表达hβ2m-A24单链的RMA-S细胞系的构建及鉴定

目的构建人类白细胞抗原HLA-A24真核表达载体,并使其在小鼠细胞RMA-S获得稳定表达。方法采用PCR方法扩增出HLA-A24基因的重链,将其克隆到含轻链β2m的真核表达载体pcDNA3.1上,构建成表达完整HLA-24分子的真核表达载体。用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒,电转染RMA-S细胞,药物筛选稳定细胞系。蛋白印迹法和流式细胞鉴定HLA-A24分子在靶细胞表面的表达。结果成功构建了pcDNA3.1/A24真核表达载体,并使LA-A24分子在HLA-A24阴性的小鼠RMA-S细胞表面获得稳定表达。结论真核表达载体成功构建和稳定转染RMA-S细胞系的建立为进一步研究HLA-A24人群中多种疾病的细胞免疫、筛选和鉴定合适的T细胞抗原表位奠定了基础。

苹果酸舒尼替尼抑制膀胱癌T24细胞系的体外增殖

目的探讨苹果酸舒尼替尼对人膀胱癌T24细胞系体外增殖的影响。方法取人膀胱癌T24细胞系悬液,分别加入浓度为0.625、1.25、2.5、5、10和20μmol/L的苹果酸舒尼替尼,分别于24、48及72 h进行处理,用细胞毒抑制实验(MTT法)检测药物对其生长的影响。结果苹果酸舒尼替尼可浓度依赖地抑制人膀胱癌细胞系T24细胞增殖,当药物浓度>5μmol/L时,苹果酸舒尼替尼与顺铂比较,对T24细胞系具有更强的抑制作用(P<0.05)。这种抑制作用随着药物培育时间延长(24、48、72 h)而增强,表现为IC50值显著降低,但其抑制能力与顺铂比较无显著差别。结论苹果酸舒尼替尼可呈浓度和时间依赖地抑制膀胱癌T24细胞系增殖。

腺病毒介导的IL-24基因对胶质瘤细胞系U251拓扑异构酶Ⅱα及Caspase-3表达的影响

目的探讨腺病毒介导的IL-24基因(Ad5F35-hIL-24)对胶质瘤细胞系U251拓扑异构酶Ⅱα(topoⅡα)及Caspase-3表达的影响。方法应用腺病毒载体将IL-24基因转染U251细胞后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)方法观察Ad5F35-hIL-24对U251细胞的抑制作用;Hoechst33258荧光染色,以及流式细胞术测定细胞凋亡;应用免疫组织化学方法检测topoⅡα表达;免疫印迹法检测topoⅡα和Caspase-3蛋白质表达变化;Transwell实验观察Ad5F35-hIL-24对U251细胞侵袭力的影响。结果与对照组相比,Ad5F35-hIL-24对胶质瘤细胞有明显抑制作用,能显著诱导细胞凋亡,且呈浓度依赖性;免疫组织化学法显示,Ad5F35-hIL-24能明显抑制topoⅡα表达;免疫印迹检测表明,topoⅡα表达明显降低,而Caspase-3蛋白的表达水平增加;Transwell实验表明,Ad5F35-hIL-24能明显降低U251细胞的侵袭能力。结论外源性IL-24基因能显著抑制胶质瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡;topoⅡα及Caspase-3是其重要的作用靶点。该结果对于IL-24基因用于临床治疗胶质瘤有一定参考意义。

人膀胱癌T_(24)细胞系产生IL-6的条件探讨

利用IL-6分泌细胞株(人膀胱癌T_(24)细胞),建立了最佳天然IL-6产生条件和IL-6超诱生方法,IL-6分泌量最大可达15 576±1042.3μ/ml。同时对T_(24)细胞连续培养和冻存后IL-6产生水平进行了观察,表明该细胞分泌IL-6的能力十分稳定。

