核酸内切酶制备的siRNA抑制HBV基因表达和复制

目的:研究核酸内切酶制备的siRNA(esiRNA)对HBV基因表达和复制的抑制作用。方法:利用分子生物学方法制备了分别针对HBV S基因和C基因的esiRNA(SesiRNA、CesiRNA),与HBV复制型质粒pHY106+wta共转染HepG2细胞,化学发光微粒免疫分析方法检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg,Northern和Southern印迹检测HBV的mRNA和病毒复制中间体水平。结果:EsiRNA特异抑制HBV基因表达和复制,呈剂量依赖性。在工作浓度为100 nM时,SesiRNA和CesiRNA分别抑制细胞培养上清中75.96%和68.09%的HBsAg,79.69%和78.40%的HBeAg,降低细胞内60%和58%的HBV mRNA,抑制90%和87%的HBV病毒复制中间体。而且SeciR-NA对于多种HBsAg自然突变体的表达均有抑制作用。结论:EsiRNA可以有效抑制HBV的基因表达和病毒复制,尤其对于HBV的不同基因型/亚型和准种可以发挥广谱效应。

CAR－bacillus菌亚单位核糖核酸RNA限制性内切酶图谱的研究

利用生物体中编码亚单位核糖核酸ＲＮＡ（ｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ，ＳＳＵｒＲＮＡ）的ＤＮＡ序列为引物，经ＰＣＲ法扩增到ＣＡＲ－ｂａｃｉｌｌｕｓ的大约１．５ｋｂ的ＳＳＵｒＲＮＡ序列，采用ＨｉｎｄⅡ、ＨｉｎｆⅠ、ＥｃｏＴ１４，ＨａｅⅢ和ｘｈｏⅠ等５种限制性内切酶进行酶切电泳分析，同时比较了来源于小鼠的ＣＢＭ株及来源于大鼠的ＣＢＲ株，未发现两者有差异。

OMEGA内切酶IsrB与ωRNA和靶DNA复合物的结构

RNA引导系统,如CRISPR-Cas,将可编程底物识别与酶功能相结合,这种结合有利于开发强大的分子技术。这些系统的结构研究阐明了RNA和蛋白质如何共同识别和切割它们的底物,为进一步的技术发展提供合理的工程设计指导。本课题组最近的工作鉴定了一类新的RNA引导系统,称为OMEGA,其中包括IscB,它可能为Cas9的祖先,以及内切酶IsrB,它为缺乏HNH核酸酶结构域的IscB同源物。

降低lncRNA-RMRP表达抑制人肺癌细胞系A549的增殖和侵袭

目的探讨抑制线粒体RNA加工核糖核酸内切酶RNA组分(RMRP)表达对人肺癌细胞系A549增殖和侵袭的影响;检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者全血和组织中RMRP表达,比较在不同临床指标表达差异性,以期为NSCLC机制研究提供参考资料。方法收集2016年3月至2021年3年在焦作市人民医院行手术治疗的NSCLC患者122例,同期,在体检中心选取健康者50名作为对照组。RT-qPCR检测全血和组织中RMRP mRNA水平。培养A549细胞分为si-RMRP组、siRNA-NC组和空白组(blank组)。RT-qPCR、CCK-8法和Transwell小室法分别检测细胞中RMRP表达、增殖活性和侵袭细胞数。结果NSCLC患者全血中RMRP相对表达量显著高于对照组(P<0.001);NSCLC组织中RMRP相对表达量高于癌旁组织(P<0.001);低分化、淋巴结转移和TNM分期Ⅲ的NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量较高分化、未发生淋巴结转化和TNM分期Ⅰ~Ⅱ明显升高(P<0.05);Si-RMRP组细胞中RMRP相对表达量低于空白组(blank组)和siRNA-NC组(P<0.001);相比与blank组和siRNA-NC组,24、48、72和96 h时si-RMRP组细胞吸光度(A)值均降低(P<0.05);Si-RMRP组细胞侵袭数低于blank组和siRNA-NC组(P<0.001)。结论NSCLC患者全血和组织中RMRP相对表达量升高,下调A549细胞中RMRP基因表达可抑制细胞增殖,减少细胞侵袭。

