RNA介导的病毒抗性在转基因烟草中的遗传分析

以含非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白 (PVY MCP)基因的抗病和感病T0 代转基因烟草为材料 ,对转基因及RNA介导的病毒抗性在T1～T4代转基因植株中的遗传进行了研究。结果表明 ,在含低拷贝 (1～ 2个 )转基因的感病植株后代中 ,转基因是作为一个单显性遗传位点 ,遵循孟德尔遗传分离规律 ,各世代转基因植株仍表现感病。含多拷贝 (4～ 6个 )转基因的抗病植株 ,转基因在T1代的分离虽符合多位点插入的 15∶1和 6 3∶1遗传规律 ,但转基因发生了重排 ,RNA介导的病毒抗性表现为不稳定遗传。从含多拷贝转基因的抗病植株的T1代株系中 ,分离获得了两株含 2个拷贝转基因的抗病植株 ;其后代中 ,转基因及抗性遗传遵循孟德尔遗传分离规律 ,可稳定遗传和表达 ,获得纯合的抗病转基因株系。对转基因在不同抗病类型植株中整合方式分析显示 。

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

以马铃薯 Y病毒坏死株系 (PVYN)的 RNA为模板 ,应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)方法 ,扩增出长度为 80 1bp的非翻译的马铃薯 Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到 p BSK的Bam HI和 Kpn I之间并进行了序列测定。用 Bam HI和 Kpn I从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒 p ROKII内得到植物表达载体 p PVYCP。通过根癌农杆菌 (LBA4 40 4 )介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和 Southern blot检测 ,获得 82株转基因植株。 Northern blot和Western blot分析表明 ,转基因植株只在 RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异 ,其中有 7株是对 PVYN高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明 ,对 PVYN 表现高度抗病的植株对 PVYO 也具有高度抗病性。

利用RNA介导的抗病性获得抗2种病毒的转基因烟草

RNA介导的病毒抗性(RMVR)是近年发展起来的一种新的植物抗病毒基因工程策略,具有抗病性强、抗性持久、生物安全性高等特点。利用该策略培育多抗病毒植株具有广阔的应用前景和重要的实践意义。本研究将非翻译的马铃薯X病毒的衣壳蛋白(PVX-CP)基因和非翻译的马铃薯Y病毒的衣壳蛋白(PVY-CP)基因组成嵌合基因,构建植物表达载体pROKXY,利用农杆菌介导法转化烟草NC89,获得6株对PVX和PVY的混合侵染表现为免疫的转基因植株。分子分析表明,这种抗性为RNA介导的病毒抗性。这一研究结果为利用RMVR进行植物多抗病毒育种提供了重要数据和资料。

转基因植物中RNA介导的病毒抗性研究进展

利用病毒核酸序列培育抗病毒的转基因植物是一个重要的抗病毒基因工程策略。虽然很多种病毒的不同核酸序列已被使用并证明转基因植物有不同程度的抗病毒效果，但其抗病机制大多不清楚。目前至少有两种明显不同的抗病机制类型：一种是要求病毒编码的蛋白质的表达；另一种是仅仅依靠转基因的RNA转录。本文综述了这种RNA介导的抗性特点、分子生物学、抗病机制，以及与共抑制的相似性，并对RNA介导的病毒抗性的意义加以讨论。

转基因植物中RNA介导病毒抗性

１９８６年以来，利用病毒外壳蛋白及其它基因转化植物，获得具抗病毒能力的植株，已有大量成功的报道。以前，一直认为是病原体来源的基因引发抗性，但在实验过程中，发现转基因植物中转化基因的表达水平与病毒抗性程度之间没有直接联系，因此有人提出转基因植物抗性获得与病毒ＲＮＡ特异性降解有关的机制。

植物RNA介导的病毒抗性研究进展

对目前RNA介导的病毒抗性的特点、机制以及与转基因沉默的异同作一概括,并对RNA介导的病毒抗性在植物功能基因组学研究中的应用作了简单介绍。

转基因植物中RNA介导病毒抗性

1986年以来,利用病毒外壳蛋白及其他基因转化植物,获得具抗病毒能力的植株,已获有大量成功的报道。以前,一直认为是病原体来源的基因引发抗性,但在实验过程中,发现转基因植物中转化基因的表达水平与病毒抗性程度之间没有直接联系,因此有人提出转基因植物抗性获得与病毒 RNA 特异性降解有关的机制。本文对 RNA 介导抗性机制进行讨论。

