小分子干扰RNA片段逆转KBv200细胞多药耐药的实验研究

目的:研究小分子干扰RNA片段(siRNA)对舌癌多药耐药(MDR)细胞系KBv200细胞的MDR1基因表达及其功能的影响,探讨siRNA作为未来化疗增敏剂的可能性。方法:运用针对MDR1基因序列的siRNA(MDR1-siRNA)在脂质体的介导下转染KBv200细胞;用RT-PCR分析MDR1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测P-糖蛋白(P-gp)的表达;荧光分光光度法检测细胞内多柔比星(Dox)的积蓄;MTT法检测KBv200细胞对长春新碱(VCR)和Dox的敏感性变化。结果:MDR1-siRNA作用24和48 h能抑制MDR1基因的表达(P<0.05),其mRNA水平和P-gp水平均明显下降,同时使KBv200细胞对VCR和Dox的敏感性显著增加(P<0.01),并显著增加细胞内Dox的蓄积(P<0.01)。结论:MDR1-siRNA能显著抑制KBv200细胞内MDR1基因介导的MDR。

EuCAD基因小片段RNAi对烟草木质素合成的影响

【目的】深入研究尾叶桉(Eucalyptus urophylla)肉桂酰乙醇脱氢酶(CAD)基因序列中的关键片段并利用其进行木质素合成调控。【方法】采用生物信息学工具对EuCAD基因进行序列分析,根据编码蛋白保守结构域的分布情况进行筛选,获得一段44 bp关键序列用于构建RNA干扰载体并转化烟草,获得转基因植株并对基因表达水平、木质素含量等表型进行检测。【结果】获得28个转基因株系,转基因植株正常生长发育,与野生型无异,随机挑选3个株系进行检测,发现CAD基因表达水平均较野生型显著降低,以R1株系降幅最大,降至野生型的12.51%。对R1株系进一步检测发现,其茎部直径与野生型无异,但木质部厚度较野生型显著降低,其中第4节处降低11.75%,第6节处降低10.06%,茎部整体木质素含量较野生型降低15.26%。表明该RNAi片段显著抑制烟草中CAD基因表达并影响烟草木质素合成。【结论】通过序列分析筛选出的EuCAD基因小片段,可通过RNA干扰显著影响烟草木质素合成,为尾叶桉木质素合成调控研究提供了技术参考。

siRNAs在RNA干扰中的作用

由siRNAs介导的RNAi是低等生物体内的一种基因调控方式。siRNAs诱导RNAi发生的效率有赖于其结构、序列及末端碱基修饰情况。本文作者简略论述了能在体内诱导高效RNAi现象的siRNAs结构组成的特征及其可能影响siRNAs作用效率的因素。

siRNA干扰NF-E2相关因子2对喉鳞状细胞癌化疗敏感性的影响

目的探讨小片段干扰RNA(siRNA)干扰NF-E2相关因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2)对人喉癌Hep2细胞化疗敏感性的影响及凋亡的差异。方法体外培养人喉癌细胞系Hep2,设立实验组和对照组,实验组(Hep2/siRNA组)采用脂质体转染法,转染siRNA至Hep2细胞系,对照组(Hep2/siRNA-control组)转染空质粒siRNA-control。经Western Blot验证其转染效果后,采用CCK-8法检测计算Hep2/siRNA与Hep2/siRNA-control经不同浓度梯度顺铂(分别为1、2、4、8、16μg/ml)处理后的细胞增殖抑制率及IC50值。通过凋亡试剂盒分别染色Hep2/siRNA与Hep2/siRNA-control细胞系,采用流式细胞仪检测两组细胞的凋亡率。结果实验组的Nrf2蛋白表达比对照组发生下调,经不同浓度梯度顺铂处理24h后,Hep2/siRNA细胞系增殖抑制率相对Hep2/siRNA-control逐渐升高,顺铂浓度为4μg/ml时,对照组细胞增殖率为35.55%±6.14%,而实验组细胞增殖率为46.07%±5.21%,IC50值下调,细胞凋亡率由17.1%(对照组)升高至26.6%(实验组)。结论 siRNA干扰Nrf2基因可增强Hep2细胞系对顺铂的敏感性。

