质粒介导的RNA干扰对AD293细胞中HBcAg表达的抑制作用

目的研究质粒介导的RNA干扰效应对HBcAg基因表达的抑制作用。方法设计并构建针对HBcAg基因的小发夹RNA表达载体,将构建好的shRNA表达载体和HBcAg-增强型绿荧光蛋白融合蛋白表达载体共转染人胚肾细胞株AD293,以空载体组以及针对无关序列的shRNA表达载体组为阴性对照,流式细胞术和实时荧光定量PCR法检测RNAi的抑制效果。结果构建的特异性shRNA表达载体可以抑制HBcAg基因在AD293细胞中的表达,流式细胞仪检测抑制率可达76%,实时荧光定量PCR法检测HBcAg基因的mRNA,抑制率可达58.6%。结论质粒介导的RNAi可以有效抑制HBcAg基因的表达,为利用RNAi进行抗乙型肝炎病毒复制研究提供了一个可供选择的方法。

聚合酶链反应检测HGV RNA方法的建立及应用

目的：了解我国不同人群中庚型肝炎病毒（ＧＢＶＣ／ＨＧＶ）感染的状况。方法：以ＮＳ５区序列分析为基础设计引物，建立聚合酶链反应方法，并对我国几个地区、不同疾病状况的２６８例患者进行庚型肝炎病毒核酸的检测。结果：有输血史的健康人群、ＨＢＶ和ＨＣＶ感染者及慢性非乙非丙型肝炎患者的ＧＢＶＣ／ＨＧＶＲＮＡ阳性率均高于自然人群，分别为１３．３％，１８．４％，１９．８％，８．９％，其中有明确血液暴露史者的检出率达２０．１％。结论：庚型肝炎在我国有广泛的流行，输血等肠道外途径为重要危险因素。

mRNA差异展示法检测氧化镍所致基因表达差异

目的：建立一种简便快速的从经染毒处理细胞中分离差异表达基因的新方法。方法：基于ＡＰＰＣＲ技术的ｍＲＮＡ差异展示分析法。结果：用黑色氧化镍染毒处理人胚肺２倍体细胞株，用基于ＡＰＰＣＲ技术的ｍＲＮＡ差异展示分析法，琼脂糖凝胶电泳直接ＥＢ染色分离ＡＰＰＣＲ产物，对未染毒和经染毒处理的人胚肺２倍体细胞株的基因表达情况进行分析，发现在染毒组与对照组细胞株间存在明显的基因表达差异。对其中１个差异片段ｐＤＬ回收纯化并作ＲＮＡ斑点杂交。结论：非同位素ｍＲＮＡ差异展示方法可快速从经染毒处理细胞株中分离差异基因。

氟西泮耐受听源性惊厥大鼠脑皮质运动区和海马区GABA_A受体亚单位mRNA含量的变化

目的 :探讨氟西泮耐受的听源性惊厥大鼠中枢GABAA 受体亚单位mRNA含量的改变及意义。方法 :使用腹腔注射氟西泮 2周 ,产生氟西泮耐受性而无依赖性的听源性惊厥大鼠模型。用竞争性定量RT PCR测定大鼠脑皮质运动区和海马区GABAA 受体α1、α3、α5、γ2L和γ2S亚单位mRNA的含量。结果 :氟西泮耐受组大鼠皮质运动区的α1亚单位下降 2 4% ,α3下降 17% ,α5上升 33% ,γ2L下降 35 % ,γ2S下降 45 % ;海马区的α1下降 33% ,γ2L下降 35 % ,γ2S下降 2 7% ,与对照组比较差异均有显著性。结论 :听源性惊厥大鼠的氟西泮耐受机制与中枢GABAA 受体α1、α3、α5。

