SHARP-2特异的RNA干扰腺病毒载体的构建及功能鉴定

目的 构建转录SHARP-2 基因特异性的小发夹RNA（SHARP-2-shRNA）的重组腺病毒（Rad-hSHARP）,并观察其对正常大鼠肾细胞（NRK cell）SHARP-2基因的表达影响.方法 设计带有SHAPR-2特异性干扰序列的PDC316-SHARP-shRNA穿梭质粒与腺病毒骨架质粒pBHGloxdelE13cre 共转染293 细胞,并在293 细胞内进行同源重组,构建Rad-hSHARP.并使用实时定量RT-PCR在NRK细胞中对重组腺病毒干扰效果进行鉴定.结果 成功构建了特异性SHARP-2基因RNA 干扰的腺病毒载体系统,并有效抑制NRK 细胞中SHARP-2 基因的表达.结论 成功构建SHARP-2-shRNA 的Rad-hSHARP,为利用特异性沉默SHARP-2基因的腺病毒载体抑制T细胞增殖活化研究奠定基础.

人SET基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的SET基因表达产物是SET／TAF-1β蛋白，功能涉及基因表达调控、染色质修饰、翻译后修饰等生物过程，多水平、多通路地调节靶因子，其表达异常与多种疾病相关。为研究SET基因与临床多种疾病发生发展的关系，文中构建表达人SET基因的小分子干扰RNA（siRNA）重组腺病毒载体。方法根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64 bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后，与退火的寡核苷酸连接，构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。该穿梭质粒经Not Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后与pAdTrack-CMV连接，构建含有绿色荧光蛋白（green fluorescense protein，GFP）报告基因的穿梭质粒PATC—H1-siRNA。分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒PATC—H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。Pac Ⅰ酶切线性化重组质粒pAd—H1-siRNA后，转染AD293细胞进行病毒包装和扩增。根据GFP报告基因的表达观察重组病毒的产生和感染效率，用Western blot检测人SET蛋白的表达水平。结果穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功；重组腺病毒载体经AD293细胞包装后可观察到GFP表达；获得的重组腺病毒载体感染AD293细胞。经Western blot检测，SET基因腺病毒载体（AdH1-SiRNA／SET）感染组与未感染腺病毒载体组（空白对照）和感染对照腺病毒载体组（AdH1-SiRNA／NS）相比，SET蛋白表达水平显著降低（P〈0．05），抑制效率为50％～70％。结论成功构建了表达人SET基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA／SET，并在AD293细胞中验证其抑制SET蛋白表达的作用，为进一步研究SET基因参与多种疾病的发生发展提供了材料。

Ki67基因RNA干扰腺病毒表达载体的构建及其抗结肠肿瘤作用研究

目的:构建针对肿瘤增殖基因Ki67的小干扰RNA(Ki67-siRNA)腺病毒表达载体,体外研究其对人结肠癌细胞株SW620细胞生长影响,为结肠癌的基因治疗提供参考。方法:设计可形成小发夹结构的Ki67-siRNA对应模板DNA序列,克隆至缺陷型腺病毒质粒pCA13,构建Ki67-siRNA表达质粒pCA13-Ki67。鉴定正确后,将pCA13-Ki67与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染至293细胞,包装成复制缺陷型腺病毒Ad-Ki67。大量扩增Ad-Ki67,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度。Ad-Ki67感染人结肠癌细胞,结晶紫染色法检测细胞病理作用,MTT法检测细胞存活,Western印迹法检测Ki67表达。结果:酶切分析、测序鉴定表明pCA13-Ki67构建成功,PCR分析表明Ad-Ki67含有Ki67-siRNA序列。Ad-Ki67可显著抑制Ki67蛋白表达及结肠癌细胞生长。结论:含有Ki67-siRNA的重组腺病毒构建成功,其能抑制人结肠癌细胞Ki67基因表达和生长。

西农萨能羊BTN基因RNA干扰序列的筛选及重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】构建西农萨能羊BTN基因RNA干扰的重组腺病毒载体,为研究BTN基因的功能和作用机制奠定基础。【方法】设计并合成3对针对BTN不同位点的shRNA编码序列,克隆到pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA载体中,并与已构建好的表达BTN的pDsRed1-C1-BTN载体共转染HEK293细胞,筛选有效的干扰序列。通过与腺病毒骨架质粒重组,制备表达干扰BTN基因的shRNA的腺病毒,经PacⅠ线性化后,在HEK293细胞中包装并扩增病毒,用TCID50法进行病毒滴度测定,获得高滴度的病毒上清液。【结果】成功构建了西农萨能羊BTN基因的RNAi腺病毒表达载体,腺病毒经包装和扩增后,病毒滴度可达到5×109PFU/mL。【结论】获得了有功能的pAd/PL-DEST/CMV-GFP/U6-shRNA病毒重组子。

