然免疫系统在宿主早期发挥抗病毒反应中具有重要作用。宿主模式识别受体(PRRs,如RIG-I、NOD2、cGAS样等受体)识别病原微生物结构上保守组分病原相关分子模式(PAMPs),进而激活下游级联信号通路,诱导干扰素或细胞因子等的产生,激活宿主的抗病毒天然免疫反应。病毒也可降解宿主的天然免疫信号通路分子或抑制其的激活.

异绿原酸A体外抗小反刍兽疫病毒活性及其作用机制研究

【目的】研究异绿原酸A(isochlorogenic acid A,IAA)体外抗小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminant virus,PPRV)的效果及其作用机制。【方法】采用MTT法测定IAA对非洲绿猴肾细胞(verda reno,Vero)的最大无毒质量浓度、半数细胞毒性质量浓度(50%cytotoxic mass concentration,CC_(50));空斑形成试验测定IAA的半数有效质量浓度(median effect mass concentration,EC_(50))并计算治疗指数(therapeutic index,TI);MTT法观察IAA对PPRV感染的Vero细胞活性的影响;采用空斑形成试验、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、免疫印迹试验和间接免疫荧光试验观察IAA对PPRV增殖和分布的影响;采用活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光探针、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)比色法和羟胺比色法分别检测IAA对PPRV感染细胞内ROS、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性的影响;采用免疫印迹试验检测IAA对PPRV感染细胞中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)、B细胞淋巴瘤-2蛋白(B cell lymphoma-2 protein,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达水平的影响。【结果】IAA对Vero细胞的最大无毒质量浓度、CC_(50)、EC_(50)分别为7.81、125.60、21.02 mg·L^(-1),TI值为5.98;IAA处理能显著抑制PPRV诱导的细胞病变及病毒在Vero细胞中的增殖;细胞活力显著高于病毒感染细胞;病毒噬斑形成数量、病毒F和N基因表达水平显著降低;宿主细胞胞浆内病毒分布显著减少。IAA能显著提高PPRV感染细胞SOD活性,清除病毒感染细胞内的ROS和MDA。经IAA处理的PPRV感染细胞中PI3K、AKT表达水平极显著提高,p-AKT表达水平显著降低,Bax/Bcl-2比值显著降低。【结论】IAA通过调节宿主细胞PI3K/AKT通路及其下游细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平来缓解PPRV感染引起的氧化应激反应,从而发挥其抗PPRV活性。

细胞因子信号传导抑制因子的生物学功能及对干扰素抗病毒作用的调节

细胞因子信号传导抑制凶子（suppressor of cytokine signaling，sots）是JAK（Januskinase）／STAT（signaltransducers and activators of transcription）信号传导通路特异抑制物。

Ⅲ型干扰素及其抗猪病毒性疾病研究进展

综述了Ⅲ型干扰素抗猪易感病毒研究进展,总结了Ⅲ型干扰素抗病毒机制及作为安全性抗病毒药物的优势,探讨了Ⅲ型干扰素及其抗猪病毒性疾病研究现状,重点阐述了Ⅲ型干扰素抗猪易感病毒作用及其防治猪病毒性疾病的相关应用和流行性猪易感病毒对Ⅲ型干扰素的免疫逃逸策略,分析了目前Ⅲ型干扰素未得到广泛应用的问题并提出了建议,展望了Ⅲ型干扰素作为安全性抗病毒药物的应用潜力及前景,以期为猪病毒性疾病的治疗提供理论依据及新思路。

