慢病毒介导的RNA干扰鉴定RIG-Ⅰ、MDA-5和TLR3在猪上皮细胞识别RNA病毒中的作用

病原体识别受体是宿主抗病毒免疫反应所必需的,这些特异的受体能识别保守的病毒化合物并诱导Ⅰ型干扰素(IFN)和促炎细胞因子。本试验在猪细胞系PK-15中研究了RIG-Ⅰ、MDA-5和TLR3在IFN-β对古典猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、水泡性口炎病毒(VSV)和A型流感病毒(IAV)的识别中的作用。本研究鉴定了猪基因特异性小干扰RNA序列,并用慢病毒(LV)系统来表达相应的短发夹RNA,构建了基因表达下调细胞系,并检测基因表达下调水平与时间和IFN-β刺激的相关性。试验细胞经多次传代,报告基因eGFP的表达和目的基因的RNA减少水平都是稳定的,而后者相对变化较大。IFN-β诱导干扰素应答基因(如RIG-Ⅰ)表达,但其水平在试验细胞系中仍低于对照细胞。病毒介导的IFN-βmRNA反应结果表明,在PK-15细胞中,口蹄疫病毒的识别完全是由MDA-5介导的,而VSV和IAV主要由RIG-Ⅰ检测到,MDA-5也起到一定作用,CSFV是通过MDA-5,RIG-Ⅰ和TLR3识别。

在结肠癌细胞中RNA干扰TGFBR2慢病毒载体的构建及其功能的初步研究

目的:构建TGFBR2基因的RNA干扰慢病毒载体,为研究该基因在结肠癌细胞中的作用奠定基础。方法:合成TGFBR2基因特异性RNAi靶序列,与pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体连接,构建干扰载体并鉴定。与TGFBR2质粒共转染HEK293细胞,qRT-PCR和Western blot方法筛选最佳干扰序列,感染SW480细胞。10ng/ml TGF-β1和20ng/ml TNF-a共作用TGFBR2干扰后的SW480细胞和未干扰组细胞72h后,通过细胞侵袭试验计算细胞侵袭数目。结果:成功构建TGFBR2的RNA干扰载体,第4组序列效果最佳,感染SW480后,TGFBR2基因的mRNA表达抑制率为78.45%。TNF-a和TGF-β1处理干扰前后的SW480细胞,通过细胞侵袭试验显示各组细胞迁移的数目:干扰组为89.3±7.9,未干扰组为15.1±8.2,干扰组细胞明显多于对照组(P<0.01)。结论:成功构建人TGFBR2基因特异性的慢病毒干扰载体,并建立稳定的细胞株,为预防和干预结肠癌的早期转移奠定基础。初步提示在TGF-β1和TNF-a因子存在的炎症微环境中,TGFBR2基因突变的结肠癌细胞更具有侵袭性。

慢病毒RNA干扰GRP78对肾癌细胞生物学行为的影响研究

目的:探讨慢病毒RNA干扰GRP78蛋白后对肾癌细胞生物学行为的影响。方法:构建慢病毒靶向siRNA-GRP78干扰载体进入肾癌细胞株。转染48h后使用Realtime-PCR和Western bloting检测GRP78基因和蛋白表达,MTT法和transwell法分别检测肾癌细胞增殖和侵袭力。结果:转染48h后,Realtime-PCR和Western bloting检测证实siRNA1抑制GRP78基因和蛋白效率最佳。SiRNA1-GRP78可抑制肾癌细胞增殖和降低细胞侵袭力,促进细胞凋亡,阻滞细胞于G1期。结论:慢病毒RNA干扰可有效抑制肾癌细胞中GRP78基因和蛋白表达,GRP78表达下调影响肾癌细胞增殖和降低细胞侵袭力,诱导细胞凋亡,阻滞细胞于G1周期。GRP78可能成为肾癌治疗新靶点。