小鼠NR4A1基因小分子干扰RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的:构建表达小鼠NR4A1基因的小分子干扰RNA(siRNA)重组腺病毒载体。方法:根据siRNA靶序列设计并合成2条互补的64bp寡核苷酸。pShuttle-H1穿梭质粒经BglⅡ、HindⅢ双酶切后,与退火的寡核苷酸进行连接,构建穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA。PmeⅠ酶切pShuttle-H1-siRNA,然后分别将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1和穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA转化至BJ-5183感受态细菌中进行同源重组。PacⅠ酶切线性化重组质粒pAdEasy-H1-siRNA后转染AD-293细胞进行病毒包装和扩增。Westernblot检测NR4A1基因的表达。结果:穿梭质粒pShuttle-H1-siRNA经双酶切和测序证实构建成功,进一步构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体,重组腺病毒AdH1-siRNA/NR4A1感染小鼠睾丸间质细胞瘤细胞(MLTC-1)后显著抑制目的蛋白表达(抑制率为70%～90%)。结论:成功构建了表达小鼠NR4A1基因的siRNA重组腺病毒载体AdH1-siRNA/NR4A1,并在MLTC-1中验证其抑制NR4A1蛋白表达,为进一步研究NR4A1基因在多囊卵巢综合征(PCOS)中的作用奠定了基础。

靶向乏氧诱导因子-1α和生存素基因的RNA干扰腺病毒穿梭载体的构建

目的构建能同时干扰乏氧诱导因子-1α(hypoxia induced factor1α,HIF-1α)和生存素(survivin)基因表达的RNA干扰(RNA interference,RNAi)腺病毒穿梭载体,并检测其对人肝癌SMMC-7721细胞HIF-1α基因和生存素基因表达的干扰作用。方法根据GeneBank数据库中HIF-1α和生存素基因的cD-NA序列设计干扰序列,构建干扰HIF-1α和生存素基因的重组单基因干扰质粒pGenesil-HIF-1α和pGene-sil-survivin。酶切、测序鉴定正确后,干扰质粒经脂质体介导转染SMMC-7721细胞,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HIF-1α和生存素基因的mRNA表达水平。将两个单基因干扰质粒的干扰序列和U6启动子序列切下并连入腺病毒穿梭载体pshuttle,构建双基因干扰载体pshuttle-Genesil-survivin-HIF-1α,并检测其对HIF-1α和生存素基因mRNA表达的干扰作用。结果测序和酶切鉴定结果显示,pGenesil-HIF-1α和pGenesil-survivin重组质粒构建正确。SMMC-7721细胞分别被pGenesil-HIF-1α和pGenesil-survivin转染48h后,HIF-1α和生存素基因mRNA水平与正常和阴性对照组相比明显降低。双基因干扰载体pshut-tle-Genesil-survivin-HIF-1α酶切鉴定所得片段大小与预期相符,转染该质粒48h后,SMMC-7721细胞中HIF-1α和生存素基因mRNA的表达明显降低。结论成功构建能同时干扰HIF-1α和生存素基因的腺病毒穿梭载体,可有效地同时抑制SMMC-7721细胞内HIF-1α和生存素基因mRNA的表达。

腺病毒载体RNA干扰抑制结缔组织生长因子表达及其抗纤维化作用

目的探讨结缔组织生长因子(CTGF)基因沉默的抗纤维化作用。方法以介导CTGF基因沉默的腺病毒载体Ad.H1-CTGF感染HSC-T6细胞系,利用Real-time PCR及Western印迹在mRNA及蛋白质水平上观察CTGF基因沉默前后,CTGF自身及肝纤维化相关指标金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2及I型胶原(Col-Ⅰ)表达水平的变化。结果腺病毒载体Ad.H1-CTGF感染HSC-T6后,CTGFmRNA转录及蛋白表达分别下调85.32%和76.07%;肝纤维化相关指标TIMP-1、TIMP-2及COL-Ⅰ在mRNA转录(下调82.34%、56.93%和74.21%)及蛋白质表达(下调76.53%、64.02%和70.79%)水平亦显著下调。结论腺病毒载体Ad.H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达,导致肝纤维化相关指标TIMP-1、TIMP-2及COL-Ⅰ的表达明显下调,可能具有潜在的抗纤维化作用。

