特异性微小RNA抑制剂对胃癌细胞增殖的影响

目的:探讨特异性微小RNA抑制剂对胃癌细胞增殖的影响。方法:设计并合成4种微小RNA(miR-17、miR-21、miR-106a和miR-421)的2-甲氧修饰的RNA寡核苷酸(微小RNA抑制剂),用脂质体分别转染到SGC-7901和MGC-803胃癌细胞,然后用实时定量逆转录-聚合酶链反应技术检测微小RNA的表达情况,最后用MTT方法检测胃癌细胞的增殖情况。结果:4种微小RNA抑制剂均有效抑制了SGC-7901和MGC-803细胞中相应微小RNA的表达;除miR-21抑制剂未见抑制胃癌细胞的增殖外,其它3种微小RNA抑制剂均以剂量依赖方式抑制胃癌细胞的增殖且对SGC-7901的效果优于MGC-803。结论:微小RNA的特异性抑制剂能有效抑制胃癌细胞的增殖,采用这种技术为研究胃癌的发病机制提供了新方法。

针对Fas的RNA抑制对缺血再灌注神经细胞的保护作用

目的探讨Fas-RNAi对缺血再灌注(I/R)损伤后神经细胞凋亡的保护作用。方法细胞随机分四组对照组、模型组、GFPsiRNA组、FassiRNA组。对照组用完全培养液培养,其他三组细胞制作体外(I/R)模型,GFPsiRNA组、FassiRNA于转染24h后造模,造模后6h进行Caspase-3、Fas表达检测,24h进行细胞凋亡相关检测。结果(1)Fas、Caspase-3阳性率模型组模型组的Fas阳性率(37.25±8.37)%、caspase-3阳性率(28.79±6.23)%明显高于对照组(7.21±3.28,8.01±2.31)%,差异有统计学意义(P<0.01)。GFPsiRNA组Fas阳性率(14.35±7.31)%、caspase-3阳性率(16.33±4.15)%明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.01)。(2)凋亡率模型组细胞(39.13±10.63)明显高于对照组(2.85±0.43),差异有显著性(P<0.01)。FassiRNA组(1.70±0.31)明显低于模型组(P<0.01)。结论针对Fas的siRNA能有效地抑制I/R损伤后神经细胞凋亡。对神经细胞I/R损伤有一定的保护作用。

CyclinE反义RNA抑制乳腺癌细胞增殖及p21^(waf1)转录水平

利用反义RNA抑制基因表达的技术 ,发现cyclinE基因在表达受到抑制后 ,乳腺癌细胞增殖速率和致瘤性明显下降 ,结果还表明cyclinE基因的抑制 ,可使p2 1waf1的转录水平上升 ,由此说明cyclinE的异常与乳腺癌的发生有着密切的关系 ,在细胞周期调控上 p2 1waf1的转录受到cyclinE表达水平的明显影响 .

卵巢癌组织中长链非编码RNA生长阻滞特异性抑制物5、微小RNA-205的表达及意义

目的分析长链非编码RNA(lncRNA)生长阻滞特异性抑制物5(GAS5)、微小RNA-205(miR-205)在卵巢癌组织中的表达及其临床意义。方法前瞻性收集2019年1月至2020年6月收治的初诊卵巢癌患者于术中取其癌组织和癌旁组织(距肿瘤边缘>2cm);采用实时荧光定量PCR法检测lncRNA GAS5、miR-205表达情况;问卷调查法统计患者临床病理资料;术后随访2年(截止时间至2022年6月),统计患者生存时间。比较癌组织和癌旁组织lncRNA GAS5、miR-205表达,并采用Pearson相关分析lncRNA GAS5与miR-205的关系;以癌组织lncRNA GAS5、miR-205表达的中位数将卵巢癌患者分为lncRNA GAS5与miR-205高表达组和低表达组,比较不同病理特征卵巢癌患者lncRNA GAS5、miR-205高表达、低表达情况;比较不同lncRNA GAS5、miR-205表达情况的卵巢癌患者生存时间。结果共82例卵巢癌患者纳入本次研究,其中2例失访,最终80例患者进入本次研究。卵巢癌组织lncRNA GAS5相对表达量小于癌旁正常组织,miR-205相对表达量大于癌旁正常组织(P<0.05);Pearson相关分析显示,卵巢癌组织中lncRNA GAS5相对表达量与miR-205相对表达量呈负相关(r=-0.606,P<0.001)。lncRNA GAS5高表达45例,低表达35例;miR-205高表达40例,低表达40例。Ⅲ~Ⅳ期、伴淋巴结转移的卵巢癌患者的卵巢组织中lncRNA GAS5低表达率高于Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移患者(P<0.05);Ⅲ~Ⅳ期、伴淋巴结转移的卵巢癌患者的卵巢组织中miR-205高表达率高于Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移患者(P<0.05)。lncRNA GAS5低表达量卵巢癌患者2年生存时间(21.50±0.89)个月,低于高表达患者(23.89±0.09)个月(χ2=5.150,P=0.023)。miR-205高表达量卵巢癌患者2年生存时间(21.71±0.79)个月,低于低表达患者(23.98±0.03)个月(χ2=6.337,P=0.012)。结论lncRNA GAS5、miR-205在卵巢癌组织表达存在一定的差异,其中lncRNA GAS5低表达,miR-205高表达,并影响卵巢癌患者的临床病理特征和预后。

膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1表达及临床意义

目的检测膀胱癌组织长链非编码核糖核酸(LncRNA)丝氨酸肽酶抑制剂Kunitz 1型反义核糖核酸1(SPINT1-AS1)表达并探讨其临床意义。方法选取安阳市第三人民医院泌尿外科2018年1月至2023年2月收治的328例行腹腔镜下根治术膀胱癌患者作为研究对象,RT-qPCR检测膀胱癌组织和切缘正常组织LncRNA SPINT1-AS1的表达。比较不同临床病理特征患者癌组织LncRNA SPINT1-AS1的表达;随访至2023年5月,分析膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1的表达与腹腔镜下根治术后复发的关系;Cox回归分析探讨影响膀胱癌患者腹腔镜下根治术后复发的危险因素。结果LncRNA SPINT1-AS1在膀胱癌组织的表达高于切缘正常组织(P<0.05);肌层浸润、TNM分期≥Ⅱb期、最大肿瘤直径≥3 cm、多发病灶、有淋巴结转移患者膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1的表达分别高于非肌层浸润性、TNM分期<Ⅱb期、最大肿瘤直径<3 cm、单发病灶、无淋巴结转移患者(P<0.05);随访期间患者腹腔镜下根治术后复发率为15.88%(47/296);肌层浸润(HR=1.692,95%CI:1.157~2.475)、TNM分期≥Ⅱb期(HR=1.784,95%CI:1.187~2.682)、多发病灶(HR=1.837,95%CI:1.200~2.810)、膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1表达(HR=1.557,95%CI:1.195~2.029)均为腹腔镜下根治术后复发的危险因素(P<0.05)。结论膀胱癌组织LncRNA SPINT1-AS1表达高于切缘正常组织,肌层浸润、TNM分期≥Ⅱb期、多发病灶及癌组织LncRNA SPINT1-AS1表达均为膀胱癌腹腔镜下根治术后复发的危险因素。

固相合成法合成葡萄球菌RNAⅢ抑制肽的鉴定

背景:葡萄球菌感染和生物被膜形成受群体感应机制调控。葡萄球菌RNAⅢ抑制肽可以干预葡萄球菌群体感应系统,阻断葡萄球菌细胞间的信号传导通路,进而抑制葡萄球菌的毒素分泌和生物被膜形成,防治葡萄球菌感染。目的:探讨葡萄球菌RNAⅢ抑制肽(RIP)的人工合成方法。设计、时间及地点:单一样本观察。于2006-08/11在北京宣武医院中心实验室完成。材料:Fmoc-AA、Pipredine、TFA、HMP购自美国MERCK公司;DCC、HOBT、DMAP购自美国ABI公司。方法:采用固相合成法合成RNAⅢ抑制肽,HPLC法纯化,进行质谱分析法、酸水解法、红外光谱分析法和内酰胺酶活性测定法检测。主要观察指标:①合成和纯化结果。②分子量测定结果。③组成成分分析结果。④氨基酸序列分析结果。⑤结构分析结果。⑥生物活性鉴定结果。结果:合成的RNAⅢ抑制肽纯度为97.42%,相对分子质量为914.37,与理论相对分子质量基本一致;与天然RNAⅢ抑制肽具有相同的氨基酸组分、氨基酸序列以及空间结构;生物活性检测证明合成RNAⅢ抑制肽具有和天然RNAⅢ抑制肽相同的功效,可以有效抑制细菌产生RNAⅢ。结论:采用固相合成法成功合成RNAⅢ抑制肽,鉴定分析证实合成的多肽和天然RNAⅢ抑制肽蛋白具有相同的结构和功能。

