RNA Interference-Mediated Gene Silencing of Vascular Endothelial Growth Factor

OBJECTIVE To inhibit the expression of the vascular endothelial growth factor (VEGF) by RNA interference, and to observe the effect in different cells line. METHODS Using the services of E-RNAi, we designed and constructed two kinds of shRNAs expression vectors which were aimed at the VEGF gene. These vectors were then transfected into HEK293, colon cancer HT29, Hela and HepG2 cells by LipofectamineTM 2000. The level of VEGF mRNA was determined by RT-PCR and Northern blotting and the VEGF expression was examined by immunofluoresence staining. RESULTS The two kinds of VEGF specific shRNAs expression vectors were found to efficiently inhibit the expression of VEGF in HEK293 and HT29 cells by RT-PCR analysis, with inhibition rates of 72% and 42%, respectively; but the inhibition rates were reduced to 28% in Hela cells and 13% in HepG2 cells. Northern blotting showed that the inhibition rates of VEGF mRNA expression were 88% and 89% in HEK293 and HT29 cells, respectively. The inhibition rate of VEGF protein expression in HT29 cells was 73% based on immunofluoresence staining. CONCLUSION The expression of VEGF was inhibited by RNA interference, but differed with various cells lines, showing that RNA interference was cell-line dependent.

RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子表达

目的:应用RNA干扰技术抑制血管内皮生长因子(VEGF)表达。方法:将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,再转染人胚肾细胞HEK293、结肠癌细胞HT29、宫颈癌细胞Hela和肝癌细胞HepG2,通过RT-PCR、Northern杂交和免疫荧光观察VEGF表达受抑的程度。结果:成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR发现其在HEK293和HT29细胞系中,能明显抑制VEGF基因的表达,抑制率分别为72%和42%,但在Hela和HepG2细胞中的抑制率仅为28%和13%;Northern杂交显示,在HEK293细胞和HT29细胞中,VEGFmRNA明显受抑,抑制率达88%和89%;免疫荧光显示,在HT29细胞中,VEGF蛋白表达的受抑制率为73%。结论:针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制VEGF基因的表达,但在不同细胞系中的作用强度存在差别。

RNA干扰抑制结肠癌细胞血管内皮生长因子表达

目的:应用RNA干扰技术抑制结肠癌血管内皮生长因子(VEGF)表达。方法:将VEGF基因作为RNA干扰的靶区,通过E-RNAi网上提供的服务,设计两个特异的RNA干扰序列,将其装入含U6启动子的载体上,构建成抗VEGF基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,再转染人结肠癌细胞HT29,通过RT-PCR、Northern blotting、免疫荧光和Western blotting,观察VEGF表达受抑的程度。结果:成功构建了两种抗VEGF基因的shRNA表达载体,RT-PCR、Northern blotting、免疫荧光和Western blotting,均发现其能明显抑制HT29细胞VEGF基因的表达,抑制率分别达42%、88%、73%和82%。结论:针对VEGF基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞VEGF基因的表达。

RNA干扰对SKOV3卵巢癌细胞株Skp2表达的抑制作用

目的:探讨RNA干扰(RNAi)技术对SKOV3卵巢癌细胞株Skp2表达的抑制作用。方法:设计合成针对Skp2的小干涉RNA(siRNA)并进行转染。实验分为空白对照组、转染组1、转染组2、转染对照组及阴性对照组。采用Real time PCR和Western blotting技术检测各组Skp2mRNA和蛋白水平的变化,通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测各组卵巢癌细胞增殖情况。结果:应用Skp2-siRNA干扰SKOV3卵巢癌细胞株后,转染组1、转染组2的Skp2mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞增殖明显受限,与空白对照组相比较,差异有统计学意义(P<0.05),转染组1与转染组2之间差异无统计学意义(P>0.05)。转染组1与转染组2基因沉默效率分别为75.31%和76.86%,蛋白抑制率分别为62.10%和63.11%,细胞增殖抑制率分别为52.75%和53.06%。结论:RNAi技术能够抑制SKOV3卵巢癌细胞株Skp2的表达,从而抑制卵巢癌细胞的增殖。

靶向抑制HIF-1α基因对舌癌细胞增殖活性的影响

目的研究靶向抑制乏氧诱导因子(HIF)-1α基因对Tca8113及Tscca舌癌细胞株增殖的影响。方法将HIF-1α基因的短发夹干扰RNA(shRNA)的表达载体与空载质粒分别转染人舌癌细胞中作为siHIF-1α组和空载组,半定量RT-PCR及Western blot法检测HIF-1α的mRNA及蛋白表达。软琼脂克隆形成实验观察细胞的增殖;细胞计数法检测活细胞的数量;流式细胞分析术检测细胞周期的分布;同时将舌癌细胞接种至裸鼠皮下,观察体内的成瘤情况。结果 HIF-1αshRNA质粒转染舌癌细胞株后,HIF-1α的mRNA及蛋白表达明显下降。siHIF-1α组细胞在软琼脂中形成克隆的能力显著下降。细胞计数表明siHIF-1α组活细胞数量减少。转染后乏氧培养48 h si HIF-1α组细胞周期阻滞于G0/G1期。舌癌细胞移植到裸鼠体内数天后siHIF-1α组成瘤体积明显小于空载组(P<0.05)。结论 HIF-1α基因能够促进舌癌细胞增殖活性,有可能成为未来治疗舌癌的一个潜在作用靶点。