下调uPAR表达抑制高侵袭性人膀胱癌细胞系T24的迁移与侵袭

目的探究尿激酶型纤溶酶原激活物受体(u PAR)的表达对高侵袭性人膀胱癌细胞系T24体外增殖与侵袭的影响,以及哺乳动物靶向雷帕霉素靶蛋白复合物2(m TORC2)可能的作用。方法设计合成针对u PAR、Rictor、PTEN基因的siRNA和阴性对照NC siRNA。将对数增殖期T24细胞随机分为5组,并设为实验组siu PAR、siRictor、siRictor+siu PAR、siu PAR+si PTEN和对照组NC。用瞬时转染法将以上siRNA及相应组合分别转入5组T24细胞;分别用RT-qPCR和Western blot检测mRNA及蛋白的表达;用MTT法和Transwell侵袭实验分别检测u PAR siRNA对T24细胞增殖及侵袭的影响。结果 T24细胞中u PAR mRNA和蛋白的表达量显著上调(P<0. 05)。沉默u PAR能够显著下调T24细胞中磷酸化Akt Serine-473(P-Akt S473)的表达量(P<0. 05),并抑制T24细胞的迁移与侵袭(P<0. 05)。敲除PTEN基因的T24细胞中,沉默u PAR基因促进Akt S473磷酸化(P<0. 05)。结论沉默u PAR能够抑制T24细胞的迁移与侵袭,在T24细胞中u PAR可能是m TORC2的上游调控因子。

BLCAP基因干扰表达载体的构建及对膀胱癌细胞系T24增殖的影响

有研究发现抑癌基因BLCAP基因特异性表达于肌层非浸润性膀胱癌病灶中,而在浸润性膀胱癌中该基因表达下降。本研究在成功构建膀胱癌相关性抑癌基因BLCAP基因干扰表达载体的基础上,进一步研究BLCAP基因干预对膀胱癌细胞系T24增殖的影响。报告如下。

IL-24融合蛋白表达载体的构建及其对人小肠癌细胞的生长抑制作用

目的:构建人白细胞介素-24(IL-24)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达．研究IL-24融合蛋白对人小肠癌细胞(HIC)的生长抑制作用．方法:用PCR从质粒TRAP-hIL-24中扩增人 IL-24 cDNA片段,并将该片段插入DGEX-KG 原核表达载体中,实现插入基因的融合表达．用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定．提取并纯化IL-24融合蛋白,以不同浓度与 HIC细胞共培养72 h,同时设立相应浓度梯度的GST蛋白组、HIC细胞对照组及空白孔,采用MTT法检测各组人小肠癌细胞的体外增殖结果:酶切结果证实,成功地构建了pGEX- KG-IL-24原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr) 同预期值相一致,融合蛋白为Mr53 000,GST 蛋白为Mr29 000．IL-24融合蛋白以浓度依赖性的关系抑制HIC细胞的生长,并且在20和40 mg／L时的抑制率明显高于GST蛋白．结论:成功地构建了重组表达载体pGEX-KG- IL-24,并在E.coli BL21中表达．IL-24融合蛋白对HIC细胞生长有抑制作用．

IL-24对宫颈癌细胞株Siha细胞生长和凋亡的影响

目的:利用穿梭质粒pAd track CMV,探讨抑癌基因IL-24对宫颈癌细胞株Siha细胞生长和凋亡的影响。方法:将携带目的基因IL-24的穿梭质粒pAd track CMV转染入体外培养的宫颈癌细胞株Siha细胞,用MTT法检测细胞的生长增殖,用流式细胞术测定细胞周期及凋亡率。结果:经MTT法测定,3组Siha细胞OD值的总体差异有统计学意义(P<0.001),两两比较,IL-24组Siha细胞OD值明显低于空质粒组和阴性对照组(P<0.001),空质粒组和阴性对照组Siha细胞OD值则无明显差异(P=0.100);经流式细胞术测定,3组Siha细胞早期凋亡率的总体差异有统计学意义(P<0.05),两两比较,IL-24组Siha细胞早期凋亡率明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.05),空质粒组和阴性对照组Siha细胞的早期凋亡率无明显差异(P>0.05);与空质粒组和阴性对照组Siha细胞相比,IL-24组Siha细胞G0/G1期细胞增多(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05),G2/M期细胞减少(P<0.05),空质粒组和阴性对照组则无明显差异(P>0.05)。结论:IL-24对宫颈癌细胞有抑制生长、诱导凋亡的作用。

