短发夹结构RNA干扰新城疫病毒的增殖

以新城疫病毒(NDV)NP基因为标靶,构建3个细胞内表达发夹样结构小干扰RNA(shRNA)的质粒载体,在鸡胚成纤维细胞(CEF)和鸡胚上进行了RNAi试验,筛选出一个有效抑制病毒复制的小分子ndv1.用阳离子脂质体转染试剂Silent-fect将ndv1转染CEF,以不相关shRNA质粒载体HK为阴性对照,4h后接种NDV,与对照相比,干涉组在病毒感染后3hNP基因的表达量降低2.3倍,6h降低21.1倍,9h降低9.8倍;ndv1能在48h内完全阻断NDV在CEF中的增殖,延缓病变出现时间,减轻病变程度.将Silent-fect-ndv1混合物与NDV同时注入10日龄SPF鸡胚绒毛尿囊腔,能使105ELD50NDV感染后17h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少94.4%,使106ELD50 NDV感染后17h鸡胚尿囊液中病毒增殖量减少62.5%.实验结果证实,在CEF中存在RNAi机制,抑制ND VNP基因的表达能有效阻断该病毒增殖,说明NP基因在NDV复制过程中起重要作用.实验结果为进一步利用RNAi技术在CEF和鸡胚中研究病毒基因组功能及筛选抗病毒小分子奠定了基础.

人EGFL7基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的构建人类表皮生长因子域7(EGFL7)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法将靶向EGFL7基因的短发夹结构RNA(shRNA)表达序列连接到包含U6启动子及绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中,获得重组质粒,命名为pGCL-GFP-vshEGFL7,经多聚酶链反应(PCR)和测序鉴定后,与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染至包装细胞293T,包装产生病毒液,测定其滴度。结果PCR扩增和测序结果证实EGFL7shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液的滴度为4.8×107TU/ml。结论成功构建人EGFL7基因shRNA慢病毒载体。

靶向人EGFL7基因的短发夹结构RNA对胶质瘤细胞系U251增殖的影响

目的研究类表皮生长因子域7(EGFL7)基因特异性短发夹结构RNA(shRNA)对胶质母细胞瘤细胞系U251细胞体外增殖的影响。方法在筛选出人EGFL7基因的有效RNA干扰靶序列并设计构建其重组慢病毒表达载体的基础上,感染胶质母细胞瘤细胞系U251细胞,荧光显微镜观察转染效率,实时荧光定量多聚酶链反应和蛋白质印迹分别检测EGFL7基因的mRNA和蛋白表达水平,甲基噻唑基四唑(MTT)法检测其增殖能力。结果 EGFL7基因的特异性shRNA转染U251细胞后,EGFL7的mRNA和蛋白表达水平明显降低;细胞的增殖受到明显抑制。结论 EGFL7基因的特异性shRNA可明显抑制胶质母细胞瘤细胞系U251的增殖,提示EGFL7基因在胶质母细胞瘤细胞的增殖中发挥重要作用。

生存素小干扰RNA对人腺样囊性癌ACC-2细胞移植瘤体生长的抑制作用

目的观察生存素(Survivin)小干扰RNA(siRNA)在体内是否能抑制腺样囊性癌移植瘤体的生长。方法裸鼠体内注射稳定转染靶向Survivin基因的shRNA真核表达载体pGenesil-shRNA-Survivin后的人腺样囊性癌细胞株ACC-2,观察移植肿瘤生长情况,以空白对照组及阴性质粒对照组作为对照。处死裸鼠后测量移植瘤体积;采用苏木精-伊红染色病理证实移植瘤后,免疫组织化学法检测移植瘤的Survivin蛋白表达情况,半定量RT-PCR检测Survivin mRNA表达情况。结果处死裸鼠后测量移植瘤体积表明,pGenesil-shRNA-Survivin组移植瘤体积明显减小;其SurvivinmRNA及蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论siRNA能在体内明显抑制腺样囊性癌Survivin的表达,Survivin siRNA能有效抑制腺样囊性癌裸鼠体内移植瘤的生长。

