基于荧光染料Cy5.5标记的引物延伸法鉴定细菌RNA剪切加工位点

【背景】传统引物延伸法常与放射性标记结合使用,但由于放射性元素半衰期短、危害人体健康及严格的操作要求等限制了其在一般实验室的广泛使用。因此,开发新型非放射性引物延伸法成为当前研究的热点。【目的】建立非放射性的引物延伸法,并利用该方法实现对细菌RNA剪切加工位点的鉴定。【方法】将包含RNA剪切位点的序列克隆至双荧光报告系统,然后利用荧光染料Cy5.5标记的特异性靶向mcherry寡核苷酸引物进行延伸,并辅以Northern blotting、RT-qPCR等技术,确定RNA剪切加工的精确位点。【结果】鉴定了来自解纤维梭菌cip-cel mRNA中的2个剪切加工位点均位于颈环结构下游的单链区域,且在剪切位点附近未发现保守序列。【结论】基于Cy5.5标记的引物延伸法能够精确鉴定RNA剪切加工位点,且与传统的放射性引物延伸法相比,该方法具有更高的安全性和更快的检测速度,能够满足一般实验室的实验要求。

基于高通量测序鉴定细菌RNA加工位点方法的开发

简便的RNA剪切加工位点鉴定方法对于细菌核糖核酸内切酶功能和转录后水平调控机制的研究至关重要。本研究基于第二代测序技术,开发了一种能够精确鉴定RNA剪切加工位点及其剪切效率的高通量测序方法。在该方法中,首先将各种潜在RNA剪切加工的DNA片段分别克隆至报告系统进行转录,然后利用其下游特异引物进行反转录,直接构建约500 bp的双端测序cDNA文库,并在Illumina MiSeq平台对该文库进行测序。最后通过对reads 5′末端的比对定位,精确测定发生RNA剪切的位点。利用该方法,成功鉴定了来自Ruminiclostridium Cellulolyticum的cip-cel mRNA中的3个RNA剪切加工位点。与传统引物延伸和5′RACE等方法相比,该方法不仅具有更高的安全性和通量,同时还可像Northern印迹鉴定RNA的剪切效率。

CCACA碱基序列是玉米CMS-S线粒体orf355-orf77转录本剪切识别位点

玉米S型细胞质雄性不育系(CMS-S)及其近等基因恢复系是研究核-质互作机制的重要遗传资源和理想模式体系.目前认为,CMS-S花粉败育是由其线粒体内细胞质不育基因orf355-orf77表达的毒性蛋白引起,而核育性恢复基因Rf3可通过引发orf355-orf77转录本的降解而解除其毒性作用,使花粉育性得以恢复.本研究采用Northern杂交和3'RACE技术确定了orf355-orf77转录本的剪切位点,并发现在育性恢复的花粉中,orf355-orf77转录本被剪切成小片段之后聚合了poly(A)序列,推测这一过程加速了mRNA分子的降解,是育性恢复的关键环节.利用生物信息学方法分析了orf355-orf77转录本6个剪切位点的侧翼序列,发现在剪切位点下游10个碱基的位置均含有5'-CCACA-3'序列,推测该序列受到特定功能蛋白的识别,然后募集核酸内切酶对其进行剪切.研究结果可为揭示玉米CMS-S育性恢复机理提供重要的理论依据.

circRNA CPSF6核内转移促进同型半胱氨酸诱导的滋养细胞凋亡

目的探讨环状RNA剪切及多聚腺苷酸化特异因子6(circRNA CPSF6)在同型半胱氨酸(Hcy)致滋养细胞凋亡中的作用及机制。方法体外培养HTR-8/SVneo人绒毛膜滋养层细胞,分为对照组(0 mmol/L Hcy处理)与1 mmol/L Hcy处理组。采用免疫荧光细胞化学染色检测滋养细胞胱天蛋白酶3(caspase-3)的表达,Western blot法检测caspase-3蛋白水平;实时定量PCR检测circRNA CPSF6的mRNA表达水平;同时,运用小干涉RNA(siRNA)技术敲低滋养细胞circRNA CPSF6表达,Western blot法检测细胞caspase-3、caspase-9、B细胞淋巴瘤分子2(Bcl2)、Bcl2相关X蛋白(BAX)表达;实时定量PCR检测circRNA CPSF6在Hcy处理前后滋养细胞胞质/胞核中的表达水平。结果与对照组相比,Hcy处理组caspase-3表达明显增加,circRNA CPSF6 mRNA表达上调;敲低circRNA CPSF6后,caspase-3表达降低,线粒体凋亡途径被抑制;正常培养的滋养细胞中circRNA CPSF6在胞质大量表达,而给予Hcy处理后,circRNA CPSF6主要在胞核表达。结论通过circRNA CPSF6核内转移激活线粒体凋亡途径促进Hcy诱导的滋养细胞凋亡。