外源性白介素17A激活PLC/PRF/5细胞内PI3K/AKT信号转导通路抑制HBsAg表达的研究

目的:研究外源性白介素17A(IL-17A)抗HBV活性及其可能存在的机制。方法:以分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的PLC/PRF/5细胞为模型,通过外源性IL-17A处理细胞48 h,化学发光微粒子免疫技术和细胞免疫荧光技术分析细胞上清液和细胞内HBsAg含量,并以荧光定量PCR法(FQ-PCR)和Western blot检测细胞内抗病毒基因及其蛋白含量;pISRE-TA-luc转染至细胞并以IL-17A处理细胞48 h,荧光素酶活性检测干扰素刺激反应元件(ISRE)活性;以Western blot分析IL-17A处理细胞48 h后PI3K/AKT信号转导通路分子蛋白表达水平,并以信号转导通路抑制剂LY294002进一步验证IL-17A能否通过PI3K/AKT信号转导通路发挥抗HBV活性。结果:外源性IL-17A处理PLC/PRF/5细胞后,细胞上清液和细胞内HBsAg含量显著降低,同时细胞内抗病毒蛋白MxA和OAS表达明显升高;IL-17A不能增强细胞内ISRE活性,但激活PI3K/AKT信号转导通路;通过LY294002抑制PI3K/AKT信号转导通路后,IL-17A抗HBV活性及其诱导抗病毒蛋白MxA和OAS表达效应显著被抑制。结论:IL-17A能够通过激活PLC/PRF/5细胞内PI3K/AKT信号转导通路诱导抗病毒蛋白表达,从而发挥抗HBV活性。

基于MAVS介导信号通路的补肾方抗炎抗HBV作用及机制研究

目的:观察补肾方对刀豆蛋白A(ConA)诱导HBV转基因小鼠肝损伤的抗炎及抗HBV作用机制。方法:24只HBV转基因小鼠随机分为3组,模型组及补肾方组小鼠按照体重予以3μg/g ConA尾静脉注射,正常组予以相应量生理盐水,每周1次,连续4周。造模后,补肾方组小鼠予以补肾方汤剂2.25g/kg体重灌胃,正常组及模型组小鼠予以等量生理盐水,每天1次,连续4周。观察各组小鼠处理前后血清丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸转移酶(AST)、乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV DNA)水平及肝组织病理变化,观察各组小鼠处理前后肝组织HBcAg表达及肝组织线粒体抗病毒蛋白(MAVS)介导信号通路关键蛋白表达。结果:补肾方可显著降低ConA诱导HBV转基因小鼠血清ALT、AST水平(P<0.01),减轻肝组织内炎性细胞的浸润及肝细胞的变性坏死;可显著降低小鼠血清HBsAg水平(P<0.05),降低肝组织内HBcAg的表达(P<0.001);可显著提高小鼠血清IFN-β水平(P<0.01),上调TBK-1、STING、pTAK-1(t183)的表达,下调TRADD的表达(P<0.05)。结论:补肾方具有减轻肝组织炎症、抗HBV作用,其作用机制与MAVS介导的信号通路有关。

E3泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白调控RLR信号通路抑制肠道病毒71型复制

目的探讨斑点型锌指结构蛋白[speckle-type POZ(pox virus and zinc finger protein)protein,SPOP]在肠道病毒71型(EV71)感染中的作用。方法免疫共沉淀分析SPOP对EV71非结构蛋白2A蛋白酶(2Apro)泛素化水平的影响,Western blot检测干扰素调节因子3(IRF3)蛋白磷酸化水平,过表达或敲低细胞中SPOP后感染EV71,RT-qPCR分析IFN-β转录水平,RT-qPCR和Western blot检测EV71结构蛋白VP1的转录水平及蛋白质水平。结果过表达HA-SPOP后感染EV71,发现EV71感染RD细胞受抑,同时EV71-2Apro的泛素水平呈HA-SPOP梯度依赖增多。转染shSPOP质粒进行内源性SPOP敲低后,黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、接头蛋白线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、磷酸化干扰素调节因子3(p-IRF3)水平呈剂量依赖地减少,而转染HA-SPOP质粒后,MDA5、MAVS、p-IRF3蛋白质水平呈剂量依赖地增加。SPOP高、低表达促进或降低EV71感染的细胞表达IFN-βmRNA,同时抑制和增加VP1在mRNA或蛋白质水平表达。结论SPOP可提高EV71-2Apro的泛素化水平从而促进2Apro降解,推测SPOP可通过抑制2Apro对视黄酸诱导基因蛋白-Ⅰ(RIG-Ⅰ)样受体(RLR)信号通路中关键分子MAVS和MDA5的降解,从而上调IRF3磷酸化水平促进IFN-β释放,最终活化宿主细胞抗病毒固有免疫抑制EV71复制。