雌、雄激素对鼠前列腺组织中胰岛素样生长因子Ⅰ及其受体mRNA表达的影响

探讨雌、雄激素对鼠前列腺组织中胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF－Ⅰ）及其受体mRNA表达的影响。方法：采用地高辛标记探针的原位杂交技术并结合图象分析系统研究了正常组、去势组、雌激素组及去势加雄激素组鼠前列腺组织中IGF-Ⅰ、IGF－Ⅰ受体基因表达情况。结果：IGF－Ⅰ、IGF－Ⅰ受体mRNA在正常鼠前列腺组织中均有表达；去势鼠腹侧前列腺IGF－ⅠmRNA表达量较正常明显降低，而IGF-Ⅰ受体mRNA表达量较正常明显增加；外源性睾酮可以阻断去势所引起的IGF-Ⅰ基因表达变化；雌激素组鼠腹侧前列腺IGF－ⅠmRNA表达量较正常组明显升高，平均表达量是正常组表达量的1．9倍。结论：雄激素可以影响大鼠前列腺中IGF-Ⅰ、IGF－Ⅰ受体mRNA水平，雌激素可以上调鼠前列腺中IGF－ⅠmRNA表达。

Cx43对针灸治疗原发性痛经大鼠效应的影响

目的:观察沉默穴位局部缝隙连接蛋白(connexin43,Cx43)的表达对针刺效应的影响,探讨针刺治疗原发性痛经的机制。方法:以催产素造成大鼠原发性痛经模型,应用RNA干扰(RNAi)技术沉默穴位局部Cx43的表达。将50只SD雌性大鼠分为正常组(N)、模型组(M)、针刺组(A)、针刺+干扰组(A+I)、针刺+干扰对照组(A+IC)。应用RT-PCR方法检测大鼠子宫的催产素受体(oxytocin receptor,OTR)、加压素受体(vasopressin receptor,VPR)的mRNA表达情况;放免法和ELISA检测血浆中前列腺素E2(PGE2)和PGF2α的含量。结果:①A组和A+IC组的大鼠扭体次数(9.43±3.87,10.28±4.23)明显低于M组和A+I组(15.43±5.13,17.00±3.87),潜伏期(12.43±3.46,11.00±3.65)min高于M组(7.57±1.99)min和A+I组(8.43±2.57)min(P<0.05)。②A+I组穴位处的Cx43 mRNA和蛋白表达低于N组(P<0.05)。③A组和A+IC组的OTR、VPR的mRNA表达较M组和A+I组降低,且差异有统计学意义(均P<0.05);M组和A+I组差异无统计学意义(P>0.05)。④A组和A+IC组的PGE2升高,PGF2α降低,较M组差异有统计学意义(P<0.05)。结论:沉默穴位局部Cx43能有效抑制针刺效应,通过降低痛经大鼠子宫内膜OTR、VPR及调节前列腺素合成系统,可能是针刺治疗原发性痛经的作用机制之一。

急性脊髓损伤后脊髓诱生型一氧化氮合酶的表达和调控

目的 :研究急性脊髓损伤 (spinalcordinjury ,SCI)后脊髓内诱生型一氧化氮合酶 (induciblenitricoxidesyn thase ,iNOS)表达的变化及核因子κB(nuclearfactor κB ,NF κB)对iNOS的调控作用。寻找继发性脊髓损伤的发病机制 ,为脊髓损伤的治疗奠定理论基础。方法 :Allen模型致大鼠脊髓损伤后 ,分别取假手术、损伤后不同时间或应用不同剂量吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 (PDTC)干预后的大鼠脊髓。应用半定量逆转录多聚酶链式反应 (RT PCR)和蛋白印记 (Westernblot)方法测定损伤局部iNOS表达量 ,应用凝胶泳动分析 (EMSA)方法测定NF κB活性。结果 :损伤后 6～ 2 4h出现iNOSmRNA表达 ,2 4h达最高 ;1～ 5d出现iNOS蛋白表达 ,3d为高峰。NF κB活性于伤后 3h增高 ,持续升高至 2 4h仍未下降。PDTC抑制了iNOSmRNA及蛋白表达且具有剂量依赖性。结论 :iNOS参与了急性脊髓损伤后继发性损害的发病过程。急性SCI中活化的NF

