嵌合性RNA/DNA寡核苷酸位点特异性修复基因损伤——一种新的单基因病治疗途径

近年来 ,无论是在 RNA或是 DNA水平 ,基因治疗的有关技术方法的研究发展迅速 ,但仍有许多缺陷。最近 ,一种新的用于准确修复基因组 DNA中单个碱基突变或缺失的方法正日趋完善 ,该方法利用同源重组原理 ,使用一段含有 DNA和RNA残基的嵌合寡核苷酸直接修复基因损伤 ,能够在 DNA水平直接转换基因组中的碱基 ,以达到永久性修复遗传性损伤的目的且克服了一些目前存在的缺陷。

乙型肝炎功能性治愈新药:聚焦反义寡核苷酸和小干扰RNA

在乙型肝炎治疗领域,现有的核苷(酸)类似物以及聚乙二醇干扰素在功能性治愈方面的疗效较为有限。最近,反义寡核苷酸与小干扰RNA等小核酸药物以全新的作用机制和令人瞩目的早期临床研究疗效,为乙型肝炎的功能性治愈带来了前所未有的突破性进展。反义寡核苷酸和小干扰RNA等小核酸药物可降低HBsAg水平甚至HBsAg转阴。随着HBsAg的减少,可能部分恢复机体的乙型肝炎特异性免疫功能,并可能将单纯的HBsAg清除进一步转化为减少乙型肝炎相关肝脏事件等具有临床价值的硬终点。紧密结合新药背景下HBsAg的动态变化轨迹,进一步优化联合治疗的策略与方案,有望将乙型肝炎功能性治愈转化为提升患者生存率及显著改善其生活质量的最终目标。

乙型肝炎患者血清lncRNA XIST表达与HBV-DNA载量、肝纤维化的关系

目的 探讨乙型肝炎患者血清长链非编码RNA X染色体失活特异转录本(lncRNA XIST)表达与乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)载量、肝纤维化的关系。方法 选取2020年6月—2022年6月黄冈市中心医院收治的87例乙型肝炎患者作为乙肝组,另取同期该院健康体检者71例作为对照组。所有纳入对象均检测血清lncRNA XIST表达与HBV-DNA载量及肝纤维化指标[透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)]。采用Pearson相关分析探讨血清lncRNA XIST与HBV DNA载量、肝纤维化指标的关系,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清lncRNA XIST对乙型肝炎的诊断价值。结果 乙肝组血清TBil、ALT、AST、lncRNA XIST、HA、LN、Ⅳ-C、PC-Ⅲ水平均高于对照组(P <0.05)。高载量组乙型肝炎患者血清lncRNA XIST及HA、LN、Ⅳ-C、PC-Ⅲ水平均高于中、低载量组(P <0.05);中载量组乙型肝炎患者血清lncRNA XIST及HA、LN、Ⅳ-C、PC-Ⅲ水平均高于低载量组(P <0.05)。Pearson相关分析结果显示,乙型肝炎患者血清lncRNA XIST相对表达量与HBV-DNA载量、HA、LN、Ⅳ-C、PC-Ⅲ均呈正相关(r=0.445、0.420、0.369、0.330和0.419,均P=0.000)。ROC曲线结果显示,血清lncRNA XIST诊断乙型肝炎的敏感性为80.65%(95%CI:0.801,0.811),特异性为88.74%(95%CI:0.866,0.908)。结论 乙型肝炎患者血清lncRNA XIST表达升高,且随着HBV-DNA载量增加而逐渐上升,同时与肝纤维化密切相关,有望作为临床诊断乙型肝炎的有效指标。

用RNA/DNA嵌合寡核苷酸进行单碱基突变修正

以含有单个错配碱基的ＲＮＡ／ＤＮＡ嵌合寡核苷酸为载体，通过含ＲＮＡ残基链与靶ＤＮＡ序列的同源配对反应，启动靶细胞内源的错配修复机制，可在特定位点引入或修正单个核苷酸突变，并使修复后的基因表达仍处于原基因调控元件之下。该方法克服了同源重组打靶在哺乳动物细胞的低效问题，为单核苷酸突变所致遗传病或肿瘤的基因治疗提供了新的途径。

