miRNAs与肿瘤

微小RNA（micro RNA,mi RNA）是一类长19～24 nt的单链、内源性非编码RNA,其序列高度保守。成熟miRNA的转录生成首先是在细胞核内经RNA多聚酶Ⅱ和（或）多聚酶Ⅲ的作用形成初始miRNA（pri-miRNA）,然后在核内切酶Drosha Rnase Ⅲ作用下,去除pri-miRNA的5＇-cap和3＇-poly（A）结构形成含茎环结构的前体miRNA（pre-miRNA）,再经由Ran-GTP/Exportin-5受体将pre-miRNA从核内输出到细胞质。

动物细胞核内miRNA的加工过程

microRNA(miRNA)是存在于真核生物中的一类大的基因家族,与其靶mRNA分子一起形成了生物体内复杂的调控网络。miRNA在基因表达调节过程中的关键性作用涉及到发育时序的控制、造血细胞的分化、细胞凋亡、细胞增殖以及器官的形成等方面。其中最值得探讨的问题是miRNA的生物发生过程及其调控机制。近年来,miRNA在动物细胞核中加工机制的研究取得了较大的进展。在细胞核中,RNA多聚酶II指导的miRNA基因的转录,微处理器作用下的pri-miRNA的剪切及exportin-5协助下的pre-miRNA的输出过程彼此协调,共同而有序的完成miRNA在细胞核中的加工过程。

PolⅡ-ChIP-PE-MS方法的建立及其在SNP功能研究中的应用

目的:建立RNA多聚酶Ⅱ-染色质免疫沉淀-引物延伸-飞行时间质谱技术(PolⅡ-ChIP-PE-MS),并利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量,为活体状态下研究疾病关联基因SNP的功能研究提供一种高通量的研究手段.方法:采用PCR-RFLP方法对HepG2细胞印迹基因SNRPN(仅父源等位基因表达)基因组DNA和cDNA进行基因分型,利用PolⅡCTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀,针对SNP位点两侧序列设计PCR引物和延伸引物,以外侧引物进行PCR扩增,采用延伸引物进行VLET引物延伸,产物纯化后经MALDI-TOF质谱鉴定.结果:对SNRPN杂合子细胞的SNRPNC1654312TSNP进行PolⅡ-ChIP-PE-MS分析发现,基因组DNA样本和染色质免疫沉淀前样本在C、T等位点都包含相同PolⅡ结合量,但免疫沉淀后标本(被磷酸化RNA多聚酶Ⅱ结合的染色质)就仅在T等位点有结合,与产生mRNA转录的等位点相对应.结论:成功建立起PolⅡ-ChIP-PE-MS方法,利用该方法检测SNP等位特异磷酸化PolⅡ结合量是可靠的,可以利用PolⅡ-ChIP-PE-MS策略鉴定疾病关联基因SNP的功能.

人p100蛋白:可增强STAT6基因转录活性的新因子

目的 :建立可稳定表达人类p10 0蛋白的细胞株 ,研究细胞内p10 0蛋白参与STAT6介导的基因转录调控的机制。方法 :利用免疫共沉淀法检测蛋白与蛋白间结合 ,荧光素酶法测定STAT6基因转录活性。结果 :p10 0既可与STAT6结合 ,亦可与RNA多聚酶Ⅱ结合 ,并能增强STAT6介导的基因转录活性。结论 :p10 0蛋白是STAT6共激活因子 ,可桥连STAT6和基本转录调控元件 ,促进STAT6介导的基因转录活性。

人肝细胞中雌激素受体α基因启动子使用情况的鉴定

目的鉴定人肝细胞中雌激素受体α(estrogen receptorα,ESR1)基因启动子使用情况。方法常规培养和刺激HepG2和L02细胞,甲醛固定细胞,超声剪切染色质,采用利用PolⅡ CTD末端Ser5特异性抗体进行染色质免疫沉淀(PolⅡ-ChIP),针对文献报道的8个可能启动子区设计引物进行PCR扩增,鉴定ESR1基因启动子的使用情况。结果β-雌二醇刺激不同肝细胞后进行PolⅡ-ChIP发现,HepG2肝癌细胞株中ESR1启动子E1、E2、F沉淀出有PolⅡ的结合的片段,而在L02细胞株中则仅启动子D有PolⅡ的结合的片段沉淀出来。结论不同肝细胞中ESR1的表达受不同的启动子的调控。HepG2肝癌细胞株中ESR1的表达受启动子E1、E2、F调控,而在L02细胞株中ESR1的表达受启动子D调控。