慢病毒介导RNA干扰抑制RRS1基因表达对胆管癌RBE细胞增殖的影响

研究慢病毒介导RNAi干扰技术抑制RRS1基因在胆管癌RBE细胞表达后对胆管癌RBE细胞增殖产生的影响。方法 运用RT-PCR检测手术切除的胆管癌与癌旁胆管组织标本RRS1 mRNA基因水平的表达。通过慢病毒载体介导RNA干扰技术,从转录水平沉默RRS1基因表达,RT-PCR检测抑制RRS1后在胆管癌mRNA基因水平的表达;体外实验观察抑制RRS1基因后对胆管癌RBE细胞增殖的影响,初步探讨抑制RRS1基因表达后对胆管癌细胞增殖的影响。结果 RT-PCR检测结果发现在胆管癌组织中的RRS1 mRNA基因表达水平较癌旁胆管组织明显升高,RNA干扰抑制RRS1基因在胆管癌RBE细胞中表达后,胆管癌RBE细胞的增殖能力受到了明显下降。结论 (1)胆管癌组织中RRS1基因表达上调。(2)慢病毒RNAi干扰抑制RRS1基因在胆管癌RBE细胞中的表达后,RRS1会促进胆管癌细胞的增殖能力。

HMGB1小干扰RNA对鼻黏膜上皮细胞HMGB1/TLR4信号通路的影响

目的研究采用小干扰RNA(si-RNA)沉默高迁移率族蛋白1(HMGB1)对人鼻黏膜上皮细胞(HNECs)Toll样受体4(TLR4)及其下游信号通路的影响。方法体外培养人鼻黏膜上皮细胞,分为空白对照组、si-HMGB1组、脂多糖(LPS)组和LPS+si-HMGB1组。RT-PCR检测HNECs中HMGB1 mRNA的表达。Western blot检测4组细胞HMGB1、TLR4表达以及通路下游核因子-κB(NF-κB)和白介素1β(IL-1β)的表达水平。观察siRNA干扰HMGB1蛋白表达后鼻黏膜上皮细胞的相应变化。结果RT-PCR结果显示,LPS组细胞中HMGB1的转录水平显著高于空白对照组(P<0.05)。LPS+si-HMGB1组HMGB1的mRNA转录水平显著低于LPS组(P<0.05)。Western blot检测结果显示,LPS+si-HMGB1组的TLR4,HMGB1蛋白表达水平明显低于LPS组,结果具有统计学意义(P<0.05)。LPS+si-HMGB1组细胞的NF-κB以及IL-1β水平明显低于LPS组(P<0.05)。结论鼻黏膜上皮细胞表达HMGB1蛋白,通过siRNA沉默手段可以下调HMGB1的表达。LPS可以激活炎症性的HMGB1,TLR4,通路下游信号NF-κB及IL-1β。siRNA可以下调HMGB1蛋白表达水平,进而抑制TLR4-NF-κB以及IL-1β信号传导通路。