AKT2基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的:构建丝/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体。方法:利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经MluI和ClaI进行酶切后的PLVTHM载体连接产生shRNA慢病毒载体。应用shRNA慢病毒载体转染293T细胞及U87细胞,测定病毒滴度,流式细胞仪测定U87细胞的转染效率,PCR及Western blot鉴定AKT2基因在U87细胞中的下调作用。结果:成功构建了shRNA-AKT2慢病毒载体,经测序与设计合成的靶向链完全一致。荧光显微镜下观察293T细胞感染效率大于90%,病毒滴度为3.59×107TU/ml;流式细胞仪测定对AKT2细胞的转染效率为86.93%。PCR测定shRNA载体感染U87细胞后AKT2的干扰效率为68%。Western Blot结果显示该慢病毒载体对AKT2的表达有较为显著的敲减作用。结论:成功构建了人胶质瘤细胞株AKT2基因RNAi慢病毒载体,为后续的体内外功能学试验创造了条件。

c-myc靶向siRNA抑制人结直肠癌Colo320细胞的增殖及下调hTERT基因表达的研究

目的探讨发夹状shRNA封阻c-myc基因,抑制人结直肠癌Colo320细胞增殖、生长的状况。方法针对原癌基因c-myc构建发夹状shRNA的真核表达质粒,并转染人结直肠癌Colo320细胞。荧光定量RT-PCR检测c-myc及细胞端粒酶逆转录酶的mRNA表达,Western-blot检测c-myc、hTERT蛋白表达水平。Southern blot检测端粒的长度,PCR-ELISE法检测端粒酶活性。3H-thymidine实验分析DNA合成和细胞增殖。结果转染细胞增殖、生长皆受到抑制。同时,c-myc和hTERT的mRNA和蛋白表达显著下降,端粒的长度明显缩短,端粒酶活性降低。结论c-myc的shRNA对人结直肠癌Colo320细胞的增殖、端粒长度、端粒酶活性有特异性抑制作用,并呈剂量依赖关系。

靶向siRNA对人子宫颈癌细胞的抑制作用

目的构建增殖细胞核抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在人HeLa细胞表达,同时观察PCNA shRNA对HeLa细胞体外增殖及生物学特性的影响。方法将PCNA cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA(1-4),并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA(1-4)转染HeLa细胞,运用Western blot方法检测PCNA蛋白的表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果PCNA shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞于G0/G1期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论PCNA shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。

PCNA的shRNA的真核表达载体的构建及对子宫颈癌细胞的干预性研究

目的构建PCNA的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在Hela细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人Hela细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法将PCNA的cD-NA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil-1,构建真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil-1-PCNA1-4转染子宫颈癌细胞,运用Westernblot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长,阻滞细胞G0/G1—S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论PCNA的shRNA能显著抑制人Hela细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PC-NA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。

靶向HBs基因的shRNA表达载体的构建及其抑制HepG2.2.15表达HBVsAg的作用

探索用PGenesil-1(Pg)构建的靶向乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(简称Pgs),对体外培养HepG2.2.15细胞中的HBV基因及其抗原表达的抑制作用。设计、合成靶向HBVS区的3对DNA序列,分别插入PGenesil-1中构建3个siRNA表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,经限制性内切酶,DNA序列测定等技术鉴定确认。筛选并确定最佳细胞接种量及重组质粒转染量后,分别或按不同组合转染HepG-2.2.15细胞,48h后采用半定量RT-PCR检测HBVsmRNA转录水平,免疫细胞化学技术检测HBsAg表达水平,MEIA分别检测细胞裂解液和培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果表明,HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3均能不同程度地抑制HepG2.2.15细胞中的HBsAg、HBeAg合成和HBs-mRNA转录。成功构建的HBV真核表达载体Pgs1、Pgs2、Pgs3,其中PgS3能显著抑制HBsAg表达(P<0.01)。多种表达载体联合对抗原表达的抑制作用效率不同。

Pkm2-shRNA真核表达载体的构建和对急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株的作用研究

本研究旨在构建M2型丙酮酸激酶(M2-pyruvate kinase;PKM2)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体,研究特异性沉默pkm2基因对急性早幼粒细胞白血病(APL)耐药性的影响。设计pkm2基因的3个特异shRNA序列,利用基因重组技术将其克隆到含有U6启动子的PBSU6载体上,通过酶切和测序等方法鉴定重组质粒的正确性。利用Western blot方法检测了pkm2-shRNA对急性早幼粒细胞白血病耐药细胞株NB4R2细胞内源性M2-PK蛋白表达的影响,通过NBT还原实验检测了pkm2基因沉默后NB4R2细胞分化情况。结果表明:成功构建了3个有效特异的pkm2-shRNA,在蛋白水平上证明了其对NB4R2细胞M2-PK基因沉默的有效性。发现干涉M2-PK基因后,可显著地促进耐药细胞NB4R2细胞的分化。结论:DNA载体途径的pkm2-shRNA能促进早幼粒细胞白血病细胞的分化,具有基因靶向药物开发前景。