寡核苷酸DNA Microarray用于HLA DRB1基因分型的研究

对寡核苷酸DNAMicroarray用于HLADRB1基因分型的技术进行研究。常规的酚 /氯仿法提取标准血样基因组DNA ,在DRB1的exon 2区域设计一对引物 ,经PCR扩增基因组相应区段并用Cy5 dCTP进行标记。设计寡核苷酸分型探针 ,将探针固定在APS PDC法制作的DNAMicroarray上 ,用标记的PCR产物与之杂交 ,扫描仪对杂交结果进行扫描 ,Imagene软件对杂交图象进行分析。共检测了 33例标准血样的HLADRB1基因型。检测结果证明研制的DNAMicroarray准确、灵敏。DNAMicroarray技术可以有效地检测DRB1等位基因 ,对比常规的PCR SSP和PCR SSO方法、分型基因芯片方法更为直观 。

随机单链DNA文库SELEX筛选寡核苷酸适配子方法的建立

指数富集配基的系统进化 (SELEX)技术是一种新的组合化学技术 .体外构建了一个长度为 81nt、含有35个随机序列的单链DNA (ssDNA)文库 ,优化了ssDNA文库扩增为双链DNA (dsDNA)文库的PCR反应条件 .通过对比不对称PCR和生物素 -链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA文库的效果 ,确定了以生物素 -链亲和素磁珠分离方法制备ssDNA .由于脱氧核糖核酸的疏水性导致ssDNA文库与硝酸纤维素滤膜的结合背景过高 ,因此选择以微孔板为介质 ,分离与靶蛋白结合的适配子 .经过 9轮循环筛选 ,随机ssDNA文库与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白 (C蛋白 )的结合率从 0 . 5 %上升到 32 . 5 % .

DNA-PKcs反义寡核苷酸对不同p53功能状态的鼻咽癌细胞株辐射抗性的影响

背景与目的:DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)是一种双链断裂修复蛋白,可以修复细胞的DNA双链断裂损伤。本研究通过转染DNA-PKcs反义寡核苷酸入鼻咽癌细胞株,探讨DNA-PKcs反义寡核苷酸对不同p53功能状态的鼻咽癌细胞株的放射敏感性的影响。方法:利用LipofectamineTM2000转染DNA-PKcs反义寡核苷酸入鼻咽癌细胞株CNE-1和CNE-1-wtp53;设0、0.5、1、2、4、6、8Gy7个放射剂量点,用集落形成法分析转染反义寡核苷酸前后细胞的存活情况,并分别用线性二次模型和单击多靶模型拟合出细胞的剂量存活曲线,求出放射生物学参数α、β、α/β、SF2、D0、Dq和N值,评价细胞放射敏感性的变化。结果:转染DNA-PKcs反义寡核苷酸前,CNE-1和CNE-1-wtp53的α值分别为0.03、0.05,SF2值分别为0.73、0.50,D0值分别为2.08Gy、1.13Gy,Dq值分别为2.04Gy、1.36Gy。转染DNA-PKcs反义寡核苷酸后,CNE-1和CNE-1-wtp53的α值分别为0.04、0.26,SF2值分别为0.45、0.21,D0值分别为1.07Gy、0.83Gy,Dq值分别为1.24Gy、0.73Gy。转染DNA-PKcs反义寡核苷酸后,鼻咽癌细胞的α值增大,SF2、D0、Dq值均减小。结论:DNA-PKcs反义寡核苷酸可逆转CNE-1的辐射抗性,该逆转作用不依赖细胞的p53功能状态。