柯萨奇病毒B组3型基因组剪切片段的序列分析

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)感染细胞时其基因组RNA存在不稳定现象,但产生机制尚不清楚。本研究将柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染细胞后,利用5′cDNA末端快速扩增技术(5′rapid amplification of cDNA ends,5′RACE)扩增并克隆细胞内CVB3基因组片段,并对每条序列及其5′端的二级结构进行分析。结果获得的20条CVB3基因组片段,长度为2067~5547bp,片段断端主要分布于2Apro和2C编码区。RNAfold分析显示,这些片段多数在5′断点端形成二级茎-环结构。本研究显示,CVB在宿主细胞感染时可形成大量不完整基因组RNA片段,这些片段可在5′断点端形成局部双链结构,提示片段不是随机产生,可能是RNA酶剪切产物。此发现有助于理解CVB基因组不稳定的机制。

多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对视网膜血管内皮细胞IGF-1／VEGF信号通路的抑制作用

背景视网膜新生血管（RNV）是多种眼底血管疾病的共同表现，研究证实胰岛素样生长因子（IGF-1）能够刺激血管内皮细胞的增生，从而促进新生血管的形成，而多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制的作用。但PSF在RNV形成过程中的作用尚不清楚。目的研究PSF对IGF-1／血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的调控作用。方法将猕猴视网膜血管内皮细胞RF／6A进行培养后分为Pegfp-C2-PSF质粒转染组、pGenesil．PSF-RNAi质粒转染组及各自的对照组，分别在细胞中转人真核质粒Pegfp—C2-PSF、pGenesil—PSF—RNAi及相应的空白质粒。各组细胞培养液中分别添加或不添加胰岛素样生长因子1（IGF-1）以刺激细胞生长，采用MTT法检测各组RF／6A细胞的增生率并筛选各组最适PSF剂量，用于进一步的实验。采用逆转录PCR法测定和比较不同PSF转染组间用或不用U0126处理组间RF／6A细胞中VEGFmRNA的表达；采用Westernblot法验证PSF对IGF-1诱导的细胞外调节蛋白激酶（ERK）活化的促进作用。结果IGF-1刺激后Pegfp．C2．PSF质粒转染组以0．50IxgPSF为最适剂量，其RF／6A细胞的增生率为0．220±0．020，细胞中VEGFmRNA相对表达量为0．79±0．07，分别低于其对照组的0．260±0．006和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．040、0．016）；IGF-1刺激后pGenesil—PSF—RNAi质粒转染组以1．00IxgPSF作为最适剂量，其RF／6A细胞增生率为0．35±0．02，VEGFmRNA相对表达量为2．29＋0．43，分别高于其对照组的0．210-4-0．019和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．003、0．019）。IGF-1刺激后1、3、6hPegfp-C2-PSF质粒转染组细胞中pERK蛋白表达量均明显低于未转染组，差异均有统计学意义（P=0．017、0．000、0．000）。Pegfp-C2-PSF质粒转染组U0126’处理后细胞中VEGFmRNA的相对表达量为0．93±0．21，明显低于未转染组的1．32±0．08，差异均有统计学意义（P=0．037），同时明显低于Pegfp—C2-PSF质粒转染组无U0126处理的细胞中VEGFmRNA的相对表达量1．23±0．09，差异有统计学意义（P=0．002）。结论PSF可抑制IGF-1诱导的RF／6A细胞中的ERK信号通路的活化，下调VEGF在RF／6A细胞中的表达，进而抑制RF／6A细胞的增生。

核因子E2相关因子1诸多亚型的产生机制及其在疾病中的作用

核因子E2相关因子1(nuclear factor-erythroid 2 related factor 1,Nrf1/Nfe2l1)在个体正常生长发育过程中具有维持细胞内稳态和器官完整性的作用。其功能缺失会产生严重的氧化应激和基因组不稳定等,继而导致肝癌、神经退行性疾病等多种疾病。近年研究发现,Nrf1存在多种具有不同程度活化活性甚至相反活性的亚型,这些亚型的分布可能在肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。为了更好地了解Nrf1在组织细胞中所发挥的功能,本文简要介绍Nrf1的发现历程,并从选择性剪切加工、内部选择性翻译起始、翻译后剪切加工等方面阐述Nrf1亚型的产生机制,同时详细阐明“跨膜动态加工”、“位点特异性剪切加工”、“泛素依赖性剪切加工”3种翻译后加工模型的差异。最后,介绍Nrf1各亚型的生物学功能及其产生过程出现异常时在疾病中的作用。本文着重对Nrf1各亚型产生机制及其在疾病中的作用进行综述,力求为寻找肿瘤治疗的新策略提供新的方向。

核酶的发现及其在基因治疗中的应用

核酶是具有催化功能的结构性RNA分子,且大多数核酶具有剪切RNAs的功能,可以利用它们剪切信使RNA(mRNAs)调节基因表达,从而作为基因治疗的新手段.阐述核酶的发现历程,以及其在艾滋病、肝炎、肿瘤和生殖道系统感染等基因治疗的研究进展.最后,分析核酶在基因治疗中的技术优势及存在问题,并对核酶领域包括更多核酶晶体结构的确立、酶切机理的理解、核酶新的生物学功能的发现等研究进行展望.