MTA1沉默抑制鼻咽癌转移能力的体外研究

目的探究MTA1基因敲除后对鼻咽癌细胞株5-8F细胞转移能力的影响。方法设计并构建针对MTA1基因的RNAi片段,脂质体(LipofectamineTM2000)介导Si-MTA1-01(Si-MTA1-01组)和Si-MTA1-02(Si-MTA1-02组)感染5-8F细胞,同时设无义序列转染组(Si-ctr组)为对照。应用荧光定量PCR和蛋白印迹法检测转染后各组细胞的MTAl mRNA和蛋白表达;细胞划痕实验、基底膜侵袭实验和细胞黏附实验检测转染后5-8F细胞迁移和侵袭能力的变化,并进行比较分析。结果与Si-ctr组相比,Si-MTA1-01和Si-MTA1-02组MTA1 mRNA及蛋白表达水平下降,穿膜细胞数减少,细胞黏附率增加(均P<0.05),划痕实验显示细胞阻滞效果明显。结论沉默MTA1能明显减弱鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力,MTA1有望成为治疗鼻咽癌的有效靶点。

基因芯片分析RNA干涉MSP58后细胞周期相关基因表达的变化

目的:采用基因芯片技术,观察RNA干涉法抑制人脑胶质瘤U251细胞MSP58基因表达后细胞周期相关基因的变化,从而了解MSP58在细胞周期相关基因通路中的可能定位。方法:将特异性的MSP58干涉表达载体pSilencer3.1-MSP58转染人脑胶质瘤细胞系U251,同时构建相应的阴性对照载体pSilenc-er3.1-NC以及空载体pSilencer3.1-H1neo。运用半定量RT-PCR及蛋白质印迹法,检测稳定转染和未转染干涉载体的胶质瘤细胞MSP58的mRNA和蛋白表达水平。运用基因芯片技术分析pSilencer3.1-MSP58转染后细胞周期相关基因的变化。结果:成功建立了具有稳定下调MSP58基因表达的U251-S细胞、阴性对照U251-NC细胞以及含有空载体的U251-H1neo细胞。干涉组细胞MSP58的表达无论在mRNA水平还是在蛋白质水平均较阴性对照组及空载体组细胞显著降低,P<0.01。基因芯片技术共筛选细胞周期相关基因128个,其中上调及下调>2倍的共有33个基因。结论:干涉MSP58基因表达后,胶质瘤细胞增殖的抑制与细胞周期相关基因表达的变化有关。

Antisense expression of protein kinase Cα improved sensitivity to anticancerdrugs in human lung cancer LTEPa-2 cells

目的：研究蛋白激酶Ｃα（ＰＫＣα）在人肺癌ＬＴＥＰａ２细胞对一些临床抗肿瘤药物敏感性中的作用．方法：通过基因转染，免疫印迹等方法建立表达反义ＰＫＣα的人肺癌细胞模型，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹检测多药抗性基因的表达，分析了几种抗癌药物对培养细胞的ＩＣ５０．结果：表达反义ＰＫＣαＲＮＡ降低胞内ＰＫＣα水平时可抑制肺癌细胞中多药抗性基因的表达，增强肺癌细胞对抗肿瘤药物（三尖杉酯碱、卡铂、博来霉素、长春新碱、阿霉素）的敏感性．

FANCF-shRNA质粒构建及其对卵巢癌细胞OVCAR3沉默效应的观察

目的:构建针对人FANCF基因的特异性shRNA真核表达载体,体外观察siRNA对卵巢癌OVCAR3细胞系FANCF基因的沉默效应。方法:采用基因克隆技术,将设计合成的能表达短发夹RNA的寡核苷酸序列插入真核表达质粒载体pSilencerTM4.1-CMV-neo,构建能表达FANCF-shRNA的真核表达载体;转染人卵巢癌OVCAR3细胞,提取总RNA和蛋白,RT-PCR验证mRNA表达的变化,蛋白质印迹法验证蛋白表达的变化。结果:质粒酶切和测序证实成功构建了FANCF-shRNA的真核表达载体。与野生型OVCAR3相比,脂质体法转染卵巢癌OVCAR3细胞后,FANCFmRNA 24、48和72 h的表达水平与阴性控制组比较均下调,抑制率分别为(23.91±6.58)%(、51.23±5.86)%和(47.42±7.52)%;FANCF蛋白在244、8和72 h的表达水平与阴性控制组比较亦下调,抑制率分别为(16.28±5.46)%(、24.42±6.85)%和(36.05±8.26)%。证实FANCF-shRNA具有沉默OVCAR3细胞FANCF基因表达的效应。结论:siRNA-FANCF干扰可引起卵巢癌OVCAR3细胞系FANCF基因沉默,可能为卵巢肿瘤基础和临床研究提供一种有效的方法。