创面siRNA敲降HO-1改善小鼠放创复合伤创面愈合的实验研究

目的检测血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)在放创复合伤(radiation-wound combined injury,R-W-CI)创面修复中的表达情况,评价通过siRNA敲降HO-1对放创复合伤创面愈合的改善作用。方法将36只8周龄雄性C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为单纯皮肤创伤组(W组,n=18)和合并全身辐射(6 Gy)损伤的皮肤创伤组(R-W-CI组,n=18),建立单纯皮肤创伤与放创复合伤的小鼠模型。在创面愈合过程中,拍照记录创面愈合情况并通过Image J量化分析残留面积;取材创面组织进行HE染色及病理组织学观察;动态检测外周血象评估造血系统损伤情况。通过创面组织定量PCR及Western blot检测创面HO-1表达水平及变化情况。将26只8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为siRNA敲降HO-1组(si-HO-1组,n=13)和siRNA阴性对照组(si-NC组,n=13)。放创复合伤致伤后,si-HO-1组在每个创面涂抹负载si-HO-1(5μmol/L)的F127凝胶60μL,si-NC组创面涂抹等量负载阴性对照si-NC的F127凝胶。通过创面组织Western blot检测HO-1的敲降情况,观察创面面积变化,对伤后第3天样本进行定量PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达变化,组织切片进行Ki67免疫组织化学和HE染色;对第9天创面组织进行HE染色病理评估;综合评价敲降HO-1对放创复合伤创面愈合的改善作用。结果与W组相比,创面残留面积的半定量分析表明R-W-CI组愈合在伤后第7、10天显著延迟(P<0.01);第7天的HE病理显示R-W-CI组再上皮化延缓,肉芽组织生长不良;同时R-W-CI组外周血白细胞及其分类计数显示在损伤后早期即显著下降(P<0.05)。检测发现,R-W-CI组创面HO-1蛋白在伤后第3、7天表达略高于W组,但无显著差异(P>0.05),而在第10天显著升高(P<0.05),同时伴有全长与截短形式的分布改变;定量PCR显示R-W-CI组在伤后第7天、10天的创面组织HO-1的表达显著高于W组(P<0.05)。放创复合伤创面siRNA干预实验显示:与si-NC组比较,si-HO-1组能有效敲降创面HO-1蛋白含量(P<0.05),促进伤口收缩(P<0.05),减小创面宽度(P<0.01),上调致伤第3天创面IL-6、TNF-α等炎症因子表达,促进创缘组织细胞增殖,改善肉芽组织生长情况。结论放创复合伤创面修复过程中存在HO-1蛋白的持续高表达,创面siRNA敲降HO-1可以改善R-W-CI组小鼠创面乏炎状态,促进创面愈合。

表达PD-1 shRNA增强靶向CD19 CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力

目的:设计和构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞并验证其体外肿瘤细胞杀伤能力。方法:设计并构建表达PD-1 shRNA的CD19 CAR分子基因,将其包装成逆转录病毒载体,通过qPCR法检测病毒载体拷贝数。将慢病毒转导人原代T细胞,获得三种CAR-T细胞,分别为RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞。采用qPCR法检测三种CAR-T细胞中PD-1 mRNA的表达水平,流式细胞术检测三种CAR-T细胞中PD-1表达水平,萤光素酶报告基因实验、流式细胞术检测在不同效靶比时CAR-T细胞对CD19阳性靶细胞(人淋巴瘤daudi细胞)的杀伤功能。结果:RNAU6-CD19 CAR、PD-1 shRNA1-CD19 CAR、PD-1 shRNA2-CD19 CAR三种CAR分子成功包装成逆转录病毒载体,病毒载体拷贝数均高于1×10^(7)拷贝/mL,转导人原代T细胞获得CAR-T细胞,RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞转导效率分别为43.1%、55.1%、41.7%。与RNAU6-CD19 CAR-T细胞相比,PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞中PD-1 mRNA表达水平均显著降低(均P<0.01)、细胞表面PD-1表达水平更低(均P<0.01)、体外对daudi细胞的杀伤率更高(P<0.05或P<0.01)。结论:成功构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞,其对CD19阳性靶细胞的杀伤率显著提高,PD-1 mRNA及其翻译产物PD-1的表达减少,CAR-T细胞的耗竭减缓。

RNA干扰PhCatC 1/2基因对波纹龙虾相关免疫基因表达的影响

初步研究RNA干扰PhCatC 1/2基因对波纹龙虾(Panulirus homarus)相关免疫基因表达的影响,采用qPCR技术检测PhCatC 1/2、PhTlr 13、PhLys和Phβ-G基因的表达,并观察肝胰腺组织的变化情况。结果表明:注射PhCatC 1-dsRNA后,PhCatC2表达量比对照组显著下降(P<0.05),与对照组相比PhTlr 13基因表达量在前期呈现显著升高,后下降的趋势,PhLys和Phβ-G基因的表达量均随dsRNA干扰时效的增加而增加;沉默PhCatC 2基因后PhTlr 13和Phβ-G基因的表达量随dsRNA干扰时效的增加而增加,PhCatC 1基因表达量呈现下上调交替的趋势,PhLys基因表达量表现出先下调后上调的趋势。通过PhCatC 1/2基因沉默后的分析初步推测,波纹龙虾可能通过促进Toll样受体和溶酶体通路来参与免疫应答,得出PhCatC 1/2基因具有免疫功能。