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景:RNA干扰技术的应用,关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞,目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。目的:利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。设计、时间及地点:开放性实验,于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。材料:穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品;AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystem sInc.(Canada)公司产品。方法:选择针对甲胎蛋白mRNA的特异性小干扰RNA靶序列,设计合成为相应的双链DNA,并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接,构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组产生重组腺病毒。主要观察指标:对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。结果:构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析,证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功,测定滴度为1.4×109nfu/L。结论:实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。

结缔组织生长因子基因RNA干扰复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

目的:构建能介导结缔组织生长因子(CTGF)基因RNA干扰的复制缺陷型腺病毒表达载体。方法:以大鼠CTGF基因为靶序列,设计并合成含编码短发夹RNA序列的寡核苷酸,构建腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF,酶切及测序分析正确后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞,进行病毒包装,得到腺病毒载体Ad.H1-CTGF,用该载体感染HSC-T6细胞,观察其对CTGF基因表达抑制的效果。结果:构建的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF经酶切、测序分析证实正确;包装的病毒载体滴度为4×1010PFU/mL,感染HSC-T6细胞后,Western印迹证实CTGF表达显著减少。结论:构建的腺病毒载体Ad.H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达,为抗纤维化研究提供了有力的工具。

利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术在悬浮细胞中获得基因沉默效应

目的利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA(shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率。方法分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒;将线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架重组;将重组子转染HEK 293细胞,经过3轮病毒包装,收获病毒颗粒并测定滴度。病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应,并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定。结果成功构建带有靶基因干扰序列及scramble、空载体的3种腺病毒重组子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttle-scramble和AD-shuttle)。经过HEK 293细胞包装,最终获得3株病毒颗粒,病毒滴度分别为1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011。NCI-H 250和NCI-H 209细胞感染腺病毒颗粒48 h后,大部分细胞表达GFP,感染率接近100%;且两株细胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h后,PLGF mRNA表达水平降低(P<0.01),肿瘤细胞侵袭能力明显下降(P<0.01)。结论携带shRNA的腺病毒表达载体可以代替电转、脂质体介导等方法,使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默。

腺病毒载体介导的GFP基因在鸭胚成纤维细胞中的表达及RNA干扰

目的:建立在鸭胚成纤维细胞(DEF)中进行RNA干扰(RNAi)的技术平台,为鸭基因组功能的研究提供新的技术手段。方法:以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因,脂质体转染化学合成的GFP特异小干扰RNA(GFP-siRNA),用流式细胞仪测定GFP-siRNA对重组腺病毒(Adv-GFP)介导的GFP基因在DEF中表达的干扰效果。结果:200MOI(感染复数)Adv-GFP介导的GFP基因在DEF中表达效率最高,为31.20%±3.11%,对DEF的活力无明显影响;GFP-siRNA能有效干扰GFP基因在DEF中的表达,相对抑制率为98.56%。结论:在DEF中进行RNAi是可行的,Adv-GFP是介导外源基因在DEF中表达较为理想的载体;首次建立了在DEF中进行RNAi的技术平台,为鸭基因组的功能等研究提供了新的技术手段。

