肝癌组织及细胞系总RNA抽提逆转及基因克隆方法的改进与比较

该文建立了高效肝组织及细胞总RNA抽提、反转录以进行基因克隆和实时定量PCR(q-RT-PCR)的方法。比较了2种反转录酶(M-MLV和SuperScriptII)、2种cDNA合成引物(OligodT和random 6 primer)对总RNA反转录效率的影响,与4种DNA聚合酶(Taq聚合酶、Pfu聚合酶、LAtaq聚合酶、Prime Star聚合酶)进行长片段基因克隆的能力及效率;同时,该研究比较了不同质量总RNA对有效进行q-RT-PCR与长片段分子克隆的影响。新建立的RNA提取方法使得RNA完整性和均一性提高。RNA的完整性及均一性对长片段cDNA的克隆至关重要。部分降解的组织RNA及细胞RNA仅适合于q-RT-PCR检测mRNA的表达水平,而不适合于cDNA的克隆。

从福尔马林固定-石蜡包埋样本中抽提RNA的方法与可行性

目的探讨从福尔马林固定-石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)组织中抽提RNA的可行性和有效性。方法收集胃癌和癌旁FFPE样本各41例,10μm厚连续切片3张,采用蛋白酶消化盐析法抽提纯化RNA,检测提取RNA的产量和质量并分析其应用价值。结果 41对胃癌和癌旁FFPE样本中抽提的RNA纯度为1.578～3.175,平均2.022±0.190,其中癌组织为1.578～3.175,平均2.033±0.240,癌旁组织为1.726～2.329,平均2.011±0.123;RNA浓度为(26.8～1 087)ng/μl,平均(267.062±210.435)ng/μl,其中癌组织为(50.5～1 087)ng/μl,平均(336.5±228.927)ng/μl,癌旁组织为(26.8～820)ng/μl,平均(197.62±165.47)ng/μl;琼脂糖凝胶电泳条带弥散分布,约300 bp;胃癌和癌旁RNA的纯度比较P=0.564,尚不能认为胃癌和癌旁FFPE样本中抽提的RNA纯度有不同,但浓度比较P=0.001,可认为胃癌和癌旁FFPE样本中抽提的RNA浓度有所不同,癌组织中较高。结论从FFPE样本中抽提的RNA在不可避免地出现降解的情况下仍然具有很高的纯度和合适的浓度;在确保扩增产物大小处于一定范围内的前提下从FFPE样本中抽提的RNA具有可以满足下游应用的纯度、浓度和完整性;建立从FFPE样本中抽提RNA的方法在各种影响因素符合要求后完全可行。

魔芋叶片中4种总RNA提取方法的比较

本研究分别利用TRIzol法、异硫氰酸胍法、改良的CTAB法及试剂盒这4种方法提取魔芋叶片的总RNA,并用紫外光谱和琼脂糖凝胶电泳对各个提取效果进行鉴定。反复试验的结果表明:TRIzol法难以提取魔芋叶片总RNA,异硫氰酸胍法提取的总RNA浓度低、杂质较多且有部分降解,这两种方法不适宜用于魔芋叶片总RNA提取;试剂盒方法提取的总RNA产率和纯度较高,但稳定性差、成功率低且成本较高;改良的CTAB法利用PVP和β-巯基乙醇去除酚类物质,水饱和酚-氯仿去除蛋白质,醋酸钾去除多糖,该方法提取得到的总RNA的纯度较高,OD260/OD280值为1.893,而且效果稳定,有良好的可重复性。因此,我们认为改良的CTAB法是一种简便、快速且经济的提取魔芋叶片总RNA的方法。

福尔马林固定石蜡包埋样本提取的RNA质量分析及其临床应用

目的评估国内福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE)样本抽提的RNA质量及其临床应用。方法收集FFPE样本994例,采用RNA分离纯化试剂盒提取纯化RNA,检测提取RNA的质量,并检测RNA样本中的EML4-ALK和ROS1基因突变状态,同时采用Sanger测序法验证使用RNA样本进行基因突变检测的准确性。结果从994例FFPE样本中分离提取的RNA的A260/A280和A260/A230均能达到1.8以上,平均浓度为204.23ng/μl,992例样本均能进行有效扩增。RNA样本的EML4-ALK和ROS1基因融合检测结果与Sanger测序结果一致。结论从FFPE样本中分离得到的RNA质量良好,适用于后续的基因突变检测,可为肿瘤靶向药物的选择提供科学、可靠的依据。

阔叶薰衣草叶片总RNA两种提取法的比较

分别采用TRIzol法和改良的CTAB法提取阔叶薰衣草叶片的RNA,并用紫外光谱和琼脂糖凝胶电泳对其提取效果进行鉴定。实验结果表明:TRIzol法提取的总RNA浓度高,但杂质较多且有部分降解、稳定性差;改良的CTAB法提取得到的总RNA的纯度较高,OD260/OD280值为1.909,效果稳定,有良好的可重复性。因此,改良的CTAB法是一种较为简便、经济的提取阔叶薰衣草叶片总RNA的方法。

不同方法提取新疆红肉苹果RNA差异研究

使用生工柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒、Trnzol法以及改良CTAB 3种方法,提取红肉苹果克孜阿尔玛的果肉、果皮、花瓣、叶片中的总RNA,并对比这3种方法提取RNA的产量、质量以及完整性。结果表明,由Trnzol方法提取所获得的RNA纯度较低,有降解现象,且有DNA、蛋白质的污染,果肉和果皮RNA的产量也并不理想;而用改良CTAB法和生工试剂盒法提取的RNA较少降解,所得28 S rRNA和18 S rRNA条带较为清晰,花瓣和叶片的OD260/280均在2以上,生工试剂盒法提取的RNA产量高,OD260/280和OD260/230比值均在1.8~2.5,条带的完整性好。3种方法比较而言,改良CTAB法和Tr Nzol法提取的RNA条带的清晰度、产量及质量都低于生工试剂盒法。

Synechocystis sp.strain PCC 6803定量PCR模板制备方法的改进

以Synechocystis sp.strain PCC 6803为实验菌株,设计改良制备定量PCR模板的方法;同时,对Synechocystis sp.strain PCC 6803总RNA的Trizol抽提法进行优化。结果显示,利用改良方法抽提得到的RNA结构更完整;同时,利用改良方法制备的模板可以用于后续定量PCR实验;其中,只有高表达量基因适用于半定量PCR,低表达量基因则需要实时荧光定量PCR检测。

皖贝母总RNA提取方法的比较研究

目的:针对皖贝母鳞茎富含多糖、酚类和其他多种次生代谢产物的特点,筛选一种简单高效的皖贝母总RNA提取方法。方法:用异硫氰酸胍法、皂土法、改进的SDS/酚法、RNAiso plus 4种方法分别提取皖贝母鳞茎总RNA,并对提取的RNA进行电泳及RT-PCR技术检测与分析。结果:皂土法提取的总RNA条带清晰无弥散,完整性好无明显DNA和其他杂质污染,适用于RT-PCR试验。结论:皂土提取法是一种适合于皖贝母总RNA抽提的简单高效的方法。