lncRNA NEAT1在鼻咽癌中的表达情况及其对鼻咽癌放疗敏感性的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)核旁斑富集转录本1(NEAT1)在鼻咽癌中的表达情况及其对鼻咽癌放疗敏感性的影响。方法(1)使用UALCAN数据库分析NEAT1在头颈部鳞状细胞癌中的表达情况及其与患者临床分期、预后的关系。(2)利用实时荧光定量PCR检测鼻咽癌组织及正常鼻咽黏膜上皮、人永生化鼻咽上皮细胞NP-69及多株鼻咽癌细胞(CNE-1、CNE-2、CNE-2R、C666-1、C666-1R)中NEAT1的表达情况。(3)使用RNA干扰技术构建NEAT1沉默的CNE-2R细胞[NEAT1-短发夹RNA(shRNA)组],并设立对照组(未转染的CNE-2R细胞)、NEAT1-NC组(转染对照序列的CNE-2R细胞)。给予不同放射剂量X线照射后,检测3组CNE-2R细胞的存活率、凋亡率、克隆形成率及放射生物学参数。结果(1)NEAT1在头颈部鳞状细胞癌组织中呈高表达,且表达水平随着头颈部鳞状细胞癌分期的增加呈升高趋势(P<0.05),但不同NEAT1表达水平患者的总生存率差异无统计学意义(P>0.05)。(2)相较于正常鼻咽黏膜上皮组织,鼻咽癌组织中NEAT1表达上调(P<0.05)。相较于NP-69细胞,NEAT1在鼻咽癌细胞中的表达上调(P<0.05),其中CNE-2R细胞中的表达量最高(P<0.05);放射抗拒性细胞CNE-2R、C666-1R中NEAT1的表达量分别高于放疗敏感性细胞CNE-2、C666-1(P<0.05)。(3)在接受不同剂量X射线照射后,与对照组及NEAT1-NC组比较,NEAT1-shRNA组CNE-2R细胞存活率、克隆形成率及放射生物学参数降低,凋亡率升高(P<0.05),但对照组与NEAT1-NC组上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论lncRNA NEAT1在鼻咽癌组织和细胞中呈高表达,与肿瘤分期密切相关,沉默NEAT1的表达可增加鼻咽癌的放疗敏感性。

靶向抗HSV-1的siRNA研究进展

单纯疱疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)是一种能够在各类人群中携带和传播并能引起包括口唇疱疹、荚膜炎、角膜炎和病毒性脑炎等疾病的重要病原体。虽然已有多种类型的HSV-1疫苗处于研发的不同阶段,但仍没有商业化的疫苗上市销售。临床上使用的特异性抗HSV-1药物如阿昔洛韦、伐昔洛韦和喷昔洛韦等也面临严重的抗药性威胁,开发新的特异性抗HSV-1药物是当前所面临的主要任务之一。siRNA是一种长度为20~25核苷酸的双链RNA,通过在转录后水平上沉默基因表达发挥干扰作用。siRNA作为一种新的、有潜力的抗病毒药物备受关注,发展也较为迅速。综述近年来siRNA在抗HSV-1方面的研究进展,包括靶向HSV-1关键基因和HSV-1互作的宿主细胞基因的siRNA设计、递送和靶向策略。

