USP26负性调控RLR信号通路对肠道病毒71型复制的影响

目的研究泛素特异性蛋白酶26(ubiquitin-specific protease 26,USP26)通过调控RLR信号通路影响肠道病毒71型(EV71)感染的机制和功能,深入了解EV71感染及其逃逸免疫防御关系,为临床治疗EV71感染提供依据。方法利用RT-PCR和Western blot分别检测EV71感染横纹肌肉瘤细胞(RD)0、2、4、8、12、24 h后的USP26 mRNA、VP1 mRNA及其蛋白质的表达水平;在RD细胞中设置转染USP26-siRNA(实验组)和转染阴性对照siRNA(对照组),再用EV71感染RD细胞,收集感染8、12和24 h时的mRNA样本,RT-PCR检测VP1 mRNA的表达情况;收集感染8 h时的蛋白质样本,Western blot检测细胞中MDA5、p-IRF3、IRF3蛋白的表达水平并计算p-IRF3/IRF3的相对比值;利用空斑试验检测病毒滴度水平。结果Western blot和RT-PCR结果表明,EV71感染过程中USP26的表达上调(P<0.05);RD细胞转染后实验组EV71中VP1 mRNA的表达水平明显低于同一时间的对照组(P<0.05),感染8 h实验组中MDA5蛋白和p-IRF3蛋白的表达水平均显著高于对照组(P<0.05);两组IRF3总蛋白的表达水平差异无统计学意义;空斑试验中实验组EV71的病毒滴度显著低于对照组(P<0.05)。结论USP26可通过负性调控RLR信号通路参与抗病毒免疫反应,敲减USP26可抑制EV71在细胞中的复制。

ZNF205通过靶向RIG-I正调控RLR抗病毒信号通路

目的探究ZNF205(zinc finger protein 205)对RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)介导的RLR(RIG-I like receptors,RLRs)抗病毒信号通路的影响。方法采用免疫共沉淀、免疫印迹、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、双荧光素酶报告基因实验、实时荧光定量PCR、病毒空斑等实验探索ZNF205在RLRs信号通路中的作用。结果ZNF205与RIG-I相互作用。过表达ZNF205促进了SeV诱导的IRF3(interferon regulatory factor 3)的二聚化,也增强了RIG-I-N(aa1-284)介导或SeV诱导的IFN-β(interferon beta)启动子的活性,同时还增强了SeV诱导的IFN-β的转录。病毒空斑实验结果显示过表达ZNF205能够抑制病毒的复制。研究结果还表明,ZNF205促进RIG-I的泛素化修饰以及RIG-I的K63泛素化修饰。结论ZNF205在RLR抗病毒先天免疫信号通路中起正调控作用。

ZWINT在RLR抗病毒先天免疫信号通路中的作用

目的探究ZWINT(ZW10 interacting kinetochore protein)对TBK1(TANK-binding kinase 1)或仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的RLR(RIG-I like receptor)抗病毒先天免疫信号通路的影响。方法应用免疫共沉淀的方法检测ZWINT与RLR信号通路分子TBK1、VISA、RIG-I之间的相互作用;用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证ZWINT对TBK1或SeV诱导的IRF3二聚化的作用;利用双荧光素酶报告基因实验检测TBK1或SeV介导下ZWINT对干扰素启动子IFN-β的激活效果;通过实时荧光定量PCR实验检测ZWINT对SeV诱导的IFN-β转录的影响。结果 ZWINT与TBK1、VISA和RIG-I都有相互作用,过表达ZWINT增强了TBK1或SeV诱导的IRF3的二聚化水平以及IFN-β启动子的活性,此外,过表达ZWINT也加强了SeV诱导的IFN-β的转录。结论ZWINT是RLR抗病毒先天免疫信号通路中的正调控因子。

DUT通过靶向RIG-I正调控RLR介导的抗病毒信号通路

目的探究DUT(deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase, dUTPase)对RIG-I(retinoic acid-inducible gene I)介导的RLR(RIG-I-like receptors)抗病毒先天免疫的研究。方法采用免疫共沉淀的方法检测DUT与RIG-I之间的相互作用以及DUT对RIG-I介导的泛素化修饰的影响;应用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证DUT对RIG-I或仙台病毒(Sendai virus,SeV)诱导的IRF3二聚化的作用;利用双荧光素酶报告基因实验检测RIG-I或SeV介导的DUT对干扰素启动子IFN-β的激活效果;通过实时荧光定量PCR实验检测DUT对SeV诱导的IFN-β转录的影响。结果 DUT与RIG-I相互作用,过表达DUT促进RIG-I或SeV诱导的IRF3的二聚化水平以及IFN-β启动子的活性。此外,过表达DUT也加强了SeV诱导的IFN-β启动子的转录水平,研究结果还表明DUT促进RIG-I泛素化修饰及RIG-I K63泛素化修饰,并且通过与RIG-I之间的相互作用增强RNF135、MEX3C、TRIM4介导的RIG-I K63泛素化修饰。结论 DUT是RIG-I介导的针对RNA病毒天然免疫应答的正调节因子。