重组人组织因子RNA干扰穿梭载体的构建及其体外鉴定

目的利用RNA干扰(RNAi)技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建携带发夹结构的TF-shRNA的穿梭表达载体。方法在以往研究的基础上,设计具有小发夹结构的TF-shRNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至pShuttle Vector1.0-CMV,转化E.coli DH5a菌株,提取重组穿梭质粒行酶切鉴定和测序,RT-PCR法检测其沉默TF基因的效果。结果成功构建了携带TF-shRNA的穿梭表达载体,经限制性内切酶酶切和测序软件分析证实,与设计序列同源性达98%以上;采用多重比较进行统计学分析结果显示,重组质粒pShuttle-TF-shRNA能显著性降低293细胞中TFmRNA表达,转染后24,48和72h细胞中TFmRNA表达含量显著降低,有统计学意义(P=0.000)。结论成功构建了针对人TF基因的穿梭表达载体,为将TF作为治疗靶点提供了实验基础。

靶向siRNA下调人结直肠癌Colo320细胞端粒长度与端粒酶逆转录酶基因表达的研究

目的:探讨发夹状shRNA封阻原癌基因(c-myc),抑制癌细胞增殖、生长的作用。方法:针对c-myc的构建发夹状shRNA的真核表达质粒,并转染人结直肠癌Colo320细胞。荧光定量RT-PCR检测c-myc及细胞端粒酶逆转录酶的mRNA的表达,Western-blot检测c-myc、端粒酶逆转录酶(hu-man telomerase reverse transeriptase,hTERT)蛋白表达水平。Southernblot检测端粒的长度,PCR-ELISE法检测端粒酶活性。3H-thymidine实验分析DNA合成和细胞增殖。结果:转染细胞增殖、生长皆受到抑制。同时c-myc和hTERT的mRNA和蛋白表达显著下降,端粒的长度明显缩短,端粒酶活性降低。结论:c-myc的shRNA对人结直肠癌Colo320细胞的生长增殖、端粒长度、端粒酶活性有特异性抑制作用,并呈剂量依赖关系。

PCNA的shRNA对子宫颈癌细胞的抑制研究

目的:构建增殖细胞抗原(PCNA)的小发夹结构RNA(shRNA)的真核表达载体并在HeLa细胞表达,同时观察PCNA的shRNA对人HeLa细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变。方法:将PCNA的cDNA的shRNA引物插入真核表达载体pGenesil1,构建真核表达质粒pGenesil1PCNA14,并通过酶切和测序等方法进行鉴定,将真核表达质粒pGenesil1PCNA14转染子宫颈癌细胞,运用Westernblot检测PCNA的蛋白表达,流式细胞仪分析细胞周期变化。结果:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,阻滞细胞G0/G1S期,PCNA的蛋白表达同时受到抑制。结论:PCNA的shRNA能显著抑制人HeLa细胞的生长,其抑制作用可能通过阻断PCNA蛋白表达实现,实验结果为进一步研究PCNA的shRNA对子宫颈癌的基因治疗奠定了基础。

针对HBs基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

目的以PGenesil-1(Pg)为载体构建针对乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的shRNA表达载体PGenesil-1-HBs(Pgs)。方法设计、合成针对HBs区的三对DNA序列,分别插入PGenesil-1中,并对重组质粒进行限制性内切酶谱和DNA序列测定分析。结果3个不同的重组shRNA表达载体经限制性酶识别和DNA序列测定完全正确。结论成功构建了3个针对HBs基因的shRNA表达载体。

腺相关病毒介导的RNA干扰抑制HeLa细胞中CTCF的表达

目的:利用RNA干扰(RNAi)稳定抑制HeLa细胞中CTCF的表达。方法:构建能够抑制转录因子CTCF表达的短发夹RNA(shRNA)的腺相关病毒载体,重组病毒感染HeLa细胞后挑取单克隆,用Western印迹法和实时荧光定量PCR检测CTCF的表达水平。结果:获得3株CTCF被显著抑制的HeLa细胞株,Western印迹法和实时荧光定量PCR结果均显示CTCF的表达水平被抑制,其中最明显的被下调76%。结论:shRNA病毒表达载体构建成功,HeLa细胞中CTCF的表达可被长期稳定地抑制。

GIT1发夹结构对成骨细胞内局部黏附激酶的磷酸化和分布的影响

目的探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1的RNA发夹结构(GIT1-RNAh)对成骨细胞内局部黏附激酶(FAK)的磷酸化和分布的影响。方法成功构建含GFP-RNAh和GIT1-RNAh的腺病毒,在血小板衍生生长因子(PDGF)刺激的条件下,免疫荧光染色法检测成骨细胞内FAK的蛋白分布,Western blot检测FAK的磷酸化水平,Image J软件检测成骨细胞的扩增面积。结果与感染GFP-RNAh的成骨细胞相比,在PDGF刺激条件下,GIT1-RNAh明显抑制FAK磷酸化水平(P<0.05),扰乱FAK的分布,抑制成骨细胞的面积扩增(P<0.05)。结论 GIT1-RNAh通过扰乱FAK的分布及其磷酸化抑制成骨细胞的面积扩增。