高侵袭性膀胱癌细胞系筛选及其裸鼠多器官转移模型的建立

目的通过体内培养筛选出高恶性度、高转移潜能的膀胱癌细胞系,构建膀胱癌裸鼠多器官转移模型,以期为进一步转移性膀胱癌的研究和诊疗奠定基础。方法将膀胱癌T24细胞系原位种植于裸鼠膀胱成瘤后（5周）,取出原位瘤进行细胞培养,经胶原酶消化处理后以RPMI1640培养液＋10%胎牛血清培养。采用差异性胰酶消化法进行传代以去除间质细胞。细胞系稳定传代（20代）后原位种植于6只裸鼠膀胱。5周后处死裸鼠,观察肿瘤局部浸润和远处转移情况。取下原位瘤体后,采用免疫组织化学法鉴定是否为膀胱尿路上皮来源。结果成功筛选出高侵袭性膀胱癌细胞系（T24M细胞系）,T24M的细胞形态稳定,已经传至第86代,细胞形态和生长速度均无明显变化,且T24M细胞冻存复苏后的生长状态良好。将T24M细胞系稳定传代后（20代）种植于6只雌性裸鼠膀胱,35d后处死,解剖后发现,6只裸鼠均荷瘤成功且发生远处转移,平均每只裸鼠发生远处转移的器官数为7个（5~9个）,包括髂血管淋巴结、腹膜后淋巴结和肝转移等,转移发生率为6/6,成功建立膀胱癌裸鼠多器官动物模型。免疫组织化学法检测,T24细胞系和T24M细胞系裸鼠膀胱原位肿瘤均高表达角蛋白CKAE1,可证实裸鼠肿瘤均来源于尿路上皮。结论膀胱癌裸鼠多器官转移模型成功建立。T24M细胞系和裸鼠多器官转移模型可用来进一步研究膀胱癌的发生、发展和转移机制。

HPLC检测白血病细胞系CYP3A5活性方法的建立与应用

目的建立白血病(AL)细胞系CYP3A5活性检测方法,研究化疗药对其活性的调控。方法HPLC法检测药物干预后AL细胞系CYP3A5活性。结果以1×106细胞、氢化考的松终浓度100μmol/L、孵育24h为AL细胞体外培养条件下氢化考的松6β-羟化活性检测的孵育条件。K562细胞CYP3A5活性显著高于HL-60、NB4和Jurkat细胞。柔红霉素作用24h后K562细胞CYP3A5活性增高,48h后活性显著增高;而NB4与Jurkat细胞在其作用后活性无改变。地塞米松作用24h后Jurkat细胞CYP3A5活性显著增高,48h后活性又显著增高。全反式维甲酸作用24h后NB4细胞CYP3A5活性显著增高,72h后活性又显著增高。结论HPLC检测AL细胞体外培养条件下氢化考的松6β-羟化活性方法的建立可用于研究AL细胞CYP3A5活性。柔红霉素、地塞米松、全反式维甲酸的应用可诱导某些AL细胞株CYP3A5活性。

膀胱癌组织中高表达的MTA2促进膀胱癌细胞T24的恶性生物学行为

目的:分析肿瘤转移相关蛋白(MTA2)在人膀胱癌组织中的表达及其对膀胱癌细胞系T24 恶性生物学行为的影响,探讨MTA2 对膀胱癌进展中的作用。方法:收集河北省人民医院2012 年12 月至2014 年12 月收治的62 例膀胱癌患者癌组织和28 例正常膀胱组织(取自膀胱炎患者,病理学诊断为正常组织)标本,通过免疫组织化学染色检测膀胱癌和正常膀胱组织中MTA2 的表达水平;分析MTA2 表达水平与患者临床病理特征的相关性。构建稳定高表达MTA2 的膀胱癌T24 细胞系,通过MTS、克隆形成、划痕愈合和Transwell 实验检测MTA2 对膀胱癌T24 细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。结果:与正常膀胱组织相比,膀胱癌组织中MTA2 呈明显高表达(P<0.01);MTA2 的高表达状态与膀胱癌患者的性别、年龄、肿瘤体积无关(P>0.05),而与患者更高的TNM分期、肿瘤的组织学分级、淋巴浸润和转移有关(均P<0.05)。在膀胱癌T24 细胞系中过表达MTA2 后,细胞的增殖活性明显升高(P<0.05),克隆形成、划痕愈合、迁移和侵袭能力均明显增强(均P<0.01)。结论:MTA2 在人膀胱癌组织中表达上调,能够促进T24 细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭等恶性生物学行为。