E3泛素连接酶斑点型锌指结构蛋白调控RLR信号通路抑制肠道病毒71型复制

目的探讨斑点型锌指结构蛋白[speckle-type POZ(pox virus and zinc finger protein)protein,SPOP]在肠道病毒71型(EV71)感染中的作用。方法免疫共沉淀分析SPOP对EV71非结构蛋白2A蛋白酶(2Apro)泛素化水平的影响,Western blot检测干扰素调节因子3(IRF3)蛋白磷酸化水平,过表达或敲低细胞中SPOP后感染EV71,RT-qPCR分析IFN-β转录水平,RT-qPCR和Western blot检测EV71结构蛋白VP1的转录水平及蛋白质水平。结果过表达HA-SPOP后感染EV71,发现EV71感染RD细胞受抑,同时EV71-2Apro的泛素水平呈HA-SPOP梯度依赖增多。转染shSPOP质粒进行内源性SPOP敲低后,黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、接头蛋白线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)、磷酸化干扰素调节因子3(p-IRF3)水平呈剂量依赖地减少,而转染HA-SPOP质粒后,MDA5、MAVS、p-IRF3蛋白质水平呈剂量依赖地增加。SPOP高、低表达促进或降低EV71感染的细胞表达IFN-βmRNA,同时抑制和增加VP1在mRNA或蛋白质水平表达。结论SPOP可提高EV71-2Apro的泛素化水平从而促进2Apro降解,推测SPOP可通过抑制2Apro对视黄酸诱导基因蛋白-Ⅰ(RIG-Ⅰ)样受体(RLR)信号通路中关键分子MAVS和MDA5的降解,从而上调IRF3磷酸化水平促进IFN-β释放,最终活化宿主细胞抗病毒固有免疫抑制EV71复制。

热休克蛋白27对水泡性口炎病毒体外增殖的调控作用

本研究旨在探究热休克蛋白27(heat shock protein 27, HSP27)对水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus, VSV)体外增殖及VSV感染介导的维甲酸诱导基因I样受体家族(retinoid acid-inducible gene-I-like receptor, RLR)信号通路的作用及机制。利用实时荧光定量PCR、免疫印迹、免疫共沉淀、病毒滴度测定及免疫荧光等方法,首先检测VSV感染对HSP27 mRNA和蛋白表达的影响,进而验证过表达和干扰HSP27对VSV增殖的影响,进一步探究HSP27对VSV感染介导的RLR信号通路的影响,最后分析HSP27与RLR信号通路靶分子的相互作用及共定位情况。结果表明,VSV感染可促使HSP27基因转录和蛋白表达上调,稳定过表达和瞬时过表达HSP27均能显著抑制VSV的体外增殖;干扰宿主细胞中HSP27表达可促进VSV增殖。HSP27能够增强VSV及维甲酸诱导基因I蛋白(retinoic acid-inducible gene I protein, RIG-I)介导的IFN-β的产生及RIG-I的蛋白表达,而且HSP27与RIG-I相互作用并共定位于细胞质中。本研究揭示了HSP27靶向RIG-I上调其表达,增强RLR信号通路的转导,进而负调控VSV体外增殖,为深入揭示宿主因子HSP27在病毒感染中的作用机制奠定基础。

鱼类microRNA在先天免疫中的研究进展

先天免疫是宿主识别病原及消除病原感染的第一道防线。模式识别受体是参与识别病原入侵的主要分子,主要包括Toll样受体、RIG-I样受体、NOD样受体和C型凝集素受体等。模式识别受体在识别病原相关分子模式后,激活机体的先天免疫信号通路,诱导炎症细胞因子和干扰素的产生,从而启动抵抗病原入侵的免疫应答。越来越多的证据表明,免疫应答的激活、维持和终止受到了严格的调节,使机体在保持一定免疫强度的同时避免产生过度的免疫反应。microRNA是一类长度为18~23 nt的微小非编码RNA,是鱼类先天免疫应答网络中的重要调控因子。近年来,microRNA在鱼类免疫学领域已开展了大量的研究,但缺乏对其进行及时地全面性的总结。本文综述了近年来miRNA在鱼类先天免疫反应中的研究进展,以期为鱼类的分子抗病育种及疾病防控研究提供一些思路。

鸭维甲酸诱导基因I克隆及其结构域功能分析

【目的】克隆鸭维甲酸诱导基因I(retinoic acid inducible gene I,RIG-I),分析其不同结构域的功能。【方法】根据GenBank上公布的鸭RIG-I序列设计引物,利用RT-PCR克隆鸭RIG-I基因CDS(coding sequence)区,根据保守结构域预测结果,构建携带6*his组氨酸标签的不同结构域缺失突变体的真核表载体(RIG-I-Full、RIG-I-N和RIG-I-C),转染鸡胚成纤维细胞DF1,经RT-PCR、间接免疫荧光方法鉴定重组质粒在细胞中转录与表达;同时,利用RT-qPCR检测RLR抗病毒信号通路中的IFN-β、Mx1和PKR等下游基因的表达变化。【结果】鸭RIG-I基因CDS区全长2 802 bp,共编码933个氨基酸;不同结构域缺失突变体的真核表载体转染DF1细胞后,重组蛋白均在DF1细胞中表达;RT-qPCR结果显示,N端能显著激活RLR通路上IFN-β、Mx1及PKR基因的表达上调。【结论】duRIG-I及不同区段均能在DF1细胞中表达,其中N端在调节RLR抗病毒信号通路下游基因的表达过程中发挥了重要作用。