补中益气汤含药血清联合siRNA对肺腺癌A549/DDP细胞的LRP表达影响

目的:运用小干扰RNA片段(small interfering RNA,siRNA)的方法特异性沉默肺耐药蛋白(lung resistance protein,LRP)基因,观测该方法同补中益气汤含药血清联合应用逆转人肺腺癌耐药细胞A549/DDP的效果。方法:设计并合成针对LRP基因对应序列的siRNA,采用转染试剂对细胞进行转染。实验分组为:空白对照组、补中益气汤含药血清组、siRNA组及补中益气汤含药血清+siRNA组,利用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测对该基因的抑制作用,Western blot及免疫细胞化学法检测蛋白质表达。结果:参照空白对照组,补中益气汤含药血清组、siRNA组及补中益气汤含药血清+siRNA组mRNA及LRP蛋白表达均减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:补中益气汤含药血清和siRNA均能降低A549/DDP的LRP蛋白表达,并且2种因素之间存在交互作用。

肝素酶siRNA联合亚砷酸抑制胰腺癌侵袭性的实验研究

目的:观察Hpa小干扰RNA(small-interfering RNA,siRNA)联合亚砷酸对胰腺癌侵袭力的影响,为Hpa-siRNA联合亚砷酸治疗胰腺癌提供实验依据。方法:将3条Hpa干扰靶序列Hpa1-siRNA,Hpa2-siRNA,Hpa3-siRNA稀释退火,分别与线性化pGenesil-1.1质粒表达载体的连接制成pGenesil1.1/Hpa1-siRNA、pGen-esil1.1/Hpa2-siRNA、pGenesil1.1/Hpa3-siRNA等重组质粒。然后将上述目的基因转染SW1990胰腺癌细胞,并设空白对照和阴性对照组。RT-PCR检测转染后Hpa-mRNA表达,Western blot检测转染后Hpa蛋白表达。采用Transwell小室试验检测转染后Hpa-siRNA和经亚砷酸处理SW1990细胞体外侵袭能力。结果:Hpa-mR-NA和Hpa蛋白在基因转染前后的表达,NC和HK组无明显差别,Hpa1-siRNA,Hpa2-siRNA,Hpa3-siRNA三组均明显下降,Hpa2-siRNA抑制效率优于Hpa1-siRNA和Hpa3-siRNA(P<0.05)。随着亚砷酸浓度从0.5、1.0、2.0mg/ml递增,侵袭抑制率也随之升高,分别为7.78%、46.8%及76.8%,差异有统计学意义(χ2=71.633,P<0.05)。Hpa2-siRNA联合亚砷酸后均能显著抑制SW1990胰腺癌细胞侵袭力,抑制率均达100%。结论:Hpa-siRNA和亚砷酸对SW1990胰腺癌细胞侵袭力具有协同抑制作用。

MDR1、GSTπ特异性siRNA真核表达载体的构建及表达

目的构建多药耐药基因(MDR1)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTπ)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达载体并检测其表达。方法参照siRNA模板设计原则,设计并化学合成2条siRNA模板序列,退火后将其插入质粒pSilencer2.1-U6,限制性酶切和基因测序进行鉴定。脂质体介导下转染K562/Adr细胞,实时荧光定量PCR分析MDR1、GSTπmRNA的表达,荧光免疫组化检测Pgp、GSTπ蛋白的表达。结果重组质粒pSilenc-er2.1-MDR1、GSTπ经酶切、测序分析表明siRNA模板序列成功插入预计位点,并且序列正确。用pSilencer-mdr1、pSilencer2.1-GSTπ分别转染K562/Adr细胞株,mdr1mRNA表达量下降了71.5%,GSTπmRNA表达量下降了39.8%,荧光免疫组化显示Pgp、GSTπ表达均显著减少(P<0.01)。结论成功构建了MDR1、GSTπ特异性siRNA真核表达载体,该载体可不同程度逆转K562/Adr细胞的多药耐药。

内源小RNAs在植物胁迫反应中的作用

世界范围内,农作物的产量都容易受到各种生物和非生物因素的影响,对植物逆境适应性反应机制的深入研究有助于我们采取新的措施,以提高作物的逆境适应性。以前通常认为植物适应逆境胁迫的机制主要涉及相关基因在转录水平的调节,然而,近来发现部分内源小RNAs(siRNAs),如miRNAs、nat-siRNAs和lsiRNAs不仅可以调节植物的生长发育,而且在植物逆境反应中具有重要作用。文章就这些内源小RNAs在氧、矿质元素、干旱、低温、脱落酸、机械、重金属、生物及其他环境因素胁迫中的作用机制做一概述。