RNase A酶切分析方法——一种检测点突变的新方法

DNA是生命遗传的物质基础,自1927年美国科学家Muller发现了第一个环境中的诱变因子——X线以来,迄今已发现千百种物理的、化学的诱变因子可以引起核酸突变。恶性癌变以及遗传性疾病大多也由突变所引起。因此,准确地分析突变类型及突变部位在致癌、致畸、致突的研究中至关重要。分子生物学技术的发展使我们能直接分析核酸序列上的变化,也为突变的检测与定位、遗传性疾病的诊断及发病机制的分析。

澳大利亚科学家建构RNA型酶

几乎所有的酶都是蛋白质。然而,目前看来它们中有些属于核苷酸,也可催化化学反应。人们注意到一些植物病毒用其 RNA 催化其本身裂解为较小片段。澳大利亚联邦科学与工业研究组织的 Jim Haseloff 和 Wayne Gerlach 设计和建构了在特定部位能分裂其它RNA 分子的核糖酶(ribozymes)。

APE1 siRNA表达载体的构建及其对骨肉瘤细胞APE1表达的抑制作用

目的 构建DNA损伤修复基因脱嘌呤／脱嘧啶核酸内切酶APE1 siRNA表达载体pSilence APE1，观察其对骨肉瘤细胞HOS和9901APE1蛋白表达的抑制作用。方法 设计合成APE1 siRNA cDNA序列与线性化pSilence2．0．U6质粒连接后构建APE1 siRNA表达载体pSilence APE1，经酶切鉴定和测序确认。应用免疫组化检测骨肉瘤细胞APE1蛋白的表达，同时应用免疫印迹检测其对APE1基因的敲低作用的量效和时效关系。结果 通过双酶切鉴定和测序分析，成功构建了APE1 siRNA表达载体。免疫组化和免疫印迹证实pSilence APE1对骨肉瘤细胞APE1基因具有特异性“敲低”作用，其抑制APE1基因表达效率为72%-95％，而且其抑制作用以3.0μg pSilence APE1转染第3天最为显著。结论 成功构建了APE1 siRNA表达载体pSilence APE1 ，并且该载体能有效地敲低骨肉瘤细胞APE1基因表达。

双功能基因APE1调控人骨肉瘤HOS细胞miRNAs的初步研究

目的比较APE1-konckdown骨肉瘤HOS细胞miRNAs表达谱的差异,初步探讨APE1可能调控的miRNAs及其涉及的功能通路。方法利用Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒敲低骨肉瘤HOS细胞中APE1的表达,采用miRNA芯片检测敲低组和对照组miRNAs表达谱的改变,qRT-PCR验证,并利用生物信息学分析差异miRNAs涉及的功能。结果miRNAs芯片结果显示,APE1敲低组中有32个miRNAs表达显著改变;qRT-PCR验证有13个miRNAs的改变与芯片结果趋势一致,其中7个上调,6个下调;基因聚类分析发现,13个显著变化的miRNAs涉及的靶基因的功能主要定位在细胞内,与蛋白、DNA结合以及转录功能有关,参与调控发育和细胞代谢等生物过程;Pathway分析显示其靶基因主要涉及粘附连接、轴突导向、ECM-受体相互作用、肿瘤通路,以及TGF-β、MAPK、ErbB、Wnt、mTOR及p53等关键的细胞信号通路。结论 APE1能直接影响骨肉瘤细胞miRNAs的表达;生物信息学分析表明APE1通过调控miRNAs可能影响下游靶基因的表达,参与肿瘤发生、细胞生存、增殖、粘附等生物学过程和多个信号通路,与骨肉瘤的发生、发展、侵袭转移密切相关。

植物RNA沉默的分子机制研究进展

RNA沉默(RNA silencing)是真核生物中的一种抵抗外源遗传因子(病毒、转座子或转基因)及调控基因表达的防御机制。参与植物RNA沉默的酶及蛋白质主要包括6种RNA依赖的RNA聚合酶、4种Dicer-like(DCL)核酸内切酶和10种Argonautes蛋白。植物中4条RNA沉默途径分别由微小RNA (miRNAs)和3种小干扰RNA(siRNAs)介导,包括反式作用siRNAs(ta-siRNAs)、天然反义siRNAs(nat- siRNAs)和异染色质siRNAs(hc-siRNAs)。在植物RNA沉默的系统性传播中,由DCL4或DCL2将dsRNAs裁剪为次级siRNAs,以放大RNA沉默信号和增强沉默效应。