中药复方HNA-1对地塞米松诱导小鼠胸腺萎缩的保护作用及对胸腺RLR信号通路的影响

目的:探讨中药复方湘艾一号方(HNA-1)对地塞米松诱导的胸腺萎缩、胸腺输出功能的保护作用及胸腺RLR信号通路表达的影响。方法:将C57BL/6小鼠,随机分为正常对照组、模型组、HNA-1低、中、高剂量治疗组,左旋咪唑组。观察各组小鼠胸腺形态改变,检测外周血中T细胞受体重排删除环(TRECs)的含量、CD4+T初始亚群细胞的比例,并检测胸腺组织RLR/MAVS/IFN-α/β通路的表达情况。结果:模型组小鼠胸腺严重萎缩,组织结构破坏明显,外周血TRECs下降;RIG-Ⅰ、MDA5、LGP2和IFN-α/β表达上调明显。与模型组比较,HNA-1治疗组小鼠胸腺指数改变不显著,但胸腺细胞数量增加,以中、低剂量组较为明显;外周血TRECs含量升高,尤以低剂量组差异明显(P<0.05)。且HNA-1可明显抑制胸腺RLR信号通路的表达,以中剂量组最为明显(P<0.05)。结论:HNA-1对地塞米松诱导的胸腺萎缩小鼠具有一定的治疗作用,以中、低剂量较为明显,其机制可能与调控RLR通路的表达情况相关。

基于RLR信号通路的去泛素化酶对EV71感染的调控机制研究

目的探讨基于维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RLR)信号通路的去泛素化酶对肠道病毒71型(EV71)感染的调控机制。方法将人横纹肌肉瘤细胞A-204分为空白对照组、空载质粒组、去泛素化酶组,空白对照组不作任何处理,空载质粒组转染10 nmol/L空载质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5),去泛素化酶组转染10 nmol/L去泛素化酶USP4过表达质粒48 h后加入EV71(MOI=0.5)。采用RT-PCR检测各组细胞中EV71 mRNA表达,Western blot检测各组细胞USP4、维甲酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、LGP2蛋白表达。结果空载质粒组细胞USP4蛋白表达明显低于空白对照组(P<0.05),去泛素化酶组细胞USP4蛋白表达明显高于空载质粒组和空白对照组(P<0.05)。空载质粒组和去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达明显高于空白对照组(P<0.05),去泛素化酶组细胞EV71 mRNA表达明显低于空载质粒组(P<0.05)。空载质粒组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显低于空白对照组(P<0.05),去泛素化酶组细胞RIG-Ⅰ、MDA5、LGP-2蛋白表达明显高于空载质粒组和空白对照组(P<0.05)。结论去泛素化酶USP4可能通过激活RLR信号通路而发挥抗EV71感染作用。

E3泛素连接酶RNF144B负调控天然免疫的分子机制

RNA病毒的RNA聚合酶缺乏校正活性,使得其突变频率较高,针对其研发疫苗难度大。RLR信号通路是抵御RNA病毒的重要天然免疫信号通路。RLR通路中两个主要成员RIG-Ⅰ与MDA5在识别病毒核酸后,激活下游信号通路的传导,引起Ⅰ型干扰素和促炎性因子的表达。近期,中国农业科学院兰州兽医研究所卢曾军研究员领导的研究团队在EMBO Reports杂志上发表了题为“RNF144B negatively regulates antiviral immunity by targeting MDA5 for autophagic degradation”的研究论文,该研究发现了一个新的RLR通路负调控分子E3泛素连接酶RNF144B,揭示了它通过催化MDA5发生K27和K33泛素化促进其通过自噬途径降解的分子机制;丰富了对RLR信号通路调控机制的认识,为病毒性疾病和自身免疫疾病的防治提供了潜在的新靶点。

DDX56对脑心肌炎病毒体外增殖的调控作用研究

目的探讨DDX56解旋酶在脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)感染A549细胞复制增殖过程中的调控作用。方法通过免疫印迹法、qPCR以及TCID50检测上调/下调A549细胞中DDX56并接种EMCV病毒,以空载组为对照组,分析其对病毒增殖的影响及对病毒感染引起的RLRs信号通路中关键接头蛋白活化的影响。结果A549细胞接种EMCV后,DDX56蛋白水平表达量逐步递增。过表达DDX56可以促进EMCV在宿主细胞中的增殖,干扰DDX56可以抑制EMCV在宿主细胞中的增殖。并且DDX56通过负调控RLRs信号通路中接头分子MAVS、TBK1、IRF3的活化实现对EMCV复制的正调控作用。结论DDX56促进EMCV增殖是通过抑制RLRs信号通路中接头蛋白的活化来实现的,为EMCV感染的固有免疫应答和调控研究奠定理论基础。