应用RNAⅢ抑制肽防治金葡菌感染的研究进展

金葡菌是一种主要致病菌,而多种耐药菌株的出现增加了临床治疗的难度。RNAⅢ抑制肽(RNAⅢ-inhibitingpeptide,RIP)由凝固酶阴性葡萄球菌产生。研究证实,RIP可通过阻断细菌之间的群体感应而减少金葡菌毒素的产生和生物被膜的形成,有效防治金葡菌感染。

HCVIRES特异性抑制性RNA二级结构模拟及自剪切转录载体构建

目的 :构建可保证HCVIRES特异性抑制性RNA(IRNA)序列完整性的转录载体。 方法 :应用计算机软件模拟IRNA二级结构 ;体外化学合成IRNA及其互补体的cDNA ,以AatⅡ和XbaⅠ双酶切后克隆入具自剪切作用的顺式核酶载体pGEMRz中 ;应用酶切方法、PCR和测序法对重组载体进行三重鉴定 ;最后对重组体进行体外转录。 结果 :计算机模拟发现HCVIRES特异性IRNA二级结构包括两个环、一个茎状结构和一个膨出 ,在其序列两端加3～ 5个碱基不会改变其二级结构 ,而缺失 3～ 5个碱基却会明显改变其结构。经三重鉴定证实 ,目的序列被正确地克隆入质粒pGEMRz,并经体外转录得到约 70个碱基大小的IRNA。 结论 :本研究构建转录载体pGRz IRNA可保证IRNA序列的完整性。

甘蔗线条花叶病毒RNA沉默抑制子的寄主互作蛋白鉴定

甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus,SCSMV)是引起甘蔗花叶病的一种主要病原。SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子,在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御中发挥关键作用,但其作用机制尚未清楚。与寄主蛋白互作是RNA沉默抑制子发挥其抑制作用的主要途径之一,因此鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要方法。为探究SCSMVP1抑制寄主RNA沉默的机制,本研究首先将SCSMVP1基因连接到质粒pGBKT7上构建诱饵质粒pGBKT7-P1,然后对pGBKT7-P1进行毒性和自激活检测,最后以pGBKT7-P1为诱饵,采用酵母双杂交技术从甘蔗cDNA文库中筛选与P1互作的寄主蛋白。结果显示,成功构建pGBKT7-P1诱饵质粒。将pGBKT7-P1诱饵质粒转入Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板及液体培养基中生长良好,表明pGBKT7-P1诱饵质粒对Y2HGold酵母菌株无毒性。含pGBKT7-P1诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上无菌落生长,表明pGBKT7-P1诱饵质粒无自激活活性。用pGBKT7-P1诱饵质粒对甘蔗cDNA文库进行筛选,经SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板筛选1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板筛选3次后,获得42个阳性酵母克隆,提取阳性酵母质粒并导入大肠杆菌中扩大培养,经测序及blastx比对分析,获得13个可能与SCSMV P1互作的寄主甘蔗蛋白,分别是生长素应答蛋白IAA1、IAA15,转录因子NAC、GATA4、OFP4,真核翻译起始因子eIF5A,分子伴侣DnaJ,辅分子伴侣SBA1,重金属相关异戊二烯化植物蛋白HIPP35,mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2,外膜孔蛋白OEP24,及2个未表征蛋白。基于这些蛋白的功能,推测P1可能通过与寄主蛋白互作来调控寄主防御反应相关基因的表达,和/或通过与寄主蛋白互作来影响寄主RNA沉默相关蛋白的合成、加工或转运,从而发挥其RNA沉默抑制子的功能。研究结果为后续深入解析P1抑制RNA沉默的作用机制奠定了重要基础。

聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽缓释微球的血液相容性(英文)

目的:评价聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽缓释微球的血液相容性。方法:①聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽微球制备:采用Fmoc法由C端至N端先合成粗品肽;采用反相液相色谱法对RNAⅢ抑制肽粗品进行纯化分析,按紫外吸收峰收集组分,冷冻干燥,得到RNAⅢ抑制肽纯品。再采用液相复乳法制备直径50～70μm的聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽微球。②浸提液制备:聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽微球粉末按1g/L在37℃无菌条件下用生理盐水浸提72h,制得浸提液原液;加入同体积的无菌生理盐水制得0.5g/L的浸提液。以溶血实验、凝血实验、血小板聚集实验,测定凝血酶原时间和活化部分凝血酶时间、观察对兔白细胞、红细胞和血小板的影响,对聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽微球血液相容性进行初步评价。结果:①浸提液原液和0.5g/L浸提液的溶血率分别为3.24%和2.67%,两者的溶血率均<5%,符合医用生物材料的溶血实验要求。②浸提液原液和0.5g/L浸提液对兔凝血时间,各时间点凝血酶原时间和活化部分凝血酶时间,白细胞、红细胞和血小板数量,对血小板聚集无明显影响。结论:聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽缓释微球具有良好的血液相容性。