用生物素标记寡核苷酸DNA探针快速检测鱼传染性胰脏坏死病病毒IPNV

研究了用生物素标记的寡核苷酸ＤＮＡ探针快速检测鱼传染性胰脏坏死病病毒ＩＰＮＶ，取得了较好的结果。对探针的灵敏度、特异性进行了测定，并与其它快速检测技术作了比较。

Survivin mRNA反义寡核苷酸诱导胰腺癌细胞凋亡

目的:用反义寡核苷酸(ASODN)封闭胰腺癌细胞中Survivin 基因的表达,研究其诱导细胞凋亡的作用及其机制. 方法:用脂质体介导SurvivinASODN转染人胰腺癌细胞株SW1990细胞,用Annexin Ⅴ-FITC/PI复染、流式细胞术检测及电镜术观察凋亡,激酶活性检测法测定细胞内caspase-3活性变化,免疫沉淀法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)活性的变化早期细胞变化情况. 结果:脂质体介导SurvivinASODN转染胰腺癌细胞后细胞内p38MAPK及caspase-3活性较对照组明显升高(55.3% vs 2.9%,3.2%,4.5%,4.8%respectively,P<0.05).细胞出现典型的凋亡形态学特征,细胞凋亡率较对照组明显增加(8.81±1.33 vs 47.87±2.91,and 14.73±1.36 vs 23.47±3.61.P<0.05). 结论:脂质体介导转染Survivin ASODN可以诱导细胞激活,诱导活化进而诱导细胞发生凋亡.

小分子干扰RNA和反义寡核苷酸技术的比较及其应用意义

目的:分析比较小分子干扰RNA和反义寡核苷酸技术的作用机制、作用靶点、设计方法和临床应用的异同。资料来源:应用计算机检索PubMed数据库1990-01/2007-02相关小分子干扰RNA和反义寡核苷酸方面的文献,检索词"siRNA;accessible site;antisense oligonucleotides;RNA Interference;mechanism;chemically modified siRNA;chemically modified oligonucleotides",限定文献语言种类为English。资料选择:对资料进行初审,选取有关小分子干扰RNA和反义寡核苷酸的文献,开始查找全文。纳入标准:关于RNA干扰和反义寡核苷酸作用机制的研究;探讨如何在mRNA上寻找小分子干扰RNA和反义寡核苷酸作用靶点的论文;解释反义寡核苷酸化学修饰和小分子干扰RNA分类的文章;应用小分子干扰RNA治疗肿瘤的探索性研究。排除标准:非原创性的文章。资料提炼:共检索到200多篇关于小分子干扰RNA和反义寡核苷酸的文献,最终纳入40篇符合标准的文献。资料综合:尽管小分子干扰RNA和反义寡核苷酸作用机制不尽相同,但两者在很多方面如选择mRNA的作用靶点、化学修饰和应用等方面,是相通的。研究反义寡核苷酸的经验可以使小分子干扰RNA的研究事半功倍。本文对小分子干扰RNA和反义寡核苷酸技术进行了比较,这将有助于小分子干扰RNA的研究与应用。结论:研究反义寡核苷酸技术的经验对小分子干扰RNA的研究有指导意义,小分子干扰RNA是非常有希望被用于肿瘤治疗的新型药物。

能与HBV-DNAC启动子结合成三链结构的寡核苷酸的设计与筛选

目的 :筛选出能与HBV DNAC启动子形成三链结构的高亲和力寡核苷酸。方法 :以体外合成的3 2 P标记的HBV DNAC启动子区序列 ( 173 4～ 175 4)为靶序列 ,合成 5种有可能与该靶序列形成三链结构的寡核苷酸链 (TFO) ,同时设计对照靶序列和对照TFO ,用凝胶滞留试验、酶足迹试验等方法对比分析这些TFO与靶序列是否形成三链结构及其结合的亲和性、特异性。结果 :在 3 7°C、pH7 4条件下 ,CT TFO和GT TFOp与3 2 P 靶序列DNA结合的亲和力十分微弱 ,其Kd均 >10 -6mol/L ;GT TFOap和AG TFOs与靶序列DNA结合的亲和力较高 ,Kd分别为 5× 10 -7mol/L和 2 5× 10 -8mol/L ;AG TFO1与靶序列结合的亲和力最高 ,Kd为 3× 10 -9mol/L ,而且两者的结合具有序列特异性。结论 :含AG或GT的TFO可与HBVC启动子区类同聚嘌呤链逆平行方向结合成三链DNA ,其中AG TFO1与靶序列结合的亲和力最高 ,反应完全 ,可使靶双链DNA均转变成三链DNA ,经一定修饰后 ,可试用于HBV基因转录抑制实验。

HBV-DNA寡核苷酸芯片制备的优化研究

寡核苷酸芯片的制备涉及到寡核苷酸探针的设计、合成及基片的处理和寡核苷酸在基片上的固定[1,2].2001～2004年,我们从玻璃基片的表面化学处理、不同pH值的点样液、不同浓度的寡核苷酸探针及其荧光标记样品的浓度对杂交信号的影响等方面优化HBV-DNA寡核苷酸芯片的制备.

基于寡核苷酸芯片的β-地中海贫血DNA甲基化的研究

目的通过寡核苷酸芯片寻找和分析β-地中海贫血DNA甲基化相关的基因位点,进一步探讨产前筛查及诊断β-地中海贫血的新方法。方法利用含有人30178个DNA甲基化探针的寡核苷酸芯片,对2例β地中海贫血患儿脐血与2例正常脐血分别配对检测差异基因DNA甲基化情况,并用甲基化特异PCR(methylation-specific PCR,MSP)和荧光定量PCR(RT-PCR)验证芯片结果。采用非监督聚类(hierarchical clustering)等方法发现统计学意义上差异表达的基因。结果两组芯片结果显示,差异基因共209条(ratio≥2.0,ratio≤0.5);其中上调基因共113条,下调基因共96条。验证结果显示,DNA甲基化相关基因成红细胞增多型白血病致病因子(erythroblastic leukemia viral,v-erb-a)与正常血样比较呈高甲基化状态。结论利用DNA甲基化芯片及甲基化特异PCR技术检测并验证出成红细胞增多型白血病致病因子(v-erb-a)在地中海贫血中呈高甲基化。

靶向ST6GalI的siRNA与反义寡核苷酸联合应用对结肠癌细胞转移能力的影响

目的探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响。方法设计并合成靶向ST6GalI的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA不同靶点)、ASO2组(与siRNA相同靶点)、siRNA+ASO1组及siRNA+ASO2组,应用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA水平,流式细胞术检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质的粘附与侵袭力。结果siRNA组、ASO1组、ASO2组、siRNA+ASO1组、siRNA+ASO2组中,SW480细胞的ST6GalImRNA表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均明显低于空白对照组、脂质体对照组(P<0.05),以siRNA+ASO1组最明显,且siRNA+ASO1组与siRNA组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而siRNA+ASO2组与siRNA组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应。

端粒酶RNA反义寡核苷酸对白血病细胞K562增殖的影响

目的:探讨人类端粒酶RNA的反义寡核苷酸对K562细胞增殖的影响。方法:采用MTT试验和平板集落形成实验观察反义寡核苷酸作用后K562细胞的生长情况,采用流式细胞仪分析细胞周期的改变,采用电镜观察细胞超微结构的改变,用PCR-ELISA分析细胞端粒酶活性的改变。结果:端粒酶RNA的反义寡核苷酸作用K562细胞后,细胞超微结构和细胞周期发生明显改变,端粒酶活性受到明显抑制,细胞增殖受到明显抑制。结论:靶向于端粒酶RNA的反义寡核苷酸能抑制白血病细胞K562的增殖。

反义RNA和反义硫代寡核苷酸抗HBV转基因小鼠病毒疗效的比较

目的 比较人工合成的反义硫代寡核苷酸 (asODN )和反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac)在乙型肝炎(HBV)病毒转基因小鼠体内的抗病毒作用。 方法 设计合成针对HBV -pre -c/c基因的反义硫代寡核苷酸 5‘ -CAT GCCCCAAAGCCAC -3’。构建HBV -c区反义RNA真核表达质粒 (PCEP4-ac) ,并以半乳糖 -多聚赖氨酸 (Gal15 -PLL)作肝靶向载体。将 2 0只HBV转基因小鼠分为反义寡核苷酸、反义RNA真核质粒表达、生理盐水组。靶向反义硫代寡核苷酸以每只体重 15 0ug剂量 ,反义RNA真核质粒每只 10 0ug剂量 ,尾静脉注射给药 ,对照组用同样体积生理盐水同样方法给药。 结果 注射asODN和PCEP4-aC后 7d血清HBsAg已有所下降 (P <0 .0 5 ) ;14d时显著下降 (P <0 .0 1) ,且血清HBV -DNA转阴率分别为 66.7% ( 4 /6)和 62 .5 % ( 5 /8) ,而生理盐水组无明显变化。 结论 反义硫代寡核苷酸和反义RNA真核表达质粒均能在乙肝转基因小鼠体内抑制HBV复制和表达 ,且两者在抑制作用上无明显差异性。

大肠杆菌DNA和RNA中核苷的高效液相色谱分析

建立了用反相高效液相色谱法 (RP HPLC)测定大肠杆菌 (E .coli)脱氧核糖核酸 (DNA)和核糖核酸 (RNA)水解产物中核苷的方法 .色谱柱为SupelcoInc.C18反相柱 ,2 5 4nm和 2 80nm紫外吸收波长同时检测 ,分析条件经选择在流速为 1mL/min ,流动相A(2 .5 %甲醇 +0 .0 1mol/LKH2 PO4,pH 4 .6 ) 2 8min ,流动相B(8.0 %甲醇 +0 .0 1mol/LKH2 PO4,pH 4 .6 ) 37min ,柱温为 2 0℃条件下 6 5min可实现核苷的完全分离 .回收率为 80 .19%～ 99.31% ,相对标准偏差RSD为 0 .86 %～ 2 .6 2 % .该方法具有高灵敏度、高选择性的特点 。

鸡的寡核苷酸探针DNA指纹研究

用人工合成的寡聚核苷酸 (GT) 10 为探针产生 8个家系鸡的HaeⅢ酶切微卫星DNA指纹图谱。遗传距离分析结果表明 :计算所得到的遗传距离与鸡的实际遗传背景一致 ,说明在缺少DNA指纹分析的小卫星探针或基因组探针的情况下 ,用合成容易。

HBV耐药相关DNA突变体的构建及在寡核苷酸基因芯片分析中的应用

拉米呋啶(Lamivudine)是近年来开发成功的一种治疗HBV慢性感染病人的核苷类药物。随着拉米呋啶在临床上广泛使用,HBV耐药现象已成为临床实践中的棘手问题。建立HBV耐药测定技术成为HBV基础研究和临床实践中企待解决的一个重要问题。寡核苷酸芯片(Oligochip)是近年来发展并逐步成熟的一种高通量基因检测技术,已成功应用于基因突变快速和高通量检测。本研究在构建HBV拉米呋啶抗性相关HBV多聚酶基因突变体基础上,设计并制备了HBV耐药寡核苷酸芯片(HBV-LamOligochip)。根据HBV拉米呋啶抗药性相关突变主要位于HBV多聚酶基因的L526、A546、M550和V553等氨基酸位点,设计了28条寡核苷酸探针。探针对应序列为HBVDNA聚合酶基因反义链,HBVHBVhb长度为15-18nt。探针合成时在其3'端接氨基和间隔臂(spacer)等特定修饰;探针纯化与定量后,用基因芯片点样仪点到醛基修饰载玻片上,制成HBV耐药寡核苷酸芯片(HBV-LamOligochip)。为了分析基因芯片的性能,克隆了833号HBV病人血清中HBVDNA聚合酶基因,测序证实为HBVDNA野生型(即未发生突变)。以该DNA为模板,用PCR法构建了HBV耐药相关突变体。用HBV-LamOligochip对HBV野生型DNA和人工构建DNA突变体进行了检测。结果发现,HBV-LamOligochip能有效检测出野生型DNA序列。