溃疡性结肠炎患者血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1表达水平及与预后相关性研究

目的探讨长链非编码RNA心肌梗死相关转录本2(long non-coding RNA myocardial infarction-related transcript 2,LncRNA Mirt2)、长链非编码RNA干扰素γ-反义RNA1(long non-coding RNA interferonγ-antisense RNA 1,LncRNA IFNG-AS1)在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)患者血清中表达情况及与UC患者预后相关性。方法选择2018年12月~2021年1月南京市浦口区中医院(南京市中医院浦口分院)收治的193例UC患者作为观察对象,其中缓解期85例,活动期108例。根据患者预后情况分为复发组(n=78)和未复发组(n=115),另选取同期190例健康体检者作为对照组。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1表达水平,Pearson法分析UC患者血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1表达水平相关性及LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1与C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)、白细胞介素-6(interleukin-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的相关性;ROC曲线分析血清LncRNA Mirt2和LncRNA IFNG-AS1对复发UC的诊断价值。结果与对照组比较,缓解期组与活动期组UC患者血清LncRNA Mirt2(0.92±0.10,0.71±0.08vs 1.07±0.12)表达水平降低,LncRNA IFNG-AS1(1.63±0.25,2.27±0.42 vs 1.01±0.14)表达水平及CRP(13.42±4.71mg/L,25.38±6.29 mg/L vs 4.32±1.27 mg/L),IL-6(8.31±2.35pg/ml,16.55±4.52 pg/mlvs 2.87±0.78 pg/ml),TNF-α(15.38±4.29 pg/ml,28.94±6.37 pg/ml vs 8.42±1.63 pg/ml)水平升高,差异具有统计学意义(t=10.064~44.632,均P<0.001);与缓解期组相比,活动期组UC患者血清LncRNA Mirt2表达水平降低,LncRNA IFNG-AS1表达水平及CRP,IL-6,TNF-α水平升高,差异具有统计学意义(t=12.420~16.844,均P<0.001);与轻度组比较,中、重度组UC患者血清LncRNA Mirt2(0.69±0.08,0.58±0.05 vs 0.81±0.06)表达水平降低,LncRNA IFNG-AS1(2.25±0.48,2.83±0.25 vs 1.90±0.31)表达水平升高,差异有统计意义(t=3.890~17.225,均P<0.001);与中度组比较,重度组UC患者血清LncRNA Mirt2表达水平降低,LncRNA IFNG-AS1表达水平升高,差异具有统计学意义(t=6.184,5.957,均P<0.001)。相关性分析显示,UC患者血清LncRNA Mirt2表达水平与CRP,IL-6和TNF-α呈负相关(r=-0.623,-0.605,-0.571,均P<0.001),LncRNA IFNG-AS1表达水平与CRP,IL-6和TNF-α呈正相关(r=0.457,0.531,0.497,均P<0.001)。与未复发组比较,复发组UC患者血清LncRNA Mirt2(0.70±0.08 vs 0.87±0.11)表达水平显著降低,LncRNA IFNG-AS1(2.38±0.41 vs 1.72±0.28)表达水平显著升高(t=11.706,13.294,均P<0.001);血清LncRNA Mirt2,LncRNA IFNG-AS1联合诊断复发UC的曲线下面积为0.931(95%CI:0.886~0.963),敏感度和特异度分别为87.18%,86.96%;阳性预测值、阴性预测值和准确度分别为81.93%,90.91%和87.05%。结论UC患者血清LncRNA Mirt2表达水平降低、LncRNA IFNG-AS1表达水平升高,与炎症水平和患者预后有关,可作为反映UC患者病情与预后的标志物。

RNA干扰ABCE1基因后可抑制肺癌95-D/NCI-H446细胞的增殖和诱导细胞凋亡(英文)

ABCE1作为RNase L抑制剂首先是在脊椎动物中被发现的.前期研究结果显示ABCE1与肺腺癌的发生率及临床分期显著相关.为了进一步研究ABCE1的新功能,构建了ABCE1基因的siRNA表达质粒(RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express vector),培养肺癌细胞(95-D和NCI-H446),用FuGENE6作为转染试剂转染后,使用荧光显微镜观察转染效果,RT-PCR分析ABCE1基因表达,Westernblot分析ABCE1蛋白的表达,MTT法检测细胞的活性,流式细胞仪分析细胞周期,ELISA法检测细胞凋亡.结果显示:质粒的转染效果较满意,阳性率约为42.70%;在实验组,细胞活性和生长指数明显受到抑制,细胞凋亡明显增加,与对照组比较差异显著(P<0.05).上述结果显示,RNA干扰ABCE1基因可显著抑制肺癌细胞(95-D/NCI-H446)RNA的转录、蛋白质的表达,并增加细胞凋亡,为进一步研究ABCE1基因提供必要的基础.