siRNA表达载体对hTERT基因的效应评价

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰表达载体,探讨其对人乳腺癌MCF-7细胞生长及其hTERT基因表达的影响。方法:设计针对hTERT基因的干扰靶序列并构建重组siRNA表达载体pGenesil-hTERT。酶切测序鉴定后,脂质体转染MCF-7细胞,应用RT-PCR和Weston Blot法检测hTERT基因的表达情况,应用流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果:酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功,且转染MCF-7细胞后,hTERT mRNA和蛋白质表达水平显著抑制,细胞凋亡率较对照组明显升高(P<0.01)。结论:以DNA质粒为载体的siRNA能有效抑制hTERT基因的表达,进而抑制乳腺癌MCF-7细胞生长、促进细胞凋亡。

糖核酸内切酶Ⅲ制备的小干扰RNA(esiRNA)文库对乙肝病毒感染的基因治疗

目的建立HBV esiRNA文库并研究该文库对HepG2.215细胞内HBV表面抗原(HBsAg)表达的抑制效应。方法制备并纯化大肠杆菌核糖核酸内切酶ⅢGST融合蛋白(GST-RNaseⅢ);设计并制备HBV基因组序列1～540核苷酸(HBV-1)的双向转录模板(T7-HBV-1);体外转录该模板获得双链RNA(dsRNA),即T7-HBV-1 dsR-NA;用GST-RNaseⅢ酶切T7-HBV-1 dsRNA制备HBV小干扰RNA文库(esiRNA library);应用50、100和150 nmol/L纯化的esiRNA文库转染携带HBV病毒的HepG2.215细胞并应用实时定量PCR及ELISA检测HBsAg的转录和蛋白翻译表达水平。结果成功制备并纯化有活性的GST-RNaseⅢ;用该酶将体外制备的dsRNA酶切并纯化得到esiRNA文库;应用该文库成功抑制了HepG2.215细胞内的HBV HBsAg的表达,并且其抑制作用随esiRNA浓度升高而增强。结论用生物学方法制备的HBV esiRNA文库可以成功抑制HBV HBsAg在细胞内的表达,为预防治疗HBV感染开辟了新的思路。

RNA干扰及其应用综述

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核生物中普遍存在的一种自然现象,是由双链RNA (double-stranded RNA,dsRNA)启动的序列特异的转录后基因沉默过程。在这一过程中,双链RNA被核酸内切酶切割成小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),小干扰RNA与相关的蛋白质结合成RNA 诱导沉默复合体(siRNA-induced silencing complex,RISC),RISC识别并降解靶mRNA。现在认为RNA 干扰是真核生物共有的抗病毒、抗转座子、抗转基因和抗异常RNA的基因组免疫系统。随着RNA干扰的研究,产生了一种新的技术——RNA干扰技术,并得到了广泛的应用。

RNA介导染色质水平的基因沉默

近年来,一种 RNA 水平的基因沉默引起了研究者的高度关注,这便是由双链 RNA 表达引起的 RNA 干扰。双链RNA 在体内经过扩增和切割变成单链小分子 RNA,结合到相应序列的 mRNA 转录本并引起 mRNA 被核酸内切酶识别并切割,从而导致这些 mRNA 降解而无法翻译出产物,从 mRNA 水平关闭基因表达。这个过程大致可以分为双链 RNA 的形成、小 RNA的形成和信号放大以及异染色质的形成三个步骤。

病毒核酸酶抑制宿主蛋白表达的研究进展

核酸酶是负责剪切多聚核苷酸链的磷酸二酯键的酶。核酸外切酶负责催化水解mRNA 5'或3'端磷酸二酯移除核苷酸;核酸内切酶从mRNA分子内部剪切磷酸二酯键;两者均介导mRNA降解。已有研究发现病毒通过编码核酸酶抑制宿主蛋白的表达:例如冠状病毒编码的nsp14具有3'-5'核酸外切酶(ExoN)活性,不仅在病毒基因组复制过程中发挥调节校对作用,还能抑制宿主蛋白表达;单纯疱疹病毒编码的Vhs、甲型流感病毒编码的PA-X、卡波西肉瘤疱疹病毒编码的SOX和冠状病毒编码的nsp15都具有核酸内切酶活性,能够降解RNA,帮助病毒劫持宿主蛋白翻译系统,优先翻译病毒蛋白。本文将重点介绍不同病毒编码的核酸酶抑制宿主蛋白的表达机制,使病毒的基因表达处于竞争优势。

