乙型肝炎病毒RNA检测试剂国家参考品的研制

目的:研制乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)RNA检测试剂国家参考品并制定其质量标准。方法:收集并筛选HBV RNA阳性和阴性血浆样本,制备HBV RNA候选参考品。采用不同企业的试剂进行协作标定,根据协作标定结果确定参考品的组成及制定质量标准,并考察其均匀性和稳定性。结果:HBV RNA检测试剂国家参考品由10份阳性参考品,10份阴性参考品,1份精密度参考品和1份灵敏度参考品组成。其质量标准:阳性参考品符合率为10/10;阴性参考品符合率为10/10;精密度参考品稀释10倍后重复检测10次,要求CV≤5%;最低检测限不高于2.1×10^(3)U·mL^(-1)。该参考品均匀性符合要求,室温(25℃)放置3 d、反复冻融3次均未影响参考品的稳定性。结论:研制了首批HBV RNA检测试剂国家参考品并制定了质量标准,为相关试剂的质量控制和评价提供依据。

RNA荧光定量标准品制备新方法的探讨

目的以丙型肝炎病毒(HCV)为例,介绍一种简便快速的RNA定量标准品的制备方法。方法RT-PCR扩增目的片段,产物以pGEM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH 5α,经筛选和测序鉴定,阳性质粒体外转录合成cRNA,准确定量后作为标准品。结果RNA标准品具有较大的线性范围(109cop ies/m l^10 cop ies/m l),批内和批间重复性也较好,CV分别为1.68%~5.97%和6.40%~10.58%。结论此法制备的RNA标准品具有较好的检测灵敏度和特异性,适合临床推广应用。

RNA病毒检测质控物质—大肠杆菌噬菌体MS2标准样品的研制和应用

目的研制大肠杆菌噬菌体MS2标准样品,以其作为RNA病毒检测质控物质,建立RNA病毒检测全过程的质量控制体系。方法利用液体培养法制备大肠杆菌噬菌体MS2标准样品;采用双层琼脂法对标准样品进行稳定性、均匀性测定并定值;将标准样品添加于贝类样品中,应用于贝类诺如病毒实时荧光检测全过程质量控制。结果该标准样品稳定性与均匀性良好,定值为(1.57±0.0288)×10^(11) pfu/m L;保质期为12个月;在4种不同贝类样品中,病毒提取效率在3.70%~7.84%之间,符合国际标准ISO 15216:2-2013的病毒提取效率大于1%的要求。结论该研究制备的大肠杆菌噬菌体MS2标准样品可以对RNA病毒检测全过程进行良好的质量控制,具有良好的应用前景。

RNAa:一种新型的反标准ncRNA调控基因表达模式

RNA激活(RNA activation,RNAa)是目前最新发现的一种反标准非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)调控模式,它由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子介导,在转录水平激活目的基因表达。有别于传统的RNA调控方式,RNAa调控中既存在dsRNA与靶基因间的空间偶合作用,又具有RNA干扰(RNA interference,RNAi)样的序列互补依赖性,在保持较高特异性的前提下,能够人为地选择多个靶位点实现目的基因激活。RNAa靶向于基因启动子的非CpG岛及Alu区,并受组蛋白H3的甲基化及乙酰化状态影响,和RNAi的沉默效果相比,RNAa的激活作用更为持久,为肿瘤、代谢及遗传性疾病的治疗提供了一个新的方法。现就RNAa的发现、作用机制以及应用前景进行了综述,并比较了RNAa与传统ncRNA调控的联系与区别。

RNA标准物病毒样颗粒表达系统的构建及其特性研究

为了构建RNA病毒样颗粒(virus-like particles,VLP)表达系统pET28a(+)-MS,将插入的外源基因诱导表达获得相应的RNA标准物质病毒样颗粒,将MS2噬菌体包膜蛋白和成熟蛋白基因插入表达质粒pET-28a(+),构建pET28a(+)-MS重组子,将带有包装位点序列的外源RNA对应的cDNA插入成熟蛋白基因的下游,经过诱导表达含外源RNA病毒样颗粒。结果表明,pET28a(+)-MS能表达活性的包膜蛋白(49.8ku)和成熟蛋白(14.4ku),能将外源基因RNA包装成病毒样颗粒,该VLP长度约1 500bp,RT-PCR反应性优良,能耐受RNase的降解,在血清中37℃经1个月未有明显降解。

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

为快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),本研究针对PRRSV的N蛋白基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,以体外转录的RNA作为标准品,设计并优化了检测PRRSV的TaqMan荧光定量PCR方法。应用该方法检测其它主要猪病病原,结果均呈阴性;针对PRRSV阳性RNA的检测灵敏度可以达到10拷贝,比常规PCR灵敏10倍～100倍;结果表明,本实验建立的PRRSV TaqMan荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。应用建立的方法测定攻毒猪血清中病毒的含量,免疫攻毒组和非免疫攻毒组在第7 d血清中病毒的载量差异不显著,而在第14 d差异显著,免疫攻毒组猪血清中病毒载量明显低于未免疫组。

猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

【目的】建立一种能够实际应用于猪瘟兔化弱毒疫苗中猪瘟病毒含量检测的荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中登录号为AF091507的猪瘟病毒（CSFV）兔化弱毒株的全长基因组序列,在其5′非编码区设计2对特异性引物（标准品引物、定量引物）和1条探针（qPCR-P）,通过标准品引物进行RT-PCR扩增及T7 RNA聚合酶体外转录构建标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR检测方法,并采用该法对成品猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行检测。【结果】成功构建了体外转录的标准品RNA,建立了检测猪瘟兔化弱毒的荧光定量PCR方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,比RT-nPCR方法的灵敏度高出1个数量级;该法对标准品RNA检测的线性范围为1.0×108~1.0×102拷贝/μL。对1.0×108,1.0×106,1.0×103拷贝/μL 3种稀释度的标准品RNA进行重复性试验,批内变异系数分别为0.54%,0.52%和0.39%;批间变异系数分别为1.47%,1.85%和1.01%,具有良好的可重复性。应用该方法对不同厂家猪瘟兔化弱毒疫苗中的病毒含量进行测定,可知同一厂家脾淋苗中的病毒含量比细胞苗高出1~2个数量级,而不同厂家同一类型疫苗中病毒含量也有差异,其中脾淋苗差异不大,而细胞苗间的差异较大,最高可达27.2倍。【结论】建立的猪瘟兔化弱毒荧光定量PCR方法,具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为实际工作中对猪瘟兔化弱毒疫苗的质量监控提供了重要的技术支撑。

牛病毒性腹泻/黏膜病病毒荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】设计一种能够快速检测出牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)的方法。【方法】依据GenBank公布的BVDV 5′UTR基因属于特异性保守区域的前提,构建具有特异性的探针和引物,以体外转录病毒RNA作为绝对定量标准品。对荧光定量RT-PCR方法的各反应条件进行优化,创建BVDV荧光定量PCR检测方法。【结果】5.026 7 copies·μL^(-1)是此检测方法的最低下限值,该方法拥有良好的重复性,变异系数在组内、组间均<1%。特异性较高,对其他病毒核酸的扩增均为阴性,如猪瘟病毒、口蹄疫病毒等。【结论】建立的BVDV荧光定量PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,为牛病毒性腹泻的早期诊断提供了重要的技术支撑。

用荧光定量RT-PCR方法检测猪瘟病毒

为了建立能特异检测不同基因型猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV),同时又能区分其他瘟病毒的基因检测方法,本实验针对CSFV基因组5′端非编码区设计并合成了简并引物和TaqMan探针,在优化反应条件的基础上,成功地建立了特异检测CSFV的荧光定量RT-PCR检测方法。再以已知滴度的CSFV石门株血毒总RNA反转录产物建立标准品,该标准品可以用于定量临床样品中的CSFV滴度,所建立的荧光定量PCR方法可以灵敏地检测出10^(-0.82)个TCID_(50)病毒含量。最后用建立的方法对108份临床样品进行检测并同时进行病毒分离,荧光定量PCR方法检测出73份阳性样品且与病毒分离的符合率为100%,而常规RT-PCR只检测出54份阳性样品,表明本荧光定量RT-PCR法在检测猪瘟病料上具有潜在的应用价值。

草鱼TBK1基因荧光定量PCR检测方法的建立

TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)基因在天然抗菌免疫中发挥重要作用,为研究该基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)抗病天然免疫中的表达水平,本研究根据已报道的草鱼TBK1基因(ciTBK1)序列,设计特异性引物2对,基于ciTBK1和18S rRNA双标准曲线建立了荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测方法。结果表明,建立的标准曲线Ct(Cycle thrshold)值与模板浓度的对数呈现良好的线性关系(R^(2)均大于0.99),建立的qRT-PCR检测方法能特异地定量检测ciTBK1基因,检测灵敏度可达50拷贝/μL,且组内及组间变异系数均小于5%。所建立的qRT-PCR检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性。

以主要流行EV71 VP1基因高度保守区为靶点的TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

在我国,肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)C4型是引起手足口病的主要流行基因型。为建立EV71C4型TaqMan荧光定量PCR检测方法,在C4型EV71VP1基因的高保守区,设计合成引物和TaqMan探针,将包含此目的区段的基因片段克隆到pcDNA3.1载体中,通过体外转录获得标准品,并以梯度稀释的标准品为模板建立工作曲线,进而在优化反应条件的基础上建立TaqMan荧光实时定量PCR检测方法。实验中,所设计引物、探针的高度保守性保证了C4型EV71的高效扩增。经反应条件优化,引物和探针的最佳工作浓度分别为300 nmol/L和200 nmol/L,在1×10~301×10~3拷贝数检测范围内具有良好的线性关系(R^2=1),灵敏度可达到10~2 copies/μL。通过对该方法进行检验发现,批间和组间重复实验的变异系数均小于0.5%,且该方法对柯萨奇A16(coxsackievirus A16,CA16)柯萨奇B1(coxsackievirus B1,CB1)人轮状病毒(human rotavirus,HRV)单纯疱疹病毒2型(herpes Simplex virus type 2,HSV-2)均无交叉反应,对6份EV71阳性样本检出率为100%。以上数据表明,文中建立的TaqMan荧光定量PCR方法可为我国主要流行C4型EV71感染的快速诊断及疾病监控提供有效途径。