结直肠癌组织中SEC62、LSM12表达与临床病理参数、上皮间质转化及预后的关系

目的分析结直肠癌(CRC)组织中前蛋白易位因子(SEC62)、RNA剪切因子(LSM12)表达与临床病理参数、上皮间质转化(EMT)及预后的关系。方法选取92例CRC患者,术中收集CRC组织及癌旁组织。用实时荧光定量PCR法检测SEC62、LSM12 mRNA及EMT相关基因[E-钙黏蛋白(E-cadherin/N-钙黏蛋白(N-cadherin)、Twist转录因子(TWIST)基因],用免疫组化法检测SEC62、LSM12蛋白。分析结直肠癌组织中SEC62、LSM12 mRNA表达与临床病理参数、EMT相关基因的关系。从癌症基因组图谱数据库(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov)下载643例CRC患者的癌组织RNAseq数据,分析SEC62、LSM12 mRNA表达与CRC患者5年总生存率的关系。结果与癌旁组织比较,CRC组织中SEC62、LSM12、N-cadherin、TWIST mRNA表达高,E-cadherin mRNA表达低,SEC62、LSM12蛋白阳性表达率高,差异均有统计学意义(P均<0.05)。不同TNM分期、分化程度及有无淋巴结转移的CRC组织中SEC62、LSM12 mRNA表达比较差异有统计学意义(P均<0.05)。CRC组织中SEC62 mRNA表达与N-cadherin、TWIST mRNA表达呈正相关(r分别为0.643、0.721,P均<0.05),与E-cadherin mRNA表达呈负相关(r=-0.684,P<0.05)。CRC组织中LSM12 mRNA表达与N-cadherin、TWIST mRNA表达呈正相关(r分别为0.715、0.786,P均<0.05),与E-cadherin mRNA表达呈负相关(r=-0.687,P<0.05)。根据SEC62、LSM12 mRNA表达的中位数将TCGA中643例CRC患者分为SEC62 mRNA高表达者(>3.12,n=322)、低表达者(≤3.12,n=321),LSM12 mRNA高表达者(>2.57,n=321)、低表达者(≤2.57,n=322)。SEC62 mRNA高表达者5年总生存率低于SEC62 mRNA低表达者(Log-rankχ^(2)=5.960,HR=1.547,95%CI:1.225~1.820,P<0.05);LSM12 mRNA高表达者5年总生存率低于LSM12 mRNA低表达者(Log-rankχ^(2)=6.012,HR=1.649,95%CI:1.253~1.834,P<0.05)。结论CRC组织中SEC62、LSM12高表达,二者表达变化与肿瘤TNM分期、分化程度、淋巴结转移、EMT及预后有关。

一个血小板无力症家系的基因诊断及产前诊断

目的对一个血小板无力症家系进行基因诊断及产前诊断。方法应用PCR、逆转录-PCR、测序、限制性酶切分析及AT克隆分析等技术，从表达水平及基因组水平对该家系先证者进行仃GA2B与JTGB3基因诊断；进一步取母亲4个半月的胎儿羊水进行ITGA2B的产前诊断。结果先证者ITGA2B基因编码区第477～506的99个碱基发生缺失，导致密码子160～192缺失。进一步检测基因组DNA，确定为第4外显子的c．374C〉G点突变和第4内含子的＋5位G〉C点突变（IVY4＋5G〉C）复合突变体。其母亲为c．374C〉G点突变的携带者，其父亲为IVS-4＋5G〉C点突变的携带者，其中后者为剪切结构位点的点突变，而前者为菲剪切结构位点突变，但二者导致了相同的RNA剪切效果。产前诊断结果显示胎儿未遗传其父母的突变，为两个位点均正常的健康个体。先证者及其父母ITGB3基因未见异常。结论C．374C〉G和IVS-4＋5G〉C两个突变均为人类突变数据库和血小板无力症数据库未记载的新突变，二者导致相同的mRNA剪切异常，为该家系的疾病的致病原因。

乙型肝炎病毒polyA形成与调节因素研究进展

乙型病毒性肝炎（乙肝）是全球范围的重大公共卫生问题之一,其病原体乙型肝炎病毒（HBV）可通过多种途径感染人体,引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。HBV感染是全球十大死因之一,世界上30%的人感染过或者成为HBV的携带者。据统计[1],全球共有3.5亿HBV慢性感染者,每年因HBV慢性感染所致的肝纤维化或者肝癌感染致死的人数有100万左右。