肝素酶siRNA抑制胰腺癌侵袭性的实验研究

目的 观察肝素酶（hparinase,Hpa）小干扰RNA（small-interfering RNA,siRNA）对胰腺癌侵袭力的影响.方法 设计3条Hpa干扰靶序列：Hpa1-siRNA,Hpa2-siRNA,Hpa3-siRNA,稀释退火后分别与线性化pGenesil-1.1质粒表达载体的连接制成pGenesil1.1/Hpa1-siRNA、pGenesil1.1/Hpa2-siRNA、pGenesil1.1/Hpa3-siRNA重组质粒.然后将上述目的基因转染SW1990胰腺癌细胞,并设空白对照和阴性对照组.RT-PCR检测Hpa-mRNA表达,Western blot检测Hpa蛋白表达.Transwell小室检测SW1990细胞体外侵袭力.结果 Hpa-mRNA和Hpa蛋白在基因转染前后的表达,NC和HK组无明显差别,Hpa1-siRNA,Hpa2-siRNA,Hpa3-siRNA三组均明显下降,Hpa2-siRNA抑制效率优于Hpa1-siRNA和Hpa3-siRNA（P＜0.05）.Hpa2-siRNA明显抑制SW1990胰腺癌细胞侵袭力,抑制率均达42.6%.结论 Hpa2-siRNA是Hpa特异性干扰序列,对SW1990胰腺癌细胞侵袭力具有明显抑制作用.

植物小RNAs的研究进展

小RNAs(长度小于40nt)是nc-RNAs重要的一部分,现在植物中已发现了多种小RNAs,如小干扰RNAs(siRNAs)、微小RNAs(miRNAs)、反式作用的小干扰RNAs、天然反义转录小干扰RNAs、异染色质小干扰RNAs、长小片段小干扰RNAs、天然反义转录的微小RNAs及其一些未命名的小RNAs。成熟的小RNAs聚集相关的蛋白质因子,可以抑制转录,导致转录水平的基因沉默(TGS);或介导目标mRNA的剪切,抑制翻译,导致转录后水平基因沉默(PTGS)。

慢病毒载体介导survivin基因siRNA对裸鼠移植人肺腺癌的体内抗癌机制研究

目的探讨慢病毒载体介导survivin基因小片段干扰RNA(siRNA)对裸鼠移植人肺腺癌的体内抑瘤活性。方法制备表达survivin-siRNA的慢病毒载体,构建裸鼠移植人肺腺癌模型,将裸鼠分为空白组(PC组)、空白载体组(NC组)、实验组(RNAi组)3组,分别给予生理盐水、空白病毒载体和siRNA;siRNA组肿瘤组织局部注射表达survivin-siRNA的慢病毒载体,观察肿瘤体积及其随时间的生长变化曲线;分别采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白质印迹法检测各组裸鼠肿瘤组织中survivin基因的信史RNA(mRNA)及其表达的蛋白水平变化;采用流式细胞术检测肿瘤细胞周期组方图变化。结果慢病毒载体介导survivin-siRNA对裸鼠肺腺癌的抑瘤率为46.07%;siRNA组瘤重与NC组和PC组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而NC组与PC组瘤重比较差异无统计学意义(P>0.05);siRNA组survivin基因mRNA及蛋白表达较NC组和PC组明显降低,抑制率分别为72.00%、53.00%;G1期细胞百分比明显增加,S期细胞百分比则明显减少。结论慢病毒载体介导的siRNA能有效抑制裸鼠移植人肺腺癌survivin基因的表达,有效激发细胞凋亡。

lncRNA-AB073614在U251细胞中的表达及对细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响