16S核糖体RNA基因片段分析及在药品葡萄球菌污染控制应用中的探讨

目的:建立细菌16S核糖体RNA基因片段分析的规范化方法,探讨其在药品葡萄球菌污染控制中的应用。方法:对Genbank数据库中用于常见细菌污染物鉴定的核酸序列进行筛选、定位和分区比较分析,建立具有鉴定和分类意义的标准核酸序列片段;以葡萄球菌为例进行菌株的核酸测序鉴定,分析菌株间的聚类关系和核酸序列的多样性。结果:16S rRNA基因中的V1~V3可变区具有显著的鉴定和分类意义,可实现葡萄球菌属20个"种"水平的鉴定。结论:本文对16S rRNA基因核酸测序鉴定规范化方法及在制药行业中葡萄球菌污染控制的应用进行探讨,为细菌核酸测序鉴定标准化和标准核酸序列数据库建设提供研究思路和参考依据。

体外转录法制备南芥菜花叶病毒RNA标准品

本研究根据南芥菜花叶病毒外壳蛋白基因保守序列,设计合成了1对引物,在上游引物的5′端引入T7启动子,采用RT-PCR方法获得了体外转录模板,并对转录产物RNA的浓度及OD值进行了测定。将制备的RNA标准品10倍梯度稀释后制作实时荧光定量RT-PCR标准曲线,并利用实时荧光定量RT-PCR对所获得的RNA标准品进行稳定性指标的检测。结果表明,该模板具有良好的线性关系,相关系数为0.9989。该模板稳定性好,-80℃保存30 d后无显著变化。

乙型肝炎病毒RNA检测试剂国家标准品的建立

目的 建立以“U/ml”为浓度单位的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)RNA检测试剂国家标准品,用于对HBV RNA检测试剂盒进行定量、准确性的质量控制和评价。方法 本研究从中国食品药品检定研究院库存的临床血样中筛选出2份高浓度HBV RNA标准品候选样品,经分装、冻干制备后确定HBV RNA检测试剂国家标准品。对标准品进行测序、赋值及协作标定后,考察其均匀性和稳定性。结果 确定HBV RNA检测试剂国家标准品为1支冻干的HBV RNA标准品候选样品,基因型为B型,浓度为2.1×10^(8)U/ml。该标准品均匀性符合要求,4℃放置14 d、室温(25℃)放置3 d、37℃放置1 d以及反复冻融3次均不影响稳定性。结论 建立了第一代HBV RNA检测试剂国家标准品,浓度为2.1×10^(8)U/ml,为相关试剂的质量控制和评价提供依据。

TaqMan~实时定量RT-PCR检测G3型轮状病毒VP7基因方法的建立

目的:建立一种检测G3型轮状病毒VP7基因的TaqMan实时定量RT-PCR方法。方法:设计轮状病毒VP7基因型特异性引物和探针,采用体外转录RNA为标准品,建立TaqMan实时定量RT-PCR方法。结果与结论:本检测方法快速、灵敏且重复性好,可以对107～101copies.μL-1轮状病毒VP7基因进行有效检测,为G3型轮状病毒的检测和定量提供了有用的工具。

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美型毒株和欧洲型毒株N蛋白基因保守序列,设计1对特异性引物和1条探针,以ABI公司PRRSV RNA为标准品,优化了PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测方法,25μL反应体系引物prrsv-f/prrsv-r(20μmol/L)各0.5μL,探针prrsv-p(10μmol/L)0.5μL为反应最佳工作浓度,标准曲线Ct值和模板启始浓度的log值之间具有良好的线性相关性。特异性、敏感性和重复性检测结果显示,该方法能特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株,与其他主要猪病病原检测无交叉反应;针对PRRSV RNA标准品检测,灵敏度可以达到10拷贝;重复性检测Ct值变异系数为0.74%～1.52%。用建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法,对40份临床样品检测,与商品化试剂盒检测结果完全一致。

犬瘟热病毒一步法荧光定量PCR检测方法的建立

为建立犬瘟热病毒(CDV)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,根据CDV核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成2对通用引物和1条通用探针,通过体外转录构建绝对定量标准品RNA。对荧光定量PCR方法的各项条件进行优化,建立CDV荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达4.02拷贝/μL,比普通RT-PCR方法的灵敏度高出100倍,具有良好的重复性。对犬细小病毒(CPV)、犬腺病毒(CAV-1)、犬冠状病毒(CCV)、犬副流感病毒(CPIV)核酸检测为阴性,具有很好的特异性。研究结果表明,建立的CDV荧光定量PCR方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,为犬瘟热的早期诊断提供了重要的技术支撑。