TACE基因shRNA真核表达载体的构建及其对HeLa细胞生物学活性的影响

目的构建靶向肿瘤坏死因子转换酶（TACE）的小发夹结构RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰TA-CE表达对HeLa细胞增殖和凋亡的影响。方法设计针对TACE基因的4个shRNA序列,构建真核表达载体shR-NA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4。通过酶切和测序等方法进行鉴定。转染HeLa细胞后,用Realtime PCR的方法检测其对HeLa细胞TACE基因表达的影响;用ELISA检测细胞分泌的sTNF-α,间接反映干扰TACE的效果;用MTT法检测细胞增殖活性;用DNA ladder和流式细胞术检测细胞凋亡。结果成功构建和筛选出了针对TACE基因的3个有效的特异性真核表达载体,且均在不同程度上抑制了HeLa细胞TACE基因的表达。ELISA检测结果与Realtime PCR实验结果相符。同时发现干扰TACE基因后,HeLa细胞的生长受到抑制,凋亡率升高,与对照组相比差异有显著性意义（P〈0.05）。实验组转染shRNA1~3后72h可见特征性的基因组DNA ladder条带。结论所构建的TACEshR-NA真核表达载体能显著抑制TACE的表达。干扰TACE基因的表达可有效抑制HeLa细胞的增殖并诱导其凋亡。

稳定靶向干扰长链非编码RNA BC002811胃癌SGC-7901细胞株的构建

目的 BC002811在胃癌中的生物学功能及其作用机制尚不明确。文中旨在构建长链非编码RNA (lncRNA BC002811的短发夹结构RNA (shRNA)重组慢病毒载体,建立稳定干扰BC002811表达的胃癌SGC-7901细胞株。方法实验根据不同BC002811 siRNA转染人胃癌SGC-7901细胞分为:siRNA-1组(siRNA-1正义链及反义链)、siRNA-2组(siRNA-2正义链及反义链)、siRNA-3组(siRNA-3正义链及反义链)、对照组(siRNA-NC正义链及反义链)。取SGC-7901细胞内对BC002811表达抑制效果最明显的siRNA序列构建shRNA慢病毒载体,定义为shRNA组。包装重组慢病毒及测定滴度,建立稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株,MTS法检测细胞增殖能力。结果 siRNA-1组SGC-7901细胞内BC002811的RNA干扰效率较其他组升高。因此,后续实验选择siRNA-1设计BC002811 shRNA。对照组、shRNA组的病毒滴度分别为4.5×108、3.7×10~8TU/mL,提示病毒已包装成功。shRNA组BC002811表达水平[(10%±1%)]较对照组明显降低[(100%±4%)],差异有统计学意义(P<0.01),提示稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株构建成功。与对照组比较,shRNA组的SGC-7901细胞生长速度明显减慢(P<0.05),提示下调BC002811表达可抑制SGC-7901细胞增殖。结论成功建立了稳定靶向干扰BC002811表达的SGC-7901胃癌细胞株,为BC002811在胃癌中的功能及其作用机制研究奠定了基础。

大肠杆菌内源性转录终止子的支持向量机预测方法

内源性转录终止子的计算预测是基因转录调控研究的重要内容,但当前方法的预测特异性偏低.在深入分析大肠杆菌内源性终止子中RNA发夹结构和多聚胸腺嘧啶区域等特征信号的基础上,为内源性终止子建立了一个由5个特征变量组成的包含序列组分、局部构象和能量分布信息的特征集,并根据此特征集实现了一种基于支持向量机的内源性终止子计算预测方法.针对大肠杆菌内源性终止子数据集和编码区阴性对照集的六重交叉验证测试证实了预测方法的有效性,对已知数据的预测平均正确率达到了99.4%.在对大肠杆菌全基因组限定范围内的搜索中,该预测方法可以成功地识别出绝大多数已知内源性终止子,与其他几种常用方法相比,预测结果总数大幅度减少,预测的特异性有了明显提高.

马铃薯X病毒外壳蛋白基因片段的瞬时表达诱导对PVX的高抗性(英文)

为获得抗马铃薯X病毒(PVX)的植株,从疑似感染马铃薯X病毒的马铃薯叶片中提取出PVXcp cDNA,将其保守片段插入到RNAi质粒pHellsgate12中以构建编码发夹结构RNA的载体,通过Agroinfiltration的方法在本氏烟植株中瞬时表达。结果表明:病毒侵染10d后,15株引入该载体的本氏烟植株对PVX均具有抗性,此载体可用于产生对马铃薯X病毒具有高抗性的转基因植物。