目的观察脑胶质瘤细胞U251中长链非编码RNA(lncRNA)-AB073614表达变化及小分子干扰RNA片段(si-RNA)转染对其细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法取U251细胞、正常星形胶质细胞NHA,采用Realtime PCR法检测AB073614。随后U251细胞分别加入或不加入si-RNA转染,MTT实验检测细胞增殖情况,细胞划痕实验检测细胞迁移能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果 U251、NHA细胞中AB073614表达水平分别为3.57±0.28、1.00±0.17,两者比较,P<0.05。MTT实验显示,si-AB073614转染的U251细胞存活率低于未转染的(P<0.05)。细胞划痕实验显示,si-AB073614转染的U251细胞迁移能力低于未转染的(P<0.05)。Transwell实验显示,si-AB073614转染的U251细胞穿膜细胞数低于未转染的(P<0.05)。结论 U251细胞中lncRNAAB073614表达升高,si-RNA转染lncRNA-AB073614能明显抑制其增殖、侵袭、迁移能力。

肌肉萎缩蛋白Fbox-1基因沉默对糖皮质激素作用下肌管萎缩的影响

目的:研究糖皮质激素地塞米松(dexamethasone,DEX)对体外培养肌管的形态、蛋白质合成/分解代谢及肌肉萎缩蛋白Fbox-1(Atrogin-1)的表达,Atrogin-1基因沉默是否可减轻肌管萎缩。方法:体外培养小鼠肌纤维细胞株C2C12细胞并分化为肌管后,用DEX处理48h,同位素3H-酪氨酸掺入法检测蛋白合成,3H-酪氨酸释放率检测蛋白分解代谢;荧光显微镜观察肌管形态并拍照;Northern blot检测Atrogin-1mRNA水平;应用小分子干扰RNA片段(siRNA)技术使Atrogin-1基因沉默后,观察DEX作用下肌管形态的改变。结果:DEX5μmol/L作用后,肌管酪氨酸(tyrosine)掺入率下降17.4%,同时tyrosine释放率升高24.7%,使肌管形态变细、萎缩;剂量依赖性地升高Atroign-1蛋白表达水平,使Atroign-1mRNA表达升高3倍;Atrogin-1基因沉默可改善DEX引起的肌管萎缩。结论:DEX促进肌管蛋白质分解代谢,并抑制蛋白合成代谢,导致肌肉萎缩;Atrogin-1基因沉默可改善DEX引起的肌肉萎缩,Atrogin-1基因可能是逆转肌肉消耗性营养不良的有效靶点。

Rab23在脑胶质瘤细胞中的表达及其对细胞增殖的影响

目的探讨Rab23在胶质瘤U251细胞系中的表达及其对细胞增殖的影响。方法培养胶质瘤U251细胞系,将细胞分为3组:空白对照组、Rab23转染组和小分子干扰RNA片段(siRNA)干扰组。Rab23转染组脂质体转染Rab23质粒过表达Rab23,siRNA干扰组转染siRNA干扰Rab23的表达。用免疫印迹法测定Rab23蛋白表达水平,实时荧光定量PCR法测定Rab23基因表达水平,噻唑蓝比色法测定干预后U251细胞的增殖水平。结果空白对照组、Rab23转染组和siRNA干扰组的Rab23蛋白表达水平(灰度值)分别为0.82±0.12,1.05±0.23和0.72±0.13,Rab23转染组与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);siRNA干扰组与Rab23转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01);在接种第3天,空白对照组、Rab23转染组和siRNA干扰组的细胞增殖水平(OD值)分别为0.75±0.13,0.64±0.05和1.36±0.18,Rab23转染组与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);siRNA干扰组与Rab23转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。Rab23基因结果的趋势与蛋白一致。结论Rab23在胶质瘤U251细胞中有表达并且该表达对细胞增殖有抑制作用。

沉默驱动蛋白KIF4A的表达对卵巢癌细胞SKOV3迁移的影响

目的研究沉默KIF4A基因对人卵巢癌SKOV3细胞迁移能力的影响。方法检索针对KIF4A基因的小干扰RNA(siRNA),构建shRNA表达质粒,转染人卵巢癌细胞SKOV3,通过G418筛选建立稳定低表达KIF4A的SKOV3细胞株。采用蛋白质免疫印记(Western blot)法检测shRNA对KIF4A蛋白分子的敲除效率。并通过细胞迁移实验评价低表达KIF4A对SKOV3细胞迁移能力的影响。结果成功筛选出稳定低表达KIF4A的细胞株,选择干扰效率较高的细胞株进行实验。Transwell细胞迁移实验显示,低表达KIF4A的细胞株的迁移率较阴性对照组增长近3倍(P<0.05)。结论 KIF4A低表达,可增强人卵巢癌细胞SKOV3的迁移能力。