热休克蛋白27对水泡性口炎病毒体外增殖的调控作用

本研究旨在探究热休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)体外增殖及VSV感染介导的维甲酸诱导基因I样受体家族(retinoid acid-inducible gene-I-like receptor, RLR)信号通路的作用及机制。利用实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、病毒滴度测定及免疫荧光等方法,首先检测VSV感染对HSP27 mRNA和蛋白表达的影响,进而验证过表达和干扰HSP27对VSV增殖的影响,进一步探究HSP27对VSV感染介导的RLR信号通路的影响,最后分析HSP27与RLR信号通路靶分子的相互作用及共定位情况。结果表明,VSV感染可促使HSP27基因转录和蛋白表达上调,稳定过表达和瞬时过表达HSP27均能显著抑制VSV的体外增殖;干扰宿主细胞中HSP27表达可促进VSV增殖。HSP27能够增强VSV及维甲酸诱导基因I蛋白(retinoic acid-inducible gene I protein, RIG-I)介导的IFN-β的产生及RIG-I的蛋白表达,而且HSP27与RIG-I相互作用并共定位于细胞质中。本研究揭示了HSP27靶向RIG-I上调其表达,增强RLR信号通路的转导,进而负调控VSV体外增殖,为深入揭示宿主因子HSP27在病毒感染中的作用机制奠定基础。

复方一枝蒿颗粒体外抗呼吸道合胞病毒的作用及对先天免疫信号通路的影响

目的研究复方一枝蒿颗粒体外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用及对病毒诱导激活先天免疫信号通路的影响。方法Viral Tox Glo法测定复方一枝蒿颗粒体外抗呼吸道合胞病毒的作用;Western Blotting法测定先天免疫通路蛋白表达的水平;流式微球技术测定细胞因子表达的水平。结果复方一枝蒿颗粒在体外对呼吸道合胞病毒有明显的抑制作用,且药物浓度与抗病毒作用呈量效关系;复方一枝蒿颗粒可促进先天免疫信号通路靶点核因子κB(NF-κB)抑制蛋白α、NF-κBp65蛋白的表达水平,降低TANK结合激酶1(TBK1)、丝氨酸/苏氨酸激酶的表达水平,对RSV病毒诱导表达的炎症因子白介素-2(IL-2)、IL-6、IL-10和肿瘤坏死因子-α有明显的干预作用,表现出下调趋势。结论复方一枝蒿颗粒可通过作用于先天免疫信号通路TBK1/NF-κB发挥免疫调节作用,从而达到抗呼吸道合胞病毒的作用。

METTL3抑制抗病毒先天免疫信号转导

目的进一步探究甲基转移酶样蛋白3(methyltransferase-like protein 3,METTL3)对抗病毒先天免疫信号转导过程的影响。方法在HEK293T细胞中过表达以及敲低METTL3,利用不同的病毒感染细胞后,通过免疫印迹法检测Ⅰ型干扰素信号通路中上游激酶TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)以及下游转录因子干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)和核因子κB(NF-κB)p65亚基活化情况,水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)复制标志分子VSV-G表达水平。通过尾静脉注射VSV建立小鼠感染模型,观察Mettl3敲除小鼠(Mettl3^(F/F;Mx1-Cre))和对照小鼠(Mettl3^(F/F))生存率以及肝系数和肺系数的变化情况;通过ELISA检测小鼠血清Ⅰ型干扰素IFN-α和IFN-β的产生情况。结果HEK293T细胞中过表达METTL3后TBK1、p65以及IRF3的磷酸化减弱,VSV-G的表达下降。小鼠VSV感染模型中,Mettl3^(F/F;Mx1-Cre)小鼠死亡率明显降低,肝系数下降,且血清中IFN-α和IFN-β的含量明显上升。结论过表达METTL3抑制TBK1-IRF3信号通路的激活,促进VSV的复制;在Ⅰ型干扰素反应性细胞中敲除Mettl3后,小鼠对VSV的抵抗力增强。METTL3作为一个负调控因子,抑制抗病毒先天免疫信号转导。