干扰HSF2对THP-1细胞NLRP3炎症复合体的影响

目的:通过慢病毒-热休克转录因子2-RNA干扰(lentivirus-heat shock transcription factor2-RNA interference,LV-HSF2-RNAi)人巨噬细胞系(THP-1),探讨HSF2对THP-1细胞NOD样受体3(NOD-like receptor family,pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症复合体及其下游白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的影响.方法:选用THP-1作为研究对象,使用慢病毒(LV-HSF2-RN Ai)转染THP-1,干扰其HSF2表达,使用佛波醋(phorbol 12-myristate13-acetate,PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞;将细胞分为对照组与转染组,使用脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)刺激细胞凝胶电泳PCR检测细胞NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CADR domain,ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(cysteine-requiring aspartate protease-1,Caspasel)、IL-1βmRNA表达:蛋白质免疫印迹实验(Western blot)检测细胞NLRP3、ASC、Caspasel、IL-1β蛋白表达:酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞培养基内IL-1β水平.结果:Western blot检测HSF2干扰组中HSF2蛋白表达明显低于未转染组和阴性对照组(P<0.05);PMA诱导THP-1细胞分化,LPS刺激后,干扰组NLRP3、ASC、Caspasel、IL-1βmRNA及蛋白表达水平明显高于对照组及干扰对照组(P<0.05);HSF2干扰组IL-1β表达水平明显高于未转染组及阴性对照组(538.800 pg/mL±52.250 pg/mL vs 257.010pg/mL±26.148 pg/mL,238.231 pg/mL±29.245 pg/mL,P<0.05).结论:干扰HSF2可以明显提高THP-1细胞NLRP3炎症复合体活化水平,提高IL-1β水平.

靶向沉默Eps8基因对人慢性髓系白血病K562细胞生物学活性的影响及其分子机制的探讨

目的:探索靶向沉默Eps8(表皮生长因子受体通路底物8)基因对人慢性髓系白血病K562细胞生物学活性的影响及其可能的分子机制。方法:采用慢病毒介导RNA干扰技术靶向沉默K562细胞中Eps8基因。实验分组为:空白对照(blank control)组、Eps8-shRNA靶向沉默(K562-shRNA)组和阴性对照(K562-NC)组。在荧光显微镜下观察转染效率;应用RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA转录水平和蛋白水平验证Eps8基因沉默效率;台盼蓝拒染法和MTT法检测细胞体外增殖能力变化;流式细胞术检测细胞凋亡率变化;甲基纤维素克隆形成实验验证细胞集落形成能力;Western blot法检测沉默Eps8基因后AKT/mTOR及其下游信号通路磷酸化蛋白的表达情况。结果:成功建立稳定低表达Eps8的K562细胞株(K562-shRNA)和阴性对照细胞株(K562-NC)。与空白对照组和K562-NC组相比,沉默Eps8基因后K562-shRNA组细胞Eps8转录和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);体外培养48 h后,K562-shRNA组细胞增殖能力明显下降(P<0.05);K562-shRNA组细胞凋亡率为(5.81±0.39)%,空白对照组和K562-NC组细胞凋亡率分别为(1.02±0.70)%和(1.19±0.15)%,提示K562-shRNA组细胞凋亡率与空白对照组和K562-NC组之间有显著性差异(P<0.05),而空白对照组和K562-NC组之间没有显著性差异(P>0.05);体外甲基纤维素半固体培养10 d后,K562-shRNA组细胞集落形成能力与空白对照组和K562-NC组相比有显著性差异(P<0.05)。沉默Eps8基因可下调K562细胞p-AKT(308)和p-AKT(473)的表达(P<0.05),而t-AKT表达水平没有明显变化。另外,沉默Eps8基因可下调AKT下游的pmTOR和p-PRAS40蛋白的表达(P<0.05),而总mTOR和总PRAS40的表达水平没有明显变化。结论:利用慢病毒介导的RNA干扰技术靶向沉默Eps8基因能够抑制K562细胞增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与AKT/mTOR及其下游信号通路下调有关。

PRDM14在胰腺癌组织中的表达及对肿瘤干细胞迁移的影响

目的探讨正性调节区锌指蛋白14(PRDM14)在胰腺癌组织中的表达及对肿瘤干细胞迁移的影响。方法50只裸鼠被随机分为胰腺癌Ⅰ组、胰腺癌Ⅱ组、胰腺癌Ⅲ组、胰腺炎组和对照组,每组10只。胰腺癌Ⅰ组建立人胰腺癌细胞株SW1990原位植瘤模型,胰腺癌Ⅱ组建立PRDM14-shRNA慢病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990原位植瘤模型,胰腺癌Ⅲ组建立control病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990原位植瘤模型,胰腺炎组采用腹腔注射雨蛙素和脂多糖建立慢性胰腺炎模型,对照组腹腔注射生理盐水。造模完成后8周,采集小鼠胰腺,免疫组化检测胰腺组织PRDM1表达,划痕实验检测人胰腺癌细胞株SW1990(胰腺癌Ⅰ组)、PRDM14-shRNA慢病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990(胰腺癌Ⅱ组)和control病毒干扰的人胰腺癌细胞株SW1990(胰腺癌Ⅲ组)的迁移能力。结果免疫组化结果显示,胰腺癌组小鼠PRDM14阳性表达率明显高于对照组(均P<0.05);胰腺癌Ⅰ组和胰腺癌Ⅲ组小鼠PRDM14阳性表达率明显高于胰腺炎组小鼠(均P<0.05),胰腺癌Ⅰ组和胰腺癌Ⅲ组PRDM14阳性表达率及PRDM14表达量均明显高于胰腺癌Ⅱ组,组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)。划痕实验结果显示,胰腺癌Ⅰ组和胰腺癌Ⅲ组肿瘤干细胞迁移能力明显高于胰腺癌Ⅱ组。结论PRDM14在胰腺癌组织中呈高表达,可能与胰腺癌的发生、侵袭和转移存在紧密关系,有待进一步研究证实。