RNA干扰Fascin1表达抑制胶质瘤细胞U87MG的侵袭、转移能力

目的:本研究运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异性抑制肌动蛋白结合的细胞骨架蛋白Fascin1的表达,并探讨其对胶质瘤细胞U87 MG的侵袭和转移能力的影响及相关分子机制。方法:将针对Fascin1的小干扰RNA(Fascin1-si RNA)和阴性对照si RNA(Negative-si RNA)转染至人胶质瘤细胞株U87 MG中。实验分为3组:空白对照组(未转染的细胞)、阴性对照组(转染neg-si RNA的细胞)、实验组(转染Fascin1-si RNA的细胞)。用transwell小室法检测Fascin1对U87MG细胞的侵袭和转移能力的影响,蛋白印迹法(Western blot)检测U87 MG细胞中Fascin1、p AKT及p STAT3等蛋白的表达。通过添加针对PI3K通路的抑制剂LY294002和针对STAT3通路的抑制剂JSI-124,证实了这两条信号通路在胶质瘤细胞U87MG侵袭、转移方面的作用。结果:相比空白对照组和阴性对照组,实验组细胞的转移能力降低了约(49±5.8)%及(46±5.4)%(P<0.05),侵袭能力降低了约(42±4.9)%和(43±4.8)%(P<0.05);且相关的PI3K/AKT及STAT3等信号通路的磷酸化减少;添加相应的信号通路抑制剂后,细胞的侵袭、转移能力显著降低(P<0.05)。结论:RNAi抑制Fascin1表达能够降低胶质瘤细胞U87 MG的侵袭及转移能力,并可抑制PI3K/AKT和STAT3信号激活,在一定程度上可逆转胶质瘤细胞的转移和侵袭等肿瘤特性。

RNA干扰沉默HDAC1基因对胃癌细胞增殖、凋亡、组蛋白乙酰化和甲基化的影响

目的探讨RNA干扰沉默HDAC1基因对人类胃癌MGC803细胞增殖、凋亡及组蛋白乙酰化水平的影响。方法设计针对HDAC1基因小干扰RNA片段,经脂质体转染入MGC803细胞,RT-PCR及Western blot鉴定其干扰效果;MTT法绘制细胞生长曲线,TUNEL分析细胞调亡,Western blot检测组蛋白H3、H4乙酰化、组蛋白H3K9甲基化的影响及凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-9、pro-caspase-3、C-myc蛋白表达。结果 HDAC1 siRNA转染MGC803细胞后,HDAC1基因的mRNA、蛋白表达均明显下降,有统计学意义(P<0.05);60、120、240 nmol/L HDAC1 siRNA处理24 h后,细胞凋亡率分别为(18.5±3.5)%、(41.4±4.3)%、(59.2±5.5)%,而对照组仅为(4.8±2.7)%,有统计学意义(P<0.05);同时下调Bcl-2、proCaspase-9、proCaspase-3、c-Myc的表达;上调细胞周期蛋白P21的表达;干扰HDAC1基因可上调组蛋白H3,H4乙酰化水平,下调H3K9甲基化水平。结论干扰HDAC1基因表达后可能通过上调与基因转录激活有关的组蛋白H3、H4乙酰化水平,下调与基因转录抑制有关H3K9甲基化水平,从而抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡。