Toll样受体介导的先天性抗病毒免疫反应研究进展

TLRs是先天性免疫系统最重要的模式识别受体,通过识别病毒的PAMPs/DAMPs,活化依赖和非依赖于MyD88的信号通路,诱导Ⅰ-IFN、炎性因子和趋化因子等的释放,发挥抗病毒作用。现就TLRs的基本概况、结构特征、抗病毒信号通路及对不同病毒的天然免疫反应等相关研究进展进行简要综述。

Toll样受体介导的先天性抗病毒免疫反应研究进展

随着自然环境的不断变化,动物机体在自然界中生存面临着越来越多的挑战,特别是各种新型病毒的不断出现已经给动物机体的生存发展带来了诸多不利的影响。在这种环境下,动物机体的生存必然需要自身有一套独特强效的免疫系统。动物机体的免疫系统,按照先天性与否又分为两种,一种是先天性的免疫系统,另一种是获得性的免疫系统。

天然免疫RIG-I样受体LGP2在抗病毒免疫中的作用

RIG-I样受体(RLRs)是细胞质中重要的模式识别受体(PRRs),LGP2是其重要的家族成员之一。LGP2在抗病毒天然免疫应答中具有特殊功能,能够双向调控RIG-I、MDA5介导的I型干扰素(IFNs)信号通路。在不同病毒感染宿主的过程中,LGP2也表现出明显的功能差异。在双链DNA病毒中,LGP2在RIG-I介导的信号传导过程中起正向调节作用;在单链DNA病毒中,LGP2能够促进CARDs区失活的RIG-I与非典型泛素链结合,从而诱导I型IFNs产生;在双链RNA病毒中,正常表达可增强RIG-I、MDA5对dsRNA的识别能力;在正义单链RNA病毒中,LGP2参与对正义单链RNA病毒的识别过程;在负义单链RNA病毒中,LGP2有时可作为IFNs的诱导剂。另外,LGP2在适应性免疫应答中也发挥着重要作用,能够通过不同途径调控T细胞存活与凋亡。目前在调控RIG-I、MDA5介导的信号通路与抗病毒免疫应答中,尚不清楚LGP2发挥的确切功能和其作用机制,未来可进一步加深LGP2在细胞免疫应答中的作用及机制研究。本文就近年来LGP2在RLRs介导的信号通路和抗病毒免疫应答中发挥的作用作综述,以期为LGP2的进一步研究和机体抵御病毒感染新机制提供参考。

鳞翅目昆虫抗病毒免疫反应的研究进展

鳞翅目昆虫种类繁多,对农业生产和人类生活产生重大影响,宿主昆虫与病毒相互关系的研究对于利用病毒杀虫剂进行害虫治理和益虫病毒性疾病的预防具有重要意义。因此,鳞翅目昆虫与病毒的互作研究显得尤为重要,宿主昆虫的免疫系统在抗病毒感染过程中发挥着关键作用,对病毒产生不同程度的免疫反应。本文综述了昆虫围食膜和中肠对病毒入侵的防御作用,病毒进入体腔后昆虫所产生的细胞免疫和体液免疫反应,以及RNAi、细胞的自噬与凋亡、Toll、Imd、JAK-STAT和STING信号通路等相关的抗病毒免疫途径,并对昆虫抗病毒免疫研究的制约因素和未来鳞翅目昆虫抗病毒免疫的研究重点进行了讨论,以期为害虫的生物防治和益虫疾病的防控提供理论依据。