白细胞介素-24对破骨细胞功能及分化的影响

目的:研究白细胞介素-24(interleukin-24,IL-24)对破骨细胞分化及功能的影响。方法:从新生24 h内大鼠四肢长骨分离鉴定破骨细胞;确定AdCMV-EGFP的最佳感染复数(MOI),分别转染AdCMV-EGFP和AdCMV-IL-24,培养在骨片上,测定骨吸收陷窝的面积;real-time PCR方法检测在诱导条件下RAW264.7细胞转染AdCMV-IL-24后,破骨细胞相关因子的表达。结果:破骨细胞胞内可见2个以上的细胞核,TRAP染色呈紫红色;MOI=400为最佳转染效率;转染AdCMV-IL24的破骨细胞骨吸收陷窝面积比转染AdCMV-EGFP的细胞大(P<0.05);在诱导条件下RAW264.7细胞转染IL-24后,破骨细胞的相关基因NFATc1、CTSK和TRAP表达发生变化。结论:IL-24能促进破骨细胞的分化,提高破骨细胞的骨吸收功能。

大豆黄酮对人乳腺癌MCF-7细胞系体外增殖和细胞周期的影响

目的观察大豆黄酮对人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖及细胞周期的影响并探讨其作用机制。方法分别采用台盼蓝拒染法、流式细胞术,在不同条件下测定大豆黄酮对细胞增殖抑制率及细胞周期分布的影响。蛋白激酶C(PKC)活性通过测定转移到CK2底物上的[γ-32P]ATP的32P的放射性活度来检测。结果大豆黄酮能够显著地抑制MCF-7细胞的体外增殖,作用24h可使MCF-7细胞的细胞周期阻滞于G2/M期和S期。细胞内PKC活性分析表明:大豆黄酮能够显著地抑制MCF-7细胞内PKC的活性并呈剂量依赖性关系,其IC50为13.27μmol/L。结论大豆黄酮可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的体外增殖,其作用机制可能与细胞周期G2/M期和S期阻滞及抑制PKC的活性有关。

氧化吲哚类化合物Z24的体内抑瘤活性及其血管生成抑制作用(英文)

目的 从抗血管生成活性的角度 ,寻找新的抗肿瘤药物 ,研究Z2 4的体内抑瘤活性及其对血管内皮细胞的选择性抑制作用。方法 MTT法检测不同浓度的Z2 4作用 72h时对人肝癌细胞系BEL 74 0 2及正常人胚肺二倍体细胞 2BS的生长抑制作用 ,并从浓度 抑制率曲线求出IC50 ;台盼蓝拒染计数法检测不同浓度的Z2 4作用 72h时对人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)的生长抑制作用 ,从浓度 抑制率曲线求出IC50 ;小鼠S180 ,H2 2和裸小鼠皮下移植性人肝癌BEL 74 0 2模型研究Z2 4的体内抑瘤作用。鸡胚尿囊膜 (CAM )血管生成模型检测Z2 4的血管生成抑制活性。结果 MTT法测得Z2 4对BEL 74 0 2生长抑制作用的IC50 为 10 6 μmol·L- 1,对 2BS生长抑制作用的IC50 为 116 μmol·L- 1。台盼蓝拒染计数法测得Z2 4对HUVEC生长抑制作用的IC50 为 6 .4 4μmol·L- 1。Z2 4可明显抑制鸡CAM新生血管的形成Z2 4 10 0mg·kg- 1可使S180 ,H2 2和裸小鼠人肝癌BEL 74 0 2模型的肿瘤重量较对照组分别下降 5 2 .5 %(n =10 ,P <0 .0 1) ,4 1.5 % (n =10 ,P <0 .0 1)和5 3.4 % (n =6 ,P <0 .0 1)。Z2 4可显著抑制CAM的血管生成。结论 Z2 4对多种肿瘤动物模型均具有显著的体内抑瘤活性 ,对血管内皮细胞有选择性抑制作用 ,并明显抑制CAM新生血管的生成?

人膀胱癌T24细胞系高效诱生IL-6的方法探讨

寻找IL-6的最佳来源和最佳分泌条件是研究IL-6理化性质和生物学活性的前提,为此对人膀胱癌细胞系(T24细胞)的培养条件及其高效诱生诸方法进行了探索。

“人脐静脉内皮细胞系”ECV304实际上是人膀胱癌细胞系T24

细胞系间的交叉污染是全世界生物医学研究领域面临的重大难题之一。多项研究显示18％～36％的人肿瘤细胞系为假细胞系或身份不正确。以往假细胞系的鉴别主要依赖于细胞遗传学技术，由于缺乏准确详细的核型描述，且多数细胞系的核型极为复杂，因此识别假细胞系较为困难。短串联重复序列-聚合酶链反应（STR-PCR）技术的出现使得情况发生了很大的改变，目前已成为鉴定假细胞系最为可靠和迅速的方法，得益于这一技术，近年来大量假细胞系得以识别。