GATA-3小干扰RNA载体对变应性鼻炎小鼠外周血单个核细胞中辅助性T细胞亚群功能的体内调节机制

目的 研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)介导的GATA-3小干扰RNA载体(si-GATA-3)对变应性鼻炎(AR)小鼠外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中辅助性T细胞1(T-helper 1,Th1)和Th2功能的调节作用。方法 构建si-GATA-3,用卵清蛋白构建BALB/c AR模型,si-GATA-3组、si-NC组(无目标基因小干扰RNA的空白对照组)分别用si-GATA-3和si-NC腹腔注射干预AR小鼠,AR组和正常对照组用等量的生理盐水干预。干预结束抽取其外周血,分离PBMCs和血浆。分别用荧光定量PCR和Western blot技术检测PBMCs中GATA-3和T-bet mRNA及其相应蛋白的表达量;用ELISA技术检测血浆中白细胞介素4(IL-4)和干扰素γ(IFN-γ)的含量。结果 si-GATA-3滴度为5×10^(8)TU/ml。成功制备BALB/C小鼠AR模型。si-GATA-3能明显改善AR小鼠的症状。si-GATA-3组PBMCs中GATA-3 mRNA表达明显低于AR组和si-NC组(P<0.01),AR组和si-NC组明显高于正常对照组(P<0.01)。PBMCs中GATA-3蛋白和血浆中IL-4的表达量与GATA-3 mRNA表达相似。si-GATA-3组PBMCs中T-bet mRNA及其蛋白的相对表达均明显高于AR组和si-NC组(P<0.01),AR组和si-NC组二者均明显低于对照组(P<0.01)。si-GATA-3组血浆中IFN-γ的表达量高于正常对照组(P<0.05);AR组与si-NC组中IFN-γ的表达量均明显高于正常对照组和si-GATA-3组(P<0.01)。结论 si-GATA-3能有效改善AR小鼠症状,下调AR小鼠PBMCs中Th2细胞中GATA-3 mRNA、GATA-3蛋白和IL-4的表达,同时上调Th1细胞中T-bet mRNA和T-bet蛋白的表达,纠正Th2/Th1的免疫失衡。

siRNA非病毒载体递送用于肿瘤治疗的研究进展

近年来基于RNA干扰(RNA interference,RNAi)的基因治疗技术在肿瘤治疗方面引起广泛关注。在常规药物治疗无效的情况下,RNAi为癌症患者带来了新的希望。但是,由于小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)在体内存在易降解、难递送等问题,极大地限制了其临床转化潜力。纳米载体以其独特的尺寸效应和多样的修饰策略,能够介导高效、靶向的RNA递送,以实现其基因沉默。本文综述了RNAi在基因治疗中的作用机制以及体内递送siRNA的不同载体,介绍了载体体内递送siRNA的主要障碍和作用靶点,并比较了不同载体在siRNA递送中的优势和不足,为新载体的设计提供借鉴,推动RNA干扰疗法向临床的转化。

人ODC基因第三外显子反义RNA腺病毒载体的构建

目的:构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因第三外显子反义RNA的腺病毒载体。方法:RT-PCR方法克隆出人ODC基因第三外显子的片段,插入pMD18-T载体中,经SalⅠ、BglⅡ酶切,插入穿梭质粒pAd-Track-CMV形成重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr。经PmeⅠ酶切线性化后,转入pAdesy-1细菌中与含腺病毒基因骨架的质粒pAdesy-1同源重组。将重组质粒pAdesy-ODCr经PacⅠ酶切后,转染293细胞包装成腺病毒颗粒,经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果:用RT-PCR方法从人前列腺癌组织中扩增出120bp的cDNA片段,经测序证实为ODC基因第三外显子的片段。重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr转入pAdesy-1细菌中获得多个阳性克隆。重组质粒pAdesy-ODCr转染293细胞进行包装,经荧光显微镜观察可见其在293细胞中表达。进一步通过PCR法证实其含有目的基因。结论:成功地构建了ODC基因第三外显子反义RNA重组腺病毒载体,为研究其抗肿瘤的作用奠定了基础。

Ki67基因RNA干扰增殖型腺病毒对肺癌细胞增殖的抑制作用

目的探讨Ki67基因小干扰RNA(Ki67-siRNA)增殖型腺病毒对肺癌细胞的杀伤作用及Ki67的表达情况。方法提取重组腺病毒的DNA,PCR鉴定正确后,大量扩增,氯化铯梯度离心纯化,测病毒滴度。ZD-Ki67感染人肺癌细胞系(A549),通过荧光显微镜下观察和结晶紫染色法检测细胞病作用、MTT法检测细胞存活、Western印迹法检测E1A、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测Ki67表达。结果PCR鉴定表明ZD55-Ki67包含目的基因且无野生型腺病毒的污染;ZD55-Ki67滴度为4.5×1010PFU/ml;免疫印迹法证实ZD55-Ki67在肿瘤细胞中表达E1A;ZD55-Ki67抑制Ki67表达及肺癌细胞生长的作用显著优于Ad-Ki67。结论ZD55-Ki67能够有效抑制Ki67基因的表达,降低肺癌细胞的增殖能力,为肺癌研究和抗肿瘤基因治疗提供新的策略。