皮膜种植系列之四DNA与酶

有一族很有意思的酶与DNA自己结合，以便指导遗传信息按部就班地复制以及确保不出差错。例如，核酸内切酶按特定的序列将DNA切开，而核酸外切酶则把单股DNA分子链两端切掉。DNA旋转酶为了能使遗传信息开始转移而催化双螺分子链的“拉开”和展开。然后由一族称为DNA聚合酶的酶来指导DNA新分子链的组合。

CRISPR/Cas9系统介导基因组编辑的研究进展

由规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)以及CRISPR相关蛋白9(CRISPR-associated protein 9,Cas9),即CRISPR/Cas9系统改造的第3代人工核酸内切酶,与锌指核酸内切酶(Zinc finger endonuclease,ZFN)以及类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)相比,具有构建方法简单快捷、突变效率高、成本低廉、适用范围广等许多优点,已成为一种热门的基因组编辑工具。该技术已成功应用于细菌、人类细胞、斑马鱼、小鼠、猪、食蟹猴以及多种植物的基因组精确修饰,是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一。但是CRISPR/Cas9系统目前也面临着脱靶率高、特异性差的难题,这无疑是CRISPR/Cas9系统应用于基础研究和临床治疗的最大的挑战。本文从CRISPR/Cas9系统的发现、分类、作用机制以及CRISPR/Cas9基因编辑系统在基因定点修饰方面的研究进展进行介绍,希望能够为畜牧领域的科研工作者提供参考。

《自然》：PA蛋白具有核酸内切酶功能

继2008年8月在《自然》杂志上发表禽流感病毒RNA论文之后，中国科学院生物物理研究所研究员刘迎芳领导的课题组和饶子和院士领导的南开大学、清华大学和生物物理所联合实验室，在前期工作的基础上．进一步解析了该RNA聚合酶PA亚基剩余的氨基端（PAN）的高分辨率晶体结构。从而基本完成了对流感病毒聚合酶PA亚基的结构生物学研究工作。他们的研究结果清晰地揭示了PA蛋白具有核酸内切酶功能。这一结果推翻了以往报道的PBl亚基在聚合酶复合体中行使此项功能的推论。2月4日，《自然》再次在线发表了他们的最新合作研究成果。并专门配发了新闻，介绍了这一重要研究成果。

pSilence APE1抑制骨肉瘤生长的实验研究

目的观察脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)siRNA表达载体pSilenceAPE1对骨肉瘤裸鼠移植瘤生长的抑制作用,探讨APE1与骨肉瘤发生、发展的关系。方法人骨肉瘤细胞9901荷瘤裸鼠20只随机分为2组:脂质体对照组(n=10)和pSilenceAPE1治疗组(n=10)。在实验第12天处死动物,计算抑瘤率。免疫组化SP法检测骨肉瘤细胞APE1蛋白的表达和肿瘤微血管密度、增殖指数变化;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡的变化。结果pSilenceAPE1处理组肿瘤细胞APE1表达显著降低,抑瘤率为38.23%,肿瘤微血管密度和增殖指数明显低于对照组,而肿瘤凋亡显著增加。结论靶向敲低APE1表达能显著抑制骨肉瘤的生长。

双功能基因APE1敲低后人体骨肉瘤细胞基因表达谱变化的研究

目的探索APE1敲低后骨肉瘤细胞恶性表型受抑的可能机制,以及APE1相互作用的可能分子。方法应用免疫印迹和AP核酸内切酶活性检测确证合成APE1 siRNA对人体骨肉瘤细胞HOS APE1基因的敲低作用;应用GEAr-rayTMQ系列cDNA微阵列研究HOS细胞APE1敲低后基因表达谱的改变。结果APE1 siRNA对HOS细胞APE1基因具有特异性“敲低”作用,其抑制效率为91.5%。APE1抑制对cDNA微阵列六族途径均有影响,其中对细胞周期族基因影响较少;96个基因中有42个基因有明显变化(43.8%),其中CDK4、FGFR2、KAI1和NCAM1表达上升,其余38个基因表达均呈下降。结论APE1的敲低对骨肉瘤细胞的细胞周期及DNA损伤、细胞凋亡、信号转导、细胞黏附、血管生成、肿瘤转移途径基因均有影响。