基因沉默番木瓜环斑病毒复制酶基因(PRSV-Nib)获得抗病毒病番木瓜的研究

番木瓜是重要的热带经济水果。番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)是番木瓜的重要病毒病,经常导致严重的产量损失和质量恶化。自从1998年第一例转基因番木瓜问世以来,使得基于“致病菌衍生的抗病性(pathogen-derived resistance,PDR)”的抗病育种策略获得成功广泛应用。然而依赖于序列同源性的抗病性与病毒突变导致多样性增加之间的矛盾成为番木瓜育种科学家的新挑战。本研究拟采用RNAi策略针对复制酶(nuclear inclusion b.Nib)获得广谱抗PRSV番木瓜新种质。通过团队已建立的胚性愈伤诱导-农杆菌介导转化-再生苗诱导的番木瓜遗传转化体系,共获得经过抗性筛选的再生苗52株,通过特异性PCR进行筛选共计获得24株转基因阳性植株。通过对T0代田间自然发病试验中,转基因番木瓜株系抗病性明显高于非转基因对照,其中NibB5-2田间抗病性最优。通过hiTAIL-PCR方法确定NibB5-2插入位点位于第2号染色体supercontig_30的1976766的位置。T1代接种试验中,无病毒积累且无发病症状,初步确认具有良好的病毒抗性,为番木瓜抗病育种提供新思路。

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

目的探明马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVYN)CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。方法以PVYN的CP基因cDNA3′端202bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。结果攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病,而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型,Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组,Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。结论抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。

翻译和非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较

利用RT PCR方法克隆获得马铃薯Y病毒烟草叶脉坏死株系 (PVYN)的可翻译和不可翻译外壳蛋白 (CP)基因 ,并分别插入 pROKⅡ质粒中获得重组双元表达载体。通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) 介导的基因转化方法 ,将可翻译和不可翻译的PVYN CP基因分别导入烟草栽培品种NC89叶片组织中 ,得到抗卡那霉素的再生植株。对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行PCR检测表明 ,被导入可翻译和不可翻译CP基因的植株分别占卡那霉素抗性植株的 95 %和 98%。攻毒实验表明 ,两种类型的转基因烟草对PVYN 的抗病性具有相似性 ,其表现型为 :免疫、抗病和感病。免疫型转基因植株的抗病性不受接种物类型及其剂量的影响。Southern印迹杂交结果显示 ,目的基因已经整合到烟草基因组中。Northern印迹杂交证明 ,两种类型的CP基因都已在RNA水平上得到了表达 ,但细胞内RNA的积累量与转基因植株的抗病强度成负相关。Western印迹杂交表明 ,在表达不可翻译PVYN CP基因的转基因植株内未检测到CP蛋白 ,而在导入可翻译的PVYN CP基因的植株内检测到了CP蛋白 ,且CP蛋白含量与抗病性不存在正相关。本研究结果证明 ,表达可翻译与不可翻译PVYN CP基因的转基因烟草对PVYN 的抗病性均为RNA介导的抗病性。

正向和反向重复RNA介导的抗马铃薯Y病毒基因工程比较研究

RNA介导的病毒抗性与RNA沉默现象密切相关。反向重复cDNA序列(IR)的转录产物往往形成双链RNA结构,而双链RNA是诱发RNA沉默的有效因子。据此,本研究通过体外合成马铃薯Y病毒坏死株系衣壳蛋白基因(PVYN-CP)5'端反向重复cDNA序列和正向重复cDNA序列(DR),分别构建植物表达载体pROK-IR和pROK-DR,利用农杆菌介导方法转化烟草NC89,比较这2种转基因烟草在RNA介导抗病性方面的差异。抗病性检测表明,转化IR和DR的转基因烟草均可获得抗病程度达到免疫的植株,但转化IR序列可大大提高抗病植株在转基因植株中的比例。分析结果表明所获得的抗病性为RNA介导的抗病性,是RNA沉默的结果。这一研究结果为利用IR策略进行抗病毒遗传育种提供了理论依据,并为讲一步开展RNA介导抗病性的机制研究奠宗了基础。