结直肠癌外周血和腹膜腔微转移影响因素分析

目的探讨结直肠癌患者外周血和腹膜腔微转移及其影响因素。方法收集施行手术治疗的90例结直肠癌患者和25例结直肠良性疾病患者外周血及腹腔灌洗液,RT-PCR方法检测CK-20mRNA和CEAmRNA表达;手术切除标本常规病理学分析。结果(1)结直肠癌患者外周血CK-20mRNA和CEAmRNA表达率分别为45.6%(41/90)和54.4%(49/90),两者联合检测表达的阳性率为64.4%(58/90);腹膜腔CK-20mRNA和CEAmRNA表达阳性率分别为51.1%(46/90)和58.9%(53/90),两者联合检测表达的阳性率为68.9%(62/90);上述指标均随肿瘤的浸润深度、PS因素的递进,以及淋巴结及肝脏转移而增高(P<0.05);在结直肠良性疾病患者外周血及腹腔灌洗液标本中均未检出CK-20mRNA和CEAmRNA的表达。(2)腹腔灌洗液中CK-20mRNA和(或)CEAmRNA表达的阳性率与同一指标在外周血中的表达相比无差异;外周血及腹腔灌洗液中CEAmRNA的表达与CK-20mRNA表达相比也无差异。结论采用RT-PCR方法检测结直肠癌患者外周血和腹膜腔CK-20mRNA和CEAmRNA的表达,有助于筛选亚临床转移和预测病理分期;两者的联合检测更有意义。

人衰老相关DNA片段的筛选及特征分析

目的 :探索衰老相关新基因。方法 :采用RAPD法筛选衰老相关的DNA片段 ,采用Southernblot分析基因状态 ,Northernblot分析mRNA水平。结果 :筛选出衰老特异的DNA片段 ,长 894bp ,命名为sad。将sad片段克隆、测序 ,查询GenBank ,确认为一种新的衰老相关序列 ,基因登录号为AQ32 410 4。Southernblot分析表明 ,sad基因可能是一种单拷贝基因 ;sad在衰老 2BS细胞中的Southernblot图谱不同于年轻细胞 ,而与人胃癌细胞系BGC 82 3类似。Northernblot分析显示 ,sad基因具有表达活性 ,其RNA长约 0 .5kb ,相对水平在各代龄的细胞间差异无显著性。结论 :sad是一种新的与衰老相关的DNA片段 ,sad基因可能为单拷贝基因 ,具有表达活性。

针刺“风府”穴对大鼠脑内神经肽胆囊收缩素基因表达的影响

手法针刺大鼠“风府”（天门）穴，用ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ方法对针刺不同时限的生理状态大鼠脑内神经肽胆囊收缩素（ＣｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎＣＣＫ）的基因在转录水平的表达情况进行比较研究。结果表明针刺即刻ＣＣＫ信息核糖核酸（ｍＲＮＡ）表达开始增加，３小时其浓度急剧升高．６小时已回落，２４小时几近平复。提示针刺后３～６小时是ＣＣＫ基因表达的高峰时期，手法针刺诱发的脑内ＣＣＫｍＲＮＡ的表达没有观察到累积迭加和持续促进的结果，并且与捉抓引起的应激反应有本质区别。

针刺抗脊髓损伤临床与机理研究概况

针刺抗脊髓损伤临床与机理研究概况周羚，黄诚（上海市针灸经络研究所，２０００３０）主题词脊髓损伤／针灸疗法，截瘫／针灸疗法脊髓损伤是外力的作用致使脊髓或马尾发生不同程度的损伤，造成受损平面以下截瘫及括约肌功能障碍等严重后果。脊髓损伤一直为神经外科研究的...