RNA原位杂交法检测组织内弓形虫的实验研究

目的 探讨RNA原位杂交法在弓形虫病理检测中的应用。方法 设计并合成弓形虫SAG2基因来源的寡核苷酸探针。弓形虫RH株感染昆明株小鼠 ,分别于感染后第 2、3、4、5、6、7天处死 ,取肝组织制备石蜡标本进行RNA原位杂交 ,结果同HE染色及免疫组化相比较。结果 RNA原位杂交法于感染后第 2天检到阳性结果 ,组织内弓形虫的检出率 (2 8/ 2 8)高于免疫组化 (2 1/ 2 8)及HE染色法 (16 / 2 8)。结论 RNA原位杂交法是一种简便准确的弓形虫病理检测方法。

RNA原位杂交实用技术

利用互补RNA为探针进行原位杂交是分析组织或细胞内RNA分布的行之有效的方法 ,通过对mRNA分布的研究可以了解特定基因的表达情况。原位杂交技术过程较长 ,操作繁琐 ,从而在一些实验中不能得到很好的使用 ,为此本文根据我们过去的实际操作经验对该技术中的一些使用技巧作简要的介绍。

RNA原位杂交法动态观察弓形虫速殖子对BALB/c小鼠小肠黏膜的黏附及侵入

目的RNA原位杂交法观察弓形虫速殖子黏附和侵入小肠黏膜的部位及时间。方法30只BALB/c小鼠随机分为两组,实验组(24只)每鼠灌胃感染2×104个弓形虫速殖子(悬于0.2mlPBS),对照组(6只)给予等量PBS。分别于感染后15min、30min、1h、2h、4h和8h各处死实验组小鼠4只和对照组小鼠1只,取十二指肠、空肠和回肠标本制备石蜡切片,并作RNA原位杂交。光学显微镜观察原位杂交切片,随机选取50个视野,计数所有观察视野内的虫体总数并计算平均数。结果侵入的弓形虫速殖子可位于小肠上皮细胞(吸收细胞、杯状细胞和内分泌细胞)的纹状缘、吸收细胞胞浆内或相邻吸收细胞间及固有层内。感染后15min,黏附于空肠的速殖子数量(4.93±3.949)显著高于回肠(3.78±3.102)(P<0.05);侵入空肠的速殖子数量(4.92±4.164)显著高于十二指肠(4.10±3.532)和回肠(3.68±3.301)(P<0.05)。随着感染后时间的延长,黏附于各肠段的速殖子数量逐渐减少,而侵入的数量逐渐増多。与感染后15min相比,感染后8h,黏附于十二指肠(2.32±3.039)、空肠(3.15±3.241)和回肠黏膜(2.59±3.028)的速殖子数量均显著减少(P<0.05),而侵入十二指肠(8.92±8.955)、空肠(9.11±6.667)和回肠黏膜(9.15±10.192)的速殖子数量均显著增加(P<0.05)。结论弓形虫速殖子对其所黏附的小肠上皮细胞无严格的选择性,但其侵入小肠的部位具有选择性,空肠为速殖子侵入的易感部位。

RNA原位杂交法检测灌胃接种弓形虫速殖子小鼠体内虫体的早期动态分布

目的观察经灌胃接种弓形虫RH株速殖子后,虫体在小鼠体内的早期动态分布。方法弓形虫RH株速殖子经灌胃接种BALB/c小鼠20只(2×104/只),用RNA原位杂交法观察感染后1、2、4、6和8d小鼠的肠系膜淋巴结(MLN)、肝、脾、肺和脑组织内速殖子的数量及分布趋势。同时设PBS空白对照组(5只)。结果感染后1d,在MLN、肝和脾组织内均检测到速殖子,分别于感染后4d和6d在肺和脑组织内检测到速殖子。感染后6～8d,各组织间虫荷差异均有统计学意义(P值均<0.05),组织内虫荷依次为MLN>肝>脾>肺>脑,各组织内虫体数量呈时间依赖性。结论弓形虫RH株速殖子经灌胃接种后,首先侵入MLN、肝和脾,其次为肺,最后为脑,且虫体在MLN内增殖较快。

HbNIN2基因在巴西橡胶树嫩皮和中脉中的RNA原位杂交分析

在橡胶树(Hevea brasiliensis)中,转化酶基因HbNIN2被证明是决定产胶细胞乳管中蔗糖代谢的关键基因,同时在叶片、树皮等多种组织中均有表达。为进一步研究HbNIN2基因的功能,利用原位杂交(in situ hybridization)技术对HbNIN2基因在橡胶树嫩皮和中脉两种组织中的表达区域与表达特点进行研究。结果显示,在橡胶树嫩皮中,HbNIN2基因主要在韧皮部中表达,而在中脉中,HbNIN2基因在除木质部外的其它部位均有表达,同时在两种组织的乳管细胞中HbNIN2基因均有明显的表达信号。比较而言,HbNIN2基因在中脉中的表达量远高于嫩皮。结合其它研究结果,推测HbNIN2基因可能参与橡胶树乳管蔗糖代谢、叶片生长发育调控等。