金点口蘑子实体提取物(22E,24R)-麦角-7,22-二烯-3β,5α,6β-三醇对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1的刺激作用

对39种日本秋田县产蘑菇的提取物诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的分化活性进行筛选，以期寻找抗骨质疏松的化合物。

IL-24在母胎界面的表达及其对TEV-1细胞侵袭能力的影响

目的:研究IL-24在早孕期母胎界面的表达及其对绒毛外滋养细胞系TEV-1体外侵袭能力的影响。方法:免疫组化法检测早孕期绒毛及蜕膜组织中IL-24的表达情况;MTT法检测人重组IL-24蛋白对TEV-1细胞增殖的影响;用Transwell小室体外侵袭实验,分析绒毛外滋养细胞在IL-24作用下的侵袭能力。结果:早孕期绒毛及蜕膜组织均有IL-24的表达,分布于绒毛柱、滋养细胞、间质及血管内;不同浓度的人重组IL-24蛋白对TEV-1细胞增殖无影响;人重组IL-24对TEV-1细胞的侵袭能力有抑制作用,并呈一定的浓度依赖性。结论:IL-24可抑制TEV-1细胞的侵袭能力,因此早孕期母胎界面产生的IL-24可能影响滋养细胞的侵袭过程,在妊娠过程中有重要意义。

蛋白激酶C-α在调节人膀胱癌T24细胞多药耐药中的作用

目的探讨蛋白激酶C-α(PKCα)对人膀胱癌T24细胞多药耐药的调节作用。方法将载有PKCα基因的表达质粒GFP-PKCα导入人膀胱癌细胞系T24。应用噻唑蓝(MTT)比色法,检测T24/PKCα及亲本细胞对阿霉素的敏感性,以及在激活(10nmol/LPMA2h)和抑制(10nmol/LCalphostinC2h)PKCα的情况下,T24/PKCα细胞对阿霉素敏感性的变化。同时用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多药耐药基因-1(MDR-1)、多药耐药相关蛋白(MRP)和肺耐药相关蛋白(LRP)基因的表达。结果转染了PKCα基因后,T24细胞对阿霉素的耐药性增强(耐药指数7.52,P<0.05)。PKCα的激活显著提高了T24细胞的耐药性(耐药指数153.78,P<0.01),而抑制PKCα活性则使耐药指数降至1.20(P>0.05)。T24/PKCα的MDR-1表达水平是亲本细胞的2.28倍(P<0.01)。激活PKCα可使MDR-1基因表达水平较亲本细胞升高12.80倍(P<0.01),抑制PKCα则MDR-1表达下降(P>0.05),而MRP和LRP基因表达水平并无明显变化(P>0.05)。结论PKCα可能通过上调MDR-1表达,在人膀胱癌的化疗耐药中起到了重要的作用。

CX43对S24细胞裸鼠脑移植瘤放射敏感性影响

目的:研究缝隙连接蛋白43(CX43)对胶质母细胞瘤(S24-GBM)细胞间网络连接的影响及其在GBM放射抵抗中的作用。方法:采用基因敲除S24-GBM干细胞(S24-GBMSCs)表面CX43的表达或生胃酮(CBX)特异性阻断CX43的功能后,用多光子激光扫描显微镜观察S24-GBMSCs移植裸鼠大脑中肿瘤细胞表面微管(TMs)的形成和小分子物质(Ca^2++和SR101)在细胞间的传递。采用MRI检测放射对GBM体积变化的影响,记录和分析裸鼠生存时间。结果:与对照组相比,敲除CX43基因后S24-GBMSCs的TMs明显缩短,TMs参与形成的网络连接减少;细胞间Ca^2+同步性和SR101扩散能力下降,肿瘤体积缩小,荷瘤裸鼠生存时间显著延长(P均<0.01);CBX可以抑制Ca^2+和SR101的扩散,延缓GBM的生长,但不影响TMs的形成(P>0.05)。采用CBX阻断TMs形成缺陷的S24-GBMSCs表面CX43的功能可以进一步增强上述效应,提高S24-GBM对放射的敏感性(P均<0.05)。结论:CX43参与S24-GBM细胞间网络连接的形成,影响细胞间信号分子的传递,在S24-GBM放射抵抗中起着重要作用。