RNA干扰ERCC1基因表达对肺腺癌细胞A549/DDP顺铂耐药的影响

背景与目的核苷酸切除修复机制可修复顺铂(DDP)造成的DNA损伤,作为其中的关键酶之一,切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene1,ERCC1)的表达可能与DDP耐药有关。本研究旨在探讨小干扰RNA沉默ERCC1基因表达对肺腺癌耐药细胞A549/DDP药物敏感性的影响。方法将体外设计合成针对ERCC1的小分子RNA(siRNA)转染A549/DDP细胞,RT-PCR检测ERCC1 mRNA水平;Western blot检测ERCC1蛋白表达的变化;MTT检测RNA干扰后细胞药物敏感性改变。结果 ERCC1 RNAi干扰后ERCC1 mRNA表达指数降低,明显低于对照组,干扰后ERCC1 mRNA表达抑制率为90.4%。转染ERCC1 siRNA降低了ERCC1蛋白的表达水平。MTT显示分别用2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL顺铂处理细胞48h,转染ERCC1 siRNA细胞组较对照组敏感性明显增高,干扰前A549/DDP细胞IC50为12.49μg/mL,干扰后A549/DDP细胞IC50下降为9.27μg/mL。结论 ERCC1 siRNA干扰可以降低ERCC1的表达水平,并可提高A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

RNA干扰Notch1基因对乳腺癌MCF-7细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨RNA干扰技术沉默Notch1基因表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成靶向Notch1基因的小分子干扰RNA质粒,在转染试剂Sofast介导下转染人乳腺癌细胞株MCF-7,用RT-PCR和Western blot法检测转染前、后Notch1基因的表达,挑选干扰效率最强的一组表达载体;cck8比色法检测分析各组细胞的存活率;流式细胞术检测细胞凋亡比例;Western blot法检测转染各组MCF-7细胞Notch1、NF-κB及Caspase-3蛋白表达。结果 Notch1-shRNA能有效封闭Notch1基因的表达,Notch1基因和蛋白表达水平明显降低(P<0.05);Notch1-shRNA能明显抑制细胞增殖(P<0.05);转染48h后细胞凋亡比例增加(P<0.01)。NF-κB蛋白水平表达降低,Caspase-3蛋白表达水平增高。结论利用RNA干扰技术沉默Notch1基因的表达可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,促进MCF-7细胞凋亡,其机制可能通过NF-κB信号通路调节相关凋亡蛋白的表达,进而影响细胞的凋亡和增殖,靶向Notch1的RNA干扰技术在乳腺癌的基因治疗中具有一定的研究价值。

RNA干扰抑制HMGB1基因表达对肺癌细胞L9981增殖和侵袭的影响

背景与目的研究小干扰RNA抑制高迁移族蛋白B1基因表达对肺癌细胞L9981增值和侵袭能力的影响。方法设计合成靶向HMGB1基因的siRNA,采用阳离子脂质体试剂瞬时转染肺癌细胞株L9981,利用实时荧光定量PCR和Western blot检测RNA干扰后HMGB1基因的沉默效果,评价siRNA设计的合理性及RNA干扰抑制HMGB1表达的有效性;用细胞活力计数仪测定3组细胞活力;分别在RNA干扰后24、48、72和96小时应用MTT实验检测细胞生存状态,计算生长抑制率并绘制生长曲线;应用boyden chamber法检测侵袭能力的差异。结果靶向HMGB1的siRNA成功抑制肺癌细胞株L9981中HMGB1基因及蛋白表达,细胞活力检测仪测定RNA干扰48小时后,细胞活力显著下降;MTT测定肺癌细胞生长受到明显抑制;boyden chamber小室细胞侵袭实验结果肺癌穿膜细胞数明显减少。结论应用siRNA技术能有效的抑制HMGB1基因的表达,同时有效抑制L9981细胞的体外增值和侵袭,为肺癌的生物学治疗提供了新思路。

RNA干扰ABCE1基因后可增加肺癌95-D/NCI-H446细胞的E-钙黏附蛋白表达并减低细胞侵袭力(英文)

研究ABCE1对肺癌(95-D和NCI-H446)细胞的作用.使用RNA干扰技术,抑制ABCE1基因的表达,通过Western blot分析及FACS检测,观察ABCE1基因对E-钙黏附蛋白在95-D/NCI-H446细胞表达的影响;运用transwell侵袭实验,观察M95-D/NCI-H446细胞侵袭力的变化.RNA干扰ABCE1基因后,实验组与对照组相比,在48h后可显著抑制肺癌(95-D和NCI-H446)细胞ABCE1蛋白的表达,同时,伴随E-钙黏附蛋白的高表达,以及细胞侵袭力的降低.ABCE1基因与E-钙黏附蛋白相关,抑制ABCE1基因可增加肺癌95-D/NCI-H446细胞的E-钙黏附蛋白的表达,减低细胞的侵袭力。