DNA－RNA原位杂交法检测肺癌中的C－myc基因

ＤＮＡ－ＲＮＡ原位杂交法检测肺癌中的Ｃ－ｍｙｃ基因林春艳，戴旭东，孙喜文，谭玉英，石于波哈尔滨医科大学肿瘤研究所（哈尔滨１５００４０）ｍｙｃ基因既是一种可易位的基因，又是一种受多种物质调节的可调节基因，它与其它基因相互作用可使细胞无限增殖，获得永生化...

RNA－RNA原位杂交检测和定量分析心肌中肠道病毒RNA

ＲＮＡ－ＲＮＡ原位杂交检测和定量分析心肌中肠道病毒ＲＮＡ上海医科大学中山医院上海市心血管病研究所彭天庆，杨英珍本研究以同位素Ｓ标记肠道病毒特异的柯萨奇Ｂ－３病毒（ＣＶＢ３）的负股ＲＮＡ为探针作原位杂交对多种心肌石蜡切片进行肠道病毒ＲＮＡ检测，同时结合...

蔬菜作物的RNA原位杂交技术

RNA原位杂交技术是在细胞水平上研究基因时空表达的最直接、有效的方法之一,在拟南芥和玉米上应用广泛,但在蔬菜作物上应用很少,尚未形成成熟的技术体系。结合拟南芥、玉米上的RNA原位杂交技术和自己的试验经验,以黄瓜为例,对蔬菜作物RNA原位杂交技术方法进行优化,并对其具体流程和注意事项进行阐述。

RNA原位杂交技术的一些应用技巧

目的:检测基因在动物组织或细胞中的时空表达模式。方法:转录反义RNA探针;利用RNA原位杂交技术检测人和小鼠牙原基中若干基因的表达。结果与结论:通过优化条件,转录出完整的反义RNA探针,并成功地利用RNA原位杂交技术在组织中检测到基因的表达;分析了一些在RNA原位杂交的过程中可能碰到的问题及其解决方法。

光敏核不育水稻叶片中钙调素mRNA原位杂交分析(简报)

采用组织RNA原位杂交技术研究钙调素基因在光敏核不育水稻接受光周期信号后时空表达特征的结果表明，钙调素基因在不同光周期诱导后，叶片在育性转换对光周期敏感的不同发育时期中，mRNA表达量和空间分布上没有明显的差异，与光敏核不育水稻育性不存在直接的关系；叶肉细胞中钙调素mRNA的大量表达，可能与光敏色素信号系统调节叶绿体发育及光合作用有关。

建立基于循环肿瘤细胞上的RNA原位杂交技术

目的:循环肿瘤细胞(circulating tumor cell,CTC)是一种重要的体液生物标志,通过检测C T C的数量及其表型可以动态了解肿瘤进展.本研究建立一种基于CTC细胞滴片上的RNA原位杂交方法,分析CTC表型间接了解肿瘤进展.方法:采用负性富集技术获得肝细胞肝癌患者外周血CTC等有核细胞的细胞滴片,并在CTC滴片上尝试建立RNA原位杂交技术.选择真核生物高度保守的肽基脯氨酰顺反异构酶B(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B,PPIB)基因作为阳性对照,合成针对PPIB基因高灵敏度的RNA杂交探针,并在实体肿瘤患者外周血CTC滴片中检测PPIB基因的转录活性.结果:用于外周血有核细胞负性富集的多种试剂,均不影响在CTC滴片上的RNA原位杂交,最终优化了对传统CTC滴片细胞的固定方式和固定时间,实现了在负性富集的肝细胞肝癌CTC滴片上的PPIB基因原位RNA杂交,获得了CTC细胞中PPIB基因转录信息,建立了实时动态监测实体肿瘤患者外周血CTC中特定基因转录活性的方法.结论:缩短采血到固定细胞的时间以减少RNA降解,通过高灵敏探针的RNA原位杂交可以实现对CTC中特定基因转录水平的实时监测.