RNAⅢ抑制肽/磷酸胆碱基细胞膜仿生药物涂层的血液相容性(英文)

背景:课题组在国内首次合成了葡萄球菌抑制剂RNAⅢ抑制肽,并制备了RNAⅢ抑制肽/磷酸胆碱基细胞膜仿生药物涂层。目的:评价RNAⅢ抑制肽/磷酸胆碱基细胞膜仿生药物涂层的血液相容性。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2005-10/2007-10在解放军总医院临床药理研究所及医学动物实验中心完成。材料:成年普通级健康新西兰大白兔30只,由解放军总医院动物实验中心提供。方法:将洁净的316L不锈钢片浸渍于5g/L的四元共聚物四氢呋喃和质量分数10%的RNAⅢ抑制肽混合溶液中,获得稳定的聚合物涂层,按1cm2/mL在37℃无菌条件下用生理盐水浸提72h,制得浸提液原液;加入同体积的无菌生理盐水制得50%浸提液。选择溶血实验、凝血实验、血小板聚集实验,测定凝血酶原时间和活化部分凝血酶时间、观察RNAⅢ抑制肽/磷酸胆碱基细胞膜仿生药物涂层对兔白细胞、红细胞和血小板的影响。主要观察指标:红细胞溶血率,凝血时间、凝血酶原时间、活化部分凝血酶时间,白细胞、红细胞和血小板数量,血小板聚集情况。结果:溶血实验结果显示浸提液原液和50%浓度浸提液的溶血率分别为3.08%和1.88%,两者的溶血率均<5%,符合医用生物材料的溶血实验要求。凝血实验结果表明浸提液原液和50%浓度浸提液对兔凝血时间无明显影响,对各时间点兔凝血酶原时间和活化部分凝血酶时间均无明显作用,对兔白细胞、红细胞和血小板数量无明显影响,对兔血小板聚集无明显影响。结论:实验数据表明,国内首次合成的RNAⅢ抑制肽/磷酸胆碱基细胞膜仿生药物涂层具有良好的血液相容性。

抑制RNA沉默现象的机理及其在生物医学领域内的应用

RNA沉默在机体防御病毒入侵和调控基因表达中发挥着重要的作用,目前已成为一种有效的工具应用于基因功能研究和疾病治疗等领域.RNA沉默现象普遍存在于真核细胞中,然而在宿主与病毒漫长的进化过程中,病毒已经演化出一系列逃逸或抑制RNA沉默作用的方法和途径,使RNA沉默效果显著降低,另一方面,哺乳动物体细胞自身也存在调节RNA沉默功能从而使生命活动的调节更加精细完善.为了使RNA沉默发挥它的潜在效应,人们设计出一系列的策略针对抑制RNA沉默效应以达到弱化抑制的目的.全面总结抑制RNA沉默机制及其应用,从而使人们充分认识到使用RNA沉默技术时应考虑到存在的不利因素.

RNA合成抑制剂对光敏感核不育水稻花粉育性的影响(简报)

用2－硫尿嘧啶（2－TU）和尿嘧啶（U）喷施一次和二次枝梗原基分化期及花粉母细胞形成期的水稻农垦58S叶面，前者使可育日长条件下的农垦58S花粉败育率显著增加。此种作用可因U的处理而解除。但对照品种农垦58则无类似的变化：

马铃薯卷叶病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其与AGO蛋白的相互作用

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)P0是由开放阅读框1(ORF1)所编码,利用农杆菌介导的瞬时表达技术渗透注射转绿色荧光蛋白(GFP)基因的16c烟草叶片发现PLRV-P0能够抑制由GFP mRNA引起的基因沉默,结果表明PLRV-P0是马铃薯卷叶病毒编码的一个基因沉默抑制因子。通过序列分析发现PLRV-P0基因序列中含有两个重复的WG基序,我们将PLRV-P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸(W)点突变为丙氨酸(A)(命名为P0WA),构建植物表达载体pCAMBIA1300-CE-P0,pCAMBIA1300-CE-P0WA,农杆菌渗透注射本氏(Nicotiana benthamiana)烟草叶片,通过荧光显微镜观察发现PLRV-P0和AGO共同注射后有绿色荧光出现而PLRV-P0WA和AGO共同注射后则没有绿色荧光出现。研究结果初步表明,PLRV-P0能够和AGO蛋白发生相互作用,重复的WG基序是其与AGO蛋白相互作用的关键氨基酸。