马铃薯X病毒25kD运动蛋白基因和外壳蛋白基因介导的抗病性研究

以马铃薯X病毒(potatovirusX,PVX)的RNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT PCR)方法分别扩增出长度为681bp的非翻译马铃薯X病毒25kD运动蛋白基因(PVX p25)和长度为714bp的非翻译马铃薯X病毒外壳蛋白基因(PVX CP)。并分别构建植物表达载体pROKⅡp25和pROKⅡCP。利用农杆菌介导方法转化烟草NC89。经卡那霉素筛选、PCR检测,共获得转非翻译PVX p25的转基因植株78株,转非翻译PVX CP的转基因植株83株。抗病性试验表明,转非翻译PVX p25的78株中有31株对PVX的侵染表现高度抗病,抗性比例为39.7%;转非翻译PVX CP的83株中有11株对PVX的侵染表现高度抗病,抗性比例为13.3%。分子生物学检测和抗病性分析表明,抗病性均为RNA介导的病毒抗性。研究结果初步证明,转非翻译PVX p25可以更有效地获得抗PVX转基因植株。

大豆对大豆花叶病毒SC-11株系抗性的遗传及基因定位

大豆花叶病毒病(soybean mosaic virus,SMV)是世界性大豆病害,严重危害大豆的产量和质量。SC-11为我国黄淮夏大豆区以及北方春大豆区SMV主要流行株系。研究大豆品种对SC-11的抗性遗传方式,不同大豆材料对SC-11抗性位点的等位性关系,并对抗性基因进行了SSR标记定位。结果表明:齐黄1号对SC-11的抗性由一对显性基因(RSC-11)控制;齐黄1号、齐黄22、广吉和早熟18对SC-11的抗病基因是等位的或紧密连锁的;经分离群体组群分析法研究发现,齐黄1号抗SC-11的位点RSC-11位于F连锁群,与SSR标记Satt114、Satt334、Sat_234和Sct_033紧密连锁,距离分别为11.1 cM、8.9 cM、4.6 cM和4.7 cM;选取F连锁群上亲本间有多态的18对引物构建了F连锁群的遗传图谱,全长254.8 cM,标记间平均距离为13.41 cM。研究结果为大豆抗病育种以及抗性基因的精细定位和图位克隆奠定了基础。

大豆花叶病毒(SMV)株系SC4和SC8的抗性遗传分析

选用我国黄淮和长江流域大豆产区发生频繁的SMV株系SC4和SC8,利用大豆抗病材料和感病材料配制抗感和抗抗杂交组合,研究抗病材料对SC4和SC8株系的遗传方式以及不同大豆材料对SMV抗性基因位点间的等位性关系。结果表明,接种SC4株系后,由冀LD42、徐豆1号、跃进4号、科丰1号、PI96983、晋大74、汾豆56、大白麻和齐黄22为抗源配制的9个抗感组合的F1均表现抗病,经卡方测验,F2抗感分离比例3:1,F2:3家系分离比例为1(抗):2(分离):1(感),表明这些抗源均有1对基因控制对SC4株系的抗性,且抗病表现为显性;5个抗抗组合的F1均表现抗病,F2群体分离比例15(抗):1(感),表明大白麻与汾豆56、科丰1号和齐黄1号携带抗SC4的基因是不等位的,冀LD42与汾豆56,晋大74与中作229是不等位的。接种SC8株系后,用齐黄1号、中作229、NY58、科丰1号、PI96983、晋大74、汾豆56、大白麻和齐黄22为抗源配制的抗感组合杂交后代分离符合1对基因的分离比例且F1均表现抗病,说明这些品种对SC8株系的抗性也均由1对显性基因控制。抗抗组合晋大74×汾豆56接种SC8株系后的F2群体全部表现抗病,F2:3家系没有抗感分离,表明抗病品种晋大74与汾豆56携带的抗病基因是等位的;齐黄1号×科丰1号、大白麻×汾豆56的F2群体分离比例15(抗):1(感),表明抗病亲本齐黄1号与科丰1号、大白麻与汾豆56携带抗SC8的基因是不等位的,而且独立遗传。

玉米抗甘蔗花叶病毒资源的遗传多样性研究(英文)

利用人工接毒方法对 4 6份我国主要玉米自交系进行了两年抗甘蔗花叶病毒鉴定 ,筛选出高抗系 8份 (K2 2、CN96 2、P138、齐 318、中自 0 1、金黄 96 B、齐 319、Pa4 0 5 ) ,抗病系 7份 (旱 2 1、中自 0 3、旱 2 3、农大 178、获白、K12、黄早四 )。用 SSR标记研究了 4 6份自交系的遗传多样性。 4 9对引物共检测出 16 8个等位基因变异 ,每对引物检测等位基因2～ 10个 ,平均为 3.4 3个。 U PGMA聚类分析表明 ,供试自交系可分为 7群 ,划群结果与系谱和育种家经验基本相符。 15份抗病毒自交系分散于 4群 (A、B、E、G) ,依据杂种优势原理 ,可用于改良同一群内感病系的抗性 ;其中群 E和亚群 GII被鉴定为抗病毒种质 ,可用于组建抗病群体。本文的研究结果为抗甘蔗花叶病毒玉米种质改良提供了重要信息。