免疫组化检测与RNA原位杂交检测三阴性乳腺癌组织程序死亡受体1一致性研究

目的探究免疫组化检测(IHC)和RNA原位杂交(RNAscope)检测三阴性乳腺癌组织程序死亡受体1(PD-1)的一致性。方法选取自2019年3月到2021年4月北部战区总医院收治的62例三阴性乳腺癌患者为研究对象。分别运用IHC和RNAscope检测PD-1的状态。结果IHC检测阳性患者占83.9%(52/62),阴性患者占16.1%(10/62)。RNAscope检测阳性率为91.9%(57/62),阴性率为8.1%(5/62)。RNAscope检测与IHC检测结果相关性Kappa值=0.758(P<0.05)。结论IHC和RNAscope检测三阴性乳腺癌组织PD-1一致性较强。

RNA原位杂交技术在玉米研究中的应用

RNA原位杂交技术是在组织显微水平研究目标基因时空表达分布的重要技术手段。在植物中,原位杂交技术广泛应用于拟南芥和水稻的研究,而在玉米的研究中该技术应用较晚,实验技术体系尚有待优化和完善。文章以玉米为材料探索和优化原位杂交实验技术体系,并着重对实验的方法步骤、技术要点、结果分析等方面进行讨论和总结。实验结果表明,优化后的实验技术体系能够特异的检测到目标基因在玉米雄花中表达分布。

一种进行基因表达研究的有效技术——小鼠全胚胎RNA原位杂交

目的 建立小鼠整体胚胎水平研究基因表达的方法。 方法 采用地高辛配基标记的造血相关基因 Runx1和神经发生相关基因 Runx3RNA探针 ,对 10 .5～ 14天小鼠全胚胎进行 RNA原位杂交 ,通过检测胚胎组织中 m RNA的存在状况来观察基因的表达。结果 在小鼠胚胎观察到 Runx1和 Runx3基因在不同组织中的清晰的杂交信号 ;不同探针和不同大小的胚胎需要不同的最适蛋白酶 K处理条件。 结论 小鼠全胚胎 RNA原位杂交技术是一种有效的研究基因表达的方法 ,可以从整体水平反映基因表达的全貌 ,在功能基因组学时代将具有很大的应用潜力 ,为基因表达研究提供了一种可与 L ac Z染色和免疫组织化学媲美的选择。蛋白酶 K处理条件是否适当是小鼠全胚胎 RNA原位杂交成功的关键因素。

寡核苷酸探针RNA原位杂交法检测肺孢子虫的研究

目的探讨RNA原位杂交法在肺孢子虫病理检测中的应用。方法采用小亚单位RNA位点来源的寡核苷酸探针、地高辛加尾标记、Wistar雌性大鼠皮下注射地塞米松建立肺孢子虫肺炎动物模型,取肺组织制备石蜡标本进行RNA原位杂交,并将结果与瑞氏-吉姆萨染色法进行比较。结果 RNA原位杂交法于感染后第3周检到虫体,呈游离分布;7～8周时检测到大量包囊;9～10周时滋养体大量出现;组织内肺孢子虫的检出率(32/32)高于瑞氏-吉姆萨染色法(25/32)。结论 RNA原位杂交法是一种敏感特异的肺孢子虫病理检测方法。

RNA原位杂交、荧光原位杂交和免疫组织化学检测宫颈癌PD-L1和galectin-9比较研究

目的分析不同检测方法检测宫颈癌组织程序性死亡配体-1(programmed death ligand 1,PD-L1)和T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(T-cell immunoglobulin mucin 3,TIM-3)配体半乳糖凝集素-9(galectin-9)的一致性。方法选择宫颈癌患者100例,分别采用RNA原位杂交(RNA in situ-hybridization,RNAscope)、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测宫颈癌组织标本PD-L1和galectin-9的表达水平及一致性。结果采用RNAscope、FISH和IHC检测宫颈癌患者PD-L1表达水平的阳性率分别为71.0%、20.0%、77.0%,与FISH比较,RNAscope和IHC检测宫颈癌患者PD-L1表达水平较高(P<0.001),其中RNAscope和IHC检测结果Kappa=0.940,一致性好。采用RNAscope、FISH和IHC检测宫颈癌患者galectin-9表达水平的阳性率分别为72.0%、22.0%、75.0%,与FISH比较,RNAscope和IHC检测宫颈癌患者galectin-9表达水平较高(P<0.001),其中RNAscope和IHC检测结果Kappa=0.970,一致性好。结论采用RNAscope和IHC等病理技术检测宫颈癌特异性PD-L1和galectin-9的一致性高,为今后开展特异性免疫治疗宫颈癌患者提供了重要的依据。