应用RNAⅢ抑制肽(RIP)抑制葡萄球菌毒素产生的实验研究

通过体外实验研究RNAⅢ抑制肽(RIP)抑制葡萄球菌产生肠毒素和溶血素的效果。将200μL浓度为2.5%的二甲基亚砜(DMSO,对照组)和1mg/mL的R IP分别加入到200μL浓度1×108/mL的TECRA菌液,培养3h后,定量检测两组菌液中SEB的含量。将分别含有0.75% DMSO、100μg左氧氟沙星、40μg RIP和40μg RIP+100μg左氧氟沙星的菌液与50μL含有4%家兔红细胞的PBS液共同培养1h后,用酶标仪检测各组上清液中血红蛋白的含量。在ELLISA反应的5、10、30min三个时间点,RIP组菌液中SEB含量均明显低于DMSO组,两组数据具有极显著性差异(p<0.001);RIP组和左氧组菌液中的溶血素的含量明显低于空白组(p<0.05,p<0.01),联合用药组菌液中的溶血素含量明显低于空白组和RIP组,与左氧组相比差别不显著。说明RIP可以有效抑制金葡菌肠毒素和溶血素的产生,与抗生素联用有一定的协同功效。

端粒酶RNA特异性核酶抑制卵巢癌细胞端粒酶的活性

目的 研究端粒酶 RNA特异性核酶对卵巢癌细胞活性的抑制作用 .方法 用脂质体法将构建好的核酶逆转录病毒载体转染至卵巢癌 HO- 8910细胞 ,以 MTT比色法检测细胞的生长 ,应用流式细胞仪分析细胞周期细胞 ,观察细胞的增殖情况 ,同时扩增端粒重复序列 ,结合杂交分析 ,检测细胞的端粒酶活性 .结果 MTT检测发现转染核酶后的细胞生长的潜伏期延长 (48→ 72 h) ,对数生长期减缓 (4→ 5 d) ,流式细胞仪结果显示其 G1期比例明显增高 (70 .0 %→ 80 .5 % ,P<0 .0 1) ,S期细胞比例明显降低 (19. 0 %→ 13. 7% ,P<0 .0 1) ,细胞增殖下降 ,细胞的端粒酶活性亦降低 .结论 端粒酶 RNA特异性核酶能抑制卵巢癌细胞端粒酶活性 ,抑制细胞增殖 .

IRES特异性抑制性RNA对HCV IRES介导的蛋白翻译的体外抑制作用

目的 研究IRES特异性抑制性RNA(IRNA)对HCVIRES介导蛋白翻译的体外抑制作用。方法 体外化学合成IRNA及其互补体RNA(cIRNA)的cDNA ,以AatⅡ和XbaⅠ双酶切后克隆入具有自剪切作用的顺式核酶载体pGEMRz中 ;最后对重组体的体外转录体在体外无细胞反应体系中的抑制活性进行了初步探讨。结果 IRNA和cIRNA在体外无细胞翻译体系中对HCVIRES介导的蛋白翻译具有相似的抑制活性 ,最大抑制率达 90 %左右。结论 IRNA及cIRNA在体外对HCVIRES介导的蛋白翻译均具有抑制活性。

丙型肝炎病毒NS5B RNA聚合酶抑制剂研究进展

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV）是引起慢性肝炎并进而发展为肝硬化和肝细胞癌的主要病原体之一。目前,临床上采用α-干扰素（IFN-α）和利巴韦林（RBV）联合用药治疗丙型肝炎,但有效率仅为40%~50%。寻找HCV特定靶向抗病毒治疗药物是抗HCV研究的重要方向,相应靶点包括NS2和NS3蛋白酶,NS4A、NS4B、NS5A和NS5B,其中以NS5B RNA依赖性RNA聚合酶（NS5B RdRp）为靶标的抗HCV药物研究近年来颇受关注。本文在介绍NS5B及NS5B RdRp结构和功能的基础上,总结归纳以NS5B RdRp为靶点的HCV特定靶向抗病毒治疗药物研究的主要策略,以及近年来相关NS5BRdRp抑制剂的研究进展。