siRNA纳米递送载体研究进展

RNA干扰是一种利用非编码双链RNA(dsRNA)识别和降解靶mRNA从而使特定基因沉默的技术,可应用于包括肿瘤在内的多种疾病的临床前或临床治疗。小分子干扰RNA(siRNA)是一种可以沉默靶基因表达的dsRNA分子,它可以通过人工合成后导入细胞,也可由dsRNA在胞内通过核酸内切酶裂解后生成。然而,裸siRNA不稳定,在体内递送存在着靶向性差、细胞摄取困难、脱靶效应以及在血液循环中易被核酸酶降解等困难,限制了其治疗效率,因此,RNA干扰需要设计合适的载体以帮助siRNA成功递送至细胞并发挥作用。近年来,纳米技术的引入有效促进了siRNA载体递送系统的发展。本文将对RNA干扰的作用机制、纳米载体介导的siRNA递送系统设计过程中所面临的主要挑战以及优化策略进行探讨,并围绕近年来基于有机纳米载体和无机纳米载体介导的siRNA递送系统的研究进展进行综述。

腺病毒介导干扰RNA对荷人骨肉瘤裸鼠VEGF表达的影响

目的:探讨AD-VEGF-siRNA对荷人骨肉瘤裸鼠瘤体组织以及血液中VEGF表达的影响。方法:应用VEGF高表达人骨肉瘤细胞系MG-63制备荷骨肉瘤裸鼠模型;成瘤组动物随机分为3组,AD-VEGF-siRNA组15只;AD-EGFP组15只;PBS组15只。另留取3只裸小鼠,未接种肿瘤细胞,未注射药物。成瘤裸鼠瘤体内分别注射上述各组药物,隔天1次,200μl/次,共5次,病毒总量2×109PFU。接种后第11天、14天、17天实验各组分别处死3只裸小鼠,用ELISA法检测各组荷瘤小鼠血液和瘤体组织中VEGF蛋白表达情况。试验结束(第19天)处死剩余裸小鼠,用RT-PCR及免疫组化技术检测裸小鼠瘤体组织VEGF的表达,用ELISA法检测各组荷瘤小鼠血液和瘤体组织中VEGF蛋白的表达。结果:1)各组裸小鼠约在接种5天成瘤;2)用AD-VEGF-siRNA处理后,RT-PCR检测发现裸小鼠瘤体组织的VEGFmRNA表达水平明显低于两对照组(P<0.05);3)免疫组化检测发现AD-VEGF-siRNA组VEGF蛋白表达明显减少;4)ELISA检测发现成瘤组小鼠血清VEGF蛋白水平明显高于未作任何处理的健康裸小鼠组(P<0.05),在各时间段AD-VEGF-siRNA组血液及瘤体组织中VEGF蛋白的表达水平明显低于两对照组(P<0.05)。结论:AD-VEGF-siRNA在体内可以抑制荷骨肉瘤裸小鼠瘤体VEGF基因的表达及血液中VEGF的水平;应用siRNA腺病毒表达载体技术为骨肉瘤抗血管生成的治疗提供了借鉴。

慢病毒载体在RNA干扰中的应用进展

小分子RNA干扰技术是一种新兴的特异性地阻断某些基因表达的研究手段,在肿瘤、病毒感染,遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体,由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞,容纳大的外源性目的基因片段,免疫反应小等特点,现已成为转移目的基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中,可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。本文将试图对近期慢病毒载体在RNA干扰当中的应用的最新进展进行综述。

构建和鉴定PTEN基因的shRNA重组腺病毒表达载体

目的构建PTEN特异性shRNA重组腺病毒表达载体,为应用基因沉默技术进行缺血性脑损伤的基因治疗奠定基础。方法将前期构建的PTENshRNA特异性真核表达载体pGenesil-1-shRNA的表达启动子U6连同shRNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack,酶切及DNA测序鉴定后,将含PTEN基因的重组穿梭质粒pAdTrack-U6-shRNA经PmeI线性化后转化入pAdEasy-1感受态细菌。pAd-U6-shRNA质粒经PacI线性化后转染293细胞,包装重组腺病毒Ad-U6-shRNA,并进行PCR鉴定、病毒滴度测定及Westernblotting检测受感染海马神经元细胞内PTEN蛋白的表达。结果证实pAdTrack-U6-shRNA及pAd-U6-shRNA质粒构建正确,收获病毒后PCR及DNA测序结果证明Ad-U6-shRNA包被成功,受腺病毒感染海马神经元细胞内PTEN蛋白表达明显降低。结论成功构建了PTEN基因的shRNA重组腺病毒载体Ad-U6-shRNA,为应用基因沉默技术研究PTEN对缺血性脑损伤后的神经保护作用奠定了基础。

慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中.