慢病毒介导LOX-1基因RNA干扰抑制氧化应激诱导心肌细胞凋亡

目的构建大鼠凝集素养氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1)RNA干扰慢病毒表达载体并观察LOX-1在氧化应激诱导心肌细胞凋亡中的作用。方法设计针对大鼠LOX-1的shRNA序列,将shRNA序列插入到pLentiLox3.7(pLL3.7)慢病毒载体中,构建慢病毒载体pLL3.7-LOXl。慢病毒载体及包装载体dR8.9、VSVG共转染293FT细胞包装慢病毒。慢病毒侵染H9C2大鼠心肌细胞,RT-PCR鉴定对LOX-1抑制效率,CCK-8、Hochest33258染色检测LOX-1对H_2O_2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果通过双酶切鉴定,证实shRNA正确插入慢病毒载体,DNA测序证实插入的序列正确,抑制LOX-1能抑制H_2O_2诱导的细胞活力下降,减轻H_2O_2诱导的心肌细胞凋亡,与H_2O_2组比较均有统计学意义(P<0.01)。结论成功构建靶向大鼠LOX-1基因RNAi慢病毒载体,LOX-1激活可能在H_2O_2诱导心肌细胞凋亡中发挥重要作用。

小干扰RNA抑制LRP16基因表达限制了MCF-7乳腺癌细胞增殖

雌激素雌二醇上调人乳腺癌细胞MCF 7中LRP16基因表达 ,该基因过表达促进MCF 7细胞增殖 .为进一步探讨LRP16基因不同表达水平对MCF 7细胞增殖的影响以及对雌激素的反应性增殖能力 ,采用针对LRP16基因特异的小干扰RNA策略 ,通过逆转录病毒介导及抗性筛选构建了LRP16基因被稳定抑制的 2个MCF 7细胞系 ,针对绿色荧光蛋白的干扰序列作为阴性对照 .Northern印迹实验检测了LRP16基因在各个细胞株中mNRA的水平 ,与对照组细胞比较 ,针对LRP16基因不同位置的 2个小干扰RNA可分别将该基因抑制 90 %和 6 0 % .细胞增殖试验结果显示 ,MCF 7细胞中LRP16基因表达抑制率越高 ,细胞增殖速率减慢越显著 (P <0 0 5 ) ;软琼脂集落形成试验结果显示 ,抑制LRP16基因在MCF 7细胞中表达 ,限制了细胞锚定非依赖性生长 ;细胞周期分析结果表明 ,LRP16基因抑表达使MCF 7细胞G1 S周期转换受抑 ;Western印迹结果表明 ,LRP16基因表达抑制的细胞中细胞周期蛋白E及细胞周期蛋白D1蛋白水平显著下调 ,但未检测到P5 3及Rb蛋白表达水平的影响 .雌二醇刺激的增殖实验结果显示 ,抑制LRP16基因表达没有消除MCF 7细胞的反应性增殖特征 .上述结果表明 ,LRP16基因表达量与MCF 7细胞增殖能力密切相关 ,抑制其表达可有效限制MCF 7细胞的增殖能力 ,提?

RNA干扰组蛋白去乙酰化酶1对人胰腺癌细胞增殖、凋亡的调控机制研究

目的观察沉默组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因对人胰腺癌PaTu8988细胞增殖、凋亡的影响及可能机制。方法胰腺癌PaTu8988细胞株分为空白对照组(不予任何处理)、阴性对照siRNA组(予以30nmol/L阴性siRNA)、siRNA1组(予以15nmol/LHDAC1siRNA)和siRNA2组(予以30nmol/LHDAC1siRNA)。siRNA转染48h后,用相对实时定量RT-PCR法和West-ernblotting检测HDAC1基因表达情况;相对实时定量RT-PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因p21、Bcl-2、Bax的表达;WST-8法检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡变化。结果转染HDAC1siRNA48h后人胰腺癌PaTu8988细胞中HDAC1mRNA表达量在siRNA1组和siRNA2组分别为46.1%±6.1%和32.3%±1.4%,均显著低于空白对照组(100.0%±3.4%)和阴性对照siRNA组(87.4%±28.3%,P<0.05)。Westernblotting显示HDAC1蛋白表达量亦明显下降,以siRNA2组表达量最低(P<0.05)。WST-8法检测显示4组细胞存活率分别为100%±17.1%、87.1%±5.0%、68.7%±4.7%、61.6%±2.0%,siRNA1组和siRNA2组与其他各组相比差异显著(P<0.05)。流式细胞术检测显示上述4组胰腺癌细胞凋亡率分别为4.20%±0.95%,4.59%±1.26%,10.09%±1.36%,11.19%±6.07%,与空白对照组和阴性对照siRNA组相比,siRNA1组和siRNA2组凋亡率显著增高(P<0.05)。siRNA1组和siRNA2组p21、BaxmRNA相对表达量明显高于其他各组(P<0.05),而Bcl-2mRNA相对表达量明显低于其他各组(P<0.05)。结论HDAClsiRNA能特异、有效地抑制人胰腺癌PaTu8988细胞HDACl的表达,同时抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡,其机制可能与上调p21、Bax表达,下调Bcl-2表达有关。

DPF2基因RNA干扰对人胰腺癌细胞PANC-1增殖、凋亡和细胞周期的作用研究

目的已知DPF2参与白血病以及肿瘤的发生,但是DPF2是否参与胰腺癌发生和进展还不清楚,因此观察了DPF2基因RNA干扰对胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法采用慢病毒介导的DPF2基因RNA干扰敲低PANC-1细胞的DPF2表达,通过克隆形成实验和MTT实验检测DPF2基因RNA干扰对PANC-1细胞增殖的作用,通过流式细胞术检测DPF2基因RNA干扰对PANC-1细胞凋亡和细胞周期的作用。结果慢病毒介导的DPF2基因RNA干扰中剂量和高剂量(2μL和4μL)使PANC-1细胞的DPF2表达明显降低。与阴性对照组比较,DPF2基因RNA干扰明显抑制PANC-1细胞活力和克隆形成,还促进PANC-1的凋亡。此外,DPF2基因RNA干扰引起细胞周期的S期阻滞,明显减少G2/M周期的细胞数量。结论 DPF2可能参与胰腺癌细胞PANC-1的增殖、凋亡过程和细胞周期的调控,通过慢病毒介导的DPF2基因RNA干扰敲低DPF2蛋白表达,可能为寻找潜在的抗胰腺癌的新方法提供实验依据。

RNA干扰HIF-1α对食管癌细胞糖酵解相关基因表达的影响

目的:探讨常氧及缺氧培养对RNA干扰的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及糖酵解相关基因表达的影响。方法:选择3组细胞分别为食管鳞癌Eca-109细胞稳定转染HIF-1α siRNA及空质粒的Eca-109细胞,予以常氧和缺氧培养,缺氧培养时间分别为6、12、24、48h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白表达,Western blot和RT-PCR检测3组细胞常氧和缺氧条件下糖酵解相关基因(Glut-1、LDH-A、HK-Ⅱ)的表达,分光光度法分别测定3组细胞常氧和缺氧培养下胞液中乳酸脱氢酶(LDH)、己糖激酶(HK)酶活性。结果:Eca-109细胞缺氧条件下培养,HIF-1α蛋白表达较常氧时增高,干扰细胞常氧下HIF-1α几乎无表达,缺氧后亦无增强。常氧和缺氧条件下,干扰细胞Glut-1、LDH-A、HK-Ⅱ mRNA和蛋白表达较未干扰细胞明显减弱(P<0.05),干扰细胞胞液LDH、HK活性较未干扰细胞明显减少(P<0.05)。结论:RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达,进而不同程度减少Glut-1、LDH-A、HK-Ⅱ糖酵解相关基因的表达。