RNAⅢ抑制肽体外抑制葡萄球菌胞外黏质物产生的作用分析

目的探究RNAⅢ抑制肽(RIP)体外抑制葡萄球菌胞外黏质物产生的作用。方法分别将表皮葡萄球菌ATCC35984、表皮葡萄球菌ATCC10228加入2支试管,做生物被膜形成实验,观察不同菌株的生物被膜形成情况;设不同因素交叉成组,表皮葡萄球菌ATCC35984设为因素A1,表皮葡萄球菌ATCC12228设为因素A2;正常空白培养基设为因素B1,加入RIP的培养基设为因素B2,两两组合分别A1B1组、A2B1组、A1B2组和A2B2组,将各组试管封口,在37℃、170 rm条件下摇晃培养,用酶标仪在550 nm波长下检测不同时间的光密度(OD)值。结果胞外黏质物观察结果显示,表皮葡萄球菌ATCC12228黏着能力较低,未形成明显的生物被膜,而表皮葡萄球菌ATCC35984则明显产生生物被膜并大量附着在试管壁上;A1B1组在24 h内产生大量的胞外黏质物,但A2B1组则未出现明显的胞外黏质物,但A1B2组与A1B1组比较,胞外黏质物产生明显减少,组间对比差异有统计学意义(P<0.05)。结论不同表皮葡萄球菌产生胞外黏质物的能力有所差异,表皮葡萄球菌ATCC35984能够在6～24 h内产生大量的胞外黏质物,RIP能够有效抑制胞外黏质物的产生。

甘蔗黄叶病毒P0蛋白分子特性及其抑制RNA沉默活性

【目的】甘蔗黄叶病(yellow leaf,YL)是一种主要的甘蔗病毒病害,在全球多数甘蔗种植国家或地区普遍发生,已对甘蔗生产造成严重威胁。其病原为甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus,SCYLV),属于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员。研究SCYLV编码的沉默抑制子P0蛋白的分子特征、保守结构域及其在自然寄主甘蔗上抑制RNA沉默的功能,为下一步从RNA沉默水平解析SCYLV致病分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR克隆技术获得SCYLV中国分离物CHN-FJ4编码的RNA沉默抑制子基因P0及其两个缺失突变体P0Δ2-15(N端缺失15个氨基酸)和P0Δ155-256(C端缺失102个氨基酸),然后定向克隆到单子叶植物表达载体p Ubi-nos(空载体)上,获得重组质粒。利用甘蔗嫩叶组织瞬时表达系统鉴定病毒RNA沉默抑制子技术,结合Image J软件定量分析P0及其两个缺失突变体抑制外源基因EYFP瞬时表达活性的变化。番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus,TBSV)编码的P19作为沉默抑制子阳性对照。【结果】P0核苷酸序列的遗传进化分析结果显示,所获得的SCYLV病毒分离物CHN-FJ4为BRA基因型,与其他BRA基因型分离物氨基酸序列一致性为96.1%—98.4%。利用MEME在线软件预测P0蛋白的保守结构域,结果表明P0蛋白含有3个显著的保守区。分别位于第1—60、76—125和161—210氨基酸残基。通过Datamonkey在线服务器(http://www.datamonkey.org)提供的5种运算方法分析P0蛋白氨基酸位点的选择压力,结果显示P0蛋白具有8个氨基酸正向选择位点。将含有P0及其缺失突变体的重组质粒连同含EYFP报告基因的p TEM12质粒采用基因枪轰击法分别导入甘蔗嫩叶组织细胞,轰击后48—120 h,P0和P19逐渐地提高EYFP荧光表达点数和荧光表达水平;在120 h,与p Ubi-nos空载体(不含沉默抑制子)对照组相比,P0和P19均显著地提高甘蔗嫩叶组织EYFP荧光表达点数和荧光表达水平,分别达1.6倍和4.0倍以上。P0与P19抑制RNA沉默活性水平没有显著差异(P>0.05)。P0蛋白N端缺失15个氨基酸(P0Δ2-15)和C端缺失102个氨基酸(P0Δ155-256)均丧失了沉默抑制子的功能,荧光表达与不含沉默抑制子对照组相当。【结论】在甘蔗嫩叶组织EYFP瞬时表达体系上,P0能够显著地提高外源基因EYFP表达水平。P0蛋白N端15个氨基酸和C端102个氨基酸含有显著的保守区域,是P0发挥沉默抑制子功能所必需的。