HIF-1α基因沉默对人胰腺癌Patu8988细胞增殖和细胞周期的影响

目的:观察沉默HIF-1α基因对人胰腺癌Patu8988细胞增殖和细胞周期的影响。方法:构建针对乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体LV-RNAi-HIF-1α并转染人胰腺癌Patu8988细胞,MTT法观察HIF-1α基因沉默后胰腺癌Patu8988细胞体外增殖情况,以空白组及转染阴性对照干扰载体的阴性组为对照;流式细胞仪检测Patu8988/LV-RNAi-HIF-1α的细胞周期,以空白组为对照。结果:与空白组及阴性组细胞相比,Patu8988/LV-RNAi-HIF-1α的细胞增殖速度减慢,差异有统计学意义(F=58.48,P=0.000;F=55.91,P=0.000);Patu8988/LV-RNAi-HIF-1 G0/G1细胞比例较空白组高(t=10.87,P=0.001),S期、G2/M期细胞比例较空白组低(t=6.44,P=0.005,t=5.49,P=0.005),表现出G0/G1期阻滞。结论:HIF-1α基因表达沉默抑制人胰腺癌Patu8988细胞的DNA合成,将细胞阻滞于G0/G1期,使Patu8988细胞增殖能力降低,胰腺癌细胞体外生长被显著抑制。

GRP78调控上皮间质变抑制肾癌侵袭力的机制研究

目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)调控上皮间质变(EMT)抑制肾癌细胞侵袭力的机制。方法利用慢病毒干扰RNA沉默肾癌786-0细胞中GRP78的表达,采用Giemsa染色法检测细胞克隆能力,细胞划痕和Transwell实验检测细胞迁移能力和侵袭力。Western blot检测EMT和PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达。结果沉默GRP78可抑制肾癌细胞克隆形成,降低细胞侵袭力和迁移能力(P<0.05),E-cadherin蛋白表达上调,N-cadherin、 vimentin、p-PI3K、p-Akt蛋白表达下调(P<0.05)。结论沉默GRP78表达后可调控肾癌细胞PI3K/Akt信号通路,逆转EMT,从而抑制细胞侵袭力。

AFP的亚细胞定位及对肿瘤细胞生长的影响

目的观察甲胎蛋白（AFP）在不同肿瘤细胞中的亚细胞定位及对肿瘤细胞生长的影响。方法运用免疫荧光的方法观察内源性AFP在HeI。a细胞、QGY-7703细胞、MCF-7细胞中的亚细胞定位。将构建的表达AFP的质粒pcDNA3-AFP及AFP腺病毒siRNA干涉载体Adv—AFPsiRNA作用于QGY-7703细胞，MCF-7细胞，运用M1Tr，集落形成实验检测细胞增殖状况。结果免疫荧光显示，内源性的AFP在HeLa细胞、QGY-7703细胞、MCF-7细胞均只在细胞质中表达。pcDNA3-AFP使QGY-7703的细胞活性增加了2l％（P〈0．05）及集落形成能力增加了32％（P〈0．01），MCF-7实验组比对照组细胞活性降低了30％（P〈0．01）．克隆形成能力降低82％（P〈0．01）。Adv—AFPsiRNA使QGY-7703的细胞活性降低了22％（P〈0．05），平均克隆形成能力降低52％（P〈0．01），MCF-7细胞活性提高了24．5％（P〈0．05），克隆形成能力提高了89％（P〈O．01）。结论内源性的AFP只在细胞质中表达。AFP能促进QGY-7703细胞的增殖及克隆形成能力，而在MCF-7细胞中发挥相反的作用。腺病毒介导的内源性的AFP表达的下调能降低QGY-7703的增殖，却增加了MCF-7的细胞活性及克隆形成能力。