免疫组织化学、荧光原位杂交及RNA原位杂交检测PD-L1的一致性比较

目的比较免疫组织化学(IHC)、DNA荧光原位杂交(FISH)及RNA原位杂交不同检测方法检测程序性死亡配体1(PD-L1)之间的一致性。方法收集南京大学医学院附属鼓楼医院病理科2014—2018年诊断为EB病毒相关性胃癌(EBVaGC)59例,EB病毒阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤(EBV+DLBCL)27例和三阴性乳腺癌(TNBC)30例。分别运用IHC、FISH及RNA原位杂交(RNAscope)检测PD-L1的状态。结果所有样本均成功进行上述3种方法学检测,59例EBVaGC中PD-L1 IHC阳性率为84.7%(50/59),FISH阳性率为10.2%(6/59),RNAscope显示81.4%(48/59)为高表达;27例EBV+DLBCL中PD-L1 IHC阳性率为74.1%(20/27),FISH阳性率为7.4%(2/27),RNAscope显示66.7%(18/27)为高表达;30例TNBC中PD-L1 IHC阳性率为66.7%(20/30),FISH阳性率为16.7%(5/30),RNAscope显示81.5%(22/30)为高表达。检测结果相关性分析显示:IHC与RNAscope相关性为0.759(P<0.01),IHC和FISH相关性为0.759(P=0.040),FISH与RNAscope相关性为0.077(P=0.031)。结论PD-L1不同检测方法中,RNAscope与IHC检测一致性较强,FISH与IHC和RNAscope的一致性均较差,单纯依靠IHC诊断PD-L1状态存在误诊的可能,利用RNAscope技术可以检测其mRNA的表达水平。RNAscope是一种评价PD-L1状态的相对准确和客观的方法。

RNA可视化原位杂交技术对感染细胞中猪瘟病毒RNA定位与分布

【目的】为研究CSFV RNA在体外感染细胞中的分布及定位,建立了一种准确、敏感的RNA可视化原位杂交技术。【方法】本研究通过比对Gen Bank中公布的CSFV、BVDV和BDV全序列,避开BVDV和BDV的同源区,设计了CSFV RNA及内参基因β-actin的特异探针。以CSFV中等致病力毒株(He BHH1/95)为参考毒株,在PK15细胞中培养病毒,加入RNA可视化原位杂交的特异探针和相应试剂,采用荧光共聚焦显微镜进行成像观察。通过综合分析观测结果、荧光强度、重复性等因素,采用正交试验优化了对原位杂交过程中具有重要影响的蛋白酶K浓度和甲醛固定时间,建立了CSFV RNA可视化原位杂交技术,并与FAT方法比较该技术灵敏度;用我国目前流行的CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3基因亚型及BVDV、PPV、PRV和PCV-2病毒进行特异性试验。最终,以CSFV强致病力毒株(SM)接种PK15细胞,病毒感染后0.5、1、3、6、8、10、14、18、24、36、48、72、96h(hours post inoculation,hpi)取样,每个时间点2个重复,采用CSFV RNA可视化原位杂交技术进行检测。为佐证病毒蛋白在细胞中的定位及分布,同时采用FAT方法对SM株E2蛋白在PK15细胞中的表达情况进行动态研究。【结果】采用该技术在荧光共聚焦显微镜下可观察到CSFV RNA在细胞中的定位;当蛋白酶K浓度为1:1 000、甲醛固定时间为30min时为最优反应条件;灵敏度试验表明该技术对病毒的检测极限为10-8/200μL,比FAT高3.5个数量级;特异性试验结果显示该探针能与CSFV 1.1、2.1、2.2、2.3亚型结合,与BVDV、PPV、PCV-2、PRV无交叉反应。采用该技术对CSFV RNA感染后在靶细胞中的定位与分布研究结果显示:0.5hpi在胞核和胞浆均能检测到RNA,0.5—6hpi RNA主要分布于胞核内并在核内富集;10hpi胞浆内RNA逐渐增多,胞核内RNA逐渐减少,24hpi RNA主要集中在胞浆内细胞核周围;36hpi核外RNA大量聚集增多,72hpi达到峰值;96hpi RNA总量有所下降。而FAT结果显示:8hpi在少数细胞的胞浆内检测到病毒E2蛋白,10—24hpi蛋白表达数量一直较少;36hpi蛋白表达量不断增多,72hpi达到最大值;96hpi荧光信号由强变弱。病毒蛋白在细胞浆内的聚集数量与细胞浆中RNA含量成正相关。【结论】首次建立了CSFV RNA可视化原位杂交检测技术,并对CSFV强致病力毒株在细胞中的RNA定位分布进行了研究,发现病毒RNA吸附和进入靶细胞的时间早于0.5hpi,观察到CSFV RNA有在细胞核内的生活史。