番木瓜抗环斑病毒突变体抗性遗传及RAPD标记

:60 Coγ-射线处理番木瓜种子 ,从诱变一代中筛选到 1株耐环斑病毒 ( PRSV)的变异植株 ( M1) ,其侧芽组培后代 ( VM1)部分植株也表现出了耐病性 ,以 VM1为母本进行回交 ,人工接种病毒鉴定回交后代 ( BM2 )的抗病性 ,结果为 :在出自部分回交果实的 BM2 群体中 ,包含有对 PRSV Ys和 Vb株系具抗性的植株 ,抗感分离比为 1∶ 1,但未发现抗 Sm株系的植株 ;BM2 抗病两性株自交或以其为母本进行回交 ,分别获得诱变第三代 ( M3)及回交诱变第三代 ( BM3) ,人工接种 PRSV Ys株系 ,结果表明 ,BM3抗感分离比也为 1∶ 1,因而认为辐射处理突变产生了具 PRSV株系专化性的显性抗病基因 ,命名为 Rys;但 M3抗感分离比不符合显性单基因 3∶ 1理论值 ,认为是单倍体选择的结果。运用 BSA法 ,在 BM2 中寻找到一个与抗病性密切相关的 RAPD标记 ,经在 BM2 、M3及 BM3抗感群体中检验 ,可作为抗病育种的辅助选择标记。Rys是番木瓜栽培种中发现的第一个抗

大白菜芜菁花叶病毒病抗性遗传分析

为了明确不同感病亲本对大白菜芜菁花叶病毒病抗性遗传规律的影响,以大白菜抗TuMV的国家级抗源材料8407和高抗TuMV的高代自交系材料73为亲本之一,分别与2个感病材料冠291和06-247构建F1杂交组合,并制备F2群体。采用摩擦接种法对上述亲本及其F1、F2群体接种TuMV-C4,采用生物学观察的方法,根据病情分级和归类标准对大白菜TuMV抗性进行鉴定。结果表明,以8407为抗病亲本,当感病亲本为冠291时,表现为由1对显性基因控制;当感病亲本为06-247时,表现为由1对隐性基因控制。以73为抗病亲本,当感病亲本为06-247时,TuMV抗性由1对隐性基因控制;同一个抗病亲本,当感病亲本为冠291时,又表现为由两对隐性基因控制。因此,大白菜TuMV的抗性遗传规律十分复杂,同一个抗病材料,当感病亲本不同时,所配制的组合间TuMV抗性表现不同。

核基质结合区对马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因介导抗病性的影响

为探索核基质结合区(m atrix attachm ent reg ions,MAR s)对RNA介导的病毒抗性的影响,我们将从烟草中克隆到的核基质结合区TM 2构建在包含马铃薯Y病毒全长非翻译CP基因的植物表达载体pRPVYCPN的表达盒的两侧,构建了植物表达载体pRTM 2CPNTM 2。采用农杆菌介导基因转化法,将表达载体pRPVYCPN和pRTM 2CPNTM 2转入烟草品种NC89中,分别获得了144株和344株转基因烟草。抗病性检测发现,核基质结合区的存在能明显提高RNA介导抗性的产生效率。在含MAR s转基因植株中,抗病植株的比率为15.1%,而不含核基质结合区的转基因植株的抗病比率则为8.3%。这一研究结果对抗病毒植物的分子育种和转基因表达调控有指导意义。

黄瓜花叶病毒辣椒分离株抗性遗传规律的研究

采用４Ｘ ４完全双列杂交方法研究了辣椒对黄瓜花叶病毒辣椒分离株（ＣＭＶ－Ｐ）抗性的遗传规律，研究结果表明，辣椒对 ＣＭＶ－Ｐ的抗性至少受 ４对以上核基因控制，具有数量性状遗传特点；抗性的回交效应显著而正反交效应不显著；辣椒对ＣＭＶ—Ｐ的抗性遗传经检验符合“加性—显性”模型，主要受基因的加性效应影响。群体中抗病基因频率高于感病基因频率。通过自交、回交、系统选择可获得抗病性超亲的系统。抗Ｘ感组合的Ｆ１代很难获得超亲组合，要获得高抗杂交